SN/T 2428-2010 犬瘟热诊断方法 SN/T2428-2010 标准下载解压密码：www.bzxz.net

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T2428—2010
犬瘟热诊断方法
Diagnostictechniquesforcaninedistemper2010-01-10发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
数码防伤
2010-07-16实施
本标准的附录C为规范性附录，附录A、附录B为资料性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。SN/T2428—2010
本标准起草单位：中华人民共和国黑龙江出人境检验检疫局、中华人民共和国山东出人境检验检疫局。
本标准主要起草人：张子群、谢晓峰、岳志芹、何浩、徐义刚、李维刚、由轩、金宁。本标准系首次发布的出人境检验检疫行业标准。I
1范围
犬瘟热诊断方法
SN/T2428—2010
本标准规定了犬瘟热(CanineDistemper，CD)的检疫技术规范，包括犬瘟热病毒(CDV)的分离与鉴定、间接免疫荧光技术、免疫酶试验、免疫酶组织化学试验。本标准适用于犬瘟热的检疫。
2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3概述
犬瘟热(CD)相关资料参见附录A。CD的诊断可以通过流行病学、临床症状、病理剖检变化对犬瘟热作出初步诊断，对CD作出确诊可进行病毒分离鉴定、间接免疫荧光技术、免疫酶试验、免疫酶组织化学试验等实验室诊断。4临床诊断
根据临床症状和病理学检查，参见附录B，可做初步诊断依据。5实验室诊断技术
5.1病毒分离与鉴定
5.1.1材料准备
5.1.1.1实验材料和试剂
5.1.1.1.1Vero细胞（非洲绿猴肾细胞）、MDCK细胞（犬肾传代细胞）。5.1.1.1.2溶液配制：包括细胞培养液、细胞维持液、细胞分散液、PBS等。配方及配置方法见附录C。实验用水应符合GB/T6682要求。5.1.1.2设备和器材
5.1.1.2.1
5.1.1.2.2
5.1.1.2.3
5. 1.1.2. 4
5.1.1.2.5
5.1.1.2.6
5.1.1.2.7
5.1.1.2.8
5.1.1.2.9
细胞培养瓶、细胞培养板。
吸管。
二氧化碳培养箱。
37℃恒温水浴箱。
普通冰箱和低温冰箱。
离心机及离心管。
研磨器械。
普通光学显微镜和倒置显微镜。微量加样器，容量5μL～50μ，50μL～200μL。1
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00.45μm微孔滤器。
5.1.1.2.10
5.1.1.3组织悬液的制备
CDV存在于病犬心脏、肺脏、脾脏、胸腺、淋巴结等组织器官中。无菌采集这些器官用加双抗（含青霉素2000IU/mL、链霉素2000μg/mL)的细胞维持液，制成20%组织悬液，4℃浸泡4h，然后反复冻融3次，3000r/min离心30min，取上清液，一20℃冷冻保存，备用。试验前，10000r/min离心20min，取上清液，用于CDV分离。5.1.2操作方法
5.1.2.1细胞分离法
用常规方法培养细胞单层，待长至80%左右时，用于CDV分离。吸去培养液，用无血清培养液洗涤1次。如用细胞培养瓶，按1m/25-cm-接种处理好的组织土清液，每样接种两瓶；如用细胞培养板，则按每孔0.1mL接种处理好的组织上清液，每样接种2孔。33℃吸附1h，弃去上清液，加人细胞维持液，置37℃5%二氧化碳培养箱内培养，24h后逐日观察细胞病变，连续观察5d～7d。5.1.2.2结果观察
CDV感染Vero细胞3d～4d后、MDCK细胞2d后，出现,CPE变化，细胞变圆，胞浆内颗粒变性和空泡形成，随后形成巨细胞和合胞体，并在胞浆内出现包涵体。若第一次接种后未出现细胞病变，应将细胞培养物冻融后盲传三代，进行观察。如仍无细胞病变，则判为CDV检测阴性。5.1.2.3CDV的鉴定
将出现细胞病变的细胞培养物，按5.2进行鉴定；或按5.3的方法制备细胞涂片，用CDV单克隆抗体进行鉴定。
5.2间接免疫荧光技
5.2.1.3样品
5.2.1.3.1细胞培养物：按5.1用24孔细胞培养板进行病毒分离培养，出现细胞病变的培养孔，吸去细胞维持液，用PBS漂洗，自然干燥。5.2.1.3.2血液涂片：无菌采取待检犬静脉末端血，直接涂片，室温条件下自然干燥。5.2.1.3.3组织涂片：死亡动物脏器组织（如：肝、脾、肺、脑、淋巴结等），制成涂片。5.2.2操作方法
取出。
将细胞培养物、血液涂片、组织涂片用-20℃预冷的丙酮固定10min。将固定好的细胞培养物、载玻片用PBS浸泡5min，置于37℃40min，于燥。在细胞面上或组织面上滴加稀释成适当工作浓度的CDV单克隆抗体，置于37℃30min。PBS漂洗3次，每次5min；再用蒸馅水浸泡1min，自然干燥或风干。在细胞面上或组织面上滴加稀释成适当工作浓度的免疫荧光抗体，37℃平放湿盒中30min，5.2.2.6PBS漂洗3次，每次5min；再用蒸馏水浸泡1min，脱盐。5.2.2.7吹干后，用盖玻片及碳酸缓冲甘油封好载玻片。5.2.2.8立即用荧光显微镜观察。5.2.2.9测定待检样品时，每次试验同时设病毒对照和不接毒细胞对照。5.2.3结果判定
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病毒对照的单个或成团细胞的细胞浆内出现弥漫或颗粒型的特异性草果绿色荧光信号；不接毒细胞对照无特异性苹果绿色荧光信号，则试验成立，可进行结果判定。分离病毒孔或载玻片，单个或成团细胞的细胞浆内出现弥浸或颗粒型的特异性苹果绿色荧光信号，细胞核染成暗黑色，判为阳性。分离病毒孔或载玻片，单个或成团细胞的细胞浆染成橘红色或无特异性暗黄色，无特异性苹果绿色荧光信号，细胞核呈暗黑色，判为明性。5.3免疫酶试验
5.3.1材料准备
5.3.1.1试剂
5.3.1.1.1磷酸盐缓冲液(PBS)：配制见附泵C5.3.1.1.2抗原涂片的制备：将CDy种长至80%左右的细胞单层，连续观察5d～7d，细胞病变达50%～75%时，用胰蛋白酶消化分敏感染细胞，PBS-洗涤-3-次后-稀释至每毫升1×10°个细胞。取印有10个～40个小孔的室玻片，每孔滴加10μL。室温自然干燥后，冷丙酮（4℃）固定10min。密封包装，置一20℃备用。
5.3.1.1.3标准阳性血清和标准阴性血清由指定单位提供。5.3.1.1.4酶结合物：HRP标记的SPA,使用时用,PBS稀释至工作浓度。5.3.1.1.5底物溶液：配制见附录。5.3.1.2器材
5.3.1.2.1普通光学显微镜。
5.3.1.2.2印有10个～40个小孔的室玻片，5.3.1.2.3可调微量加样器（5μL～50μL）。5.3.1.2.437℃恒温水浴箱。
5.3.1.3样品
采集被检犬血液，分离血清，血清应新鲜、透明、不溶血、无污染，密封于灭菌小瓶或离心管内，4℃或一30℃保存后，立即送检。试验前将被检血清统一编号并用PBS作10倍稀释。5.3.2操作方法
5.3.2.1取出抗原涂片，室温干燥后，滴加10倍稀释的待检血清和标准阴性血清、标准阳性血清，每份血清加两个病毒细胞孔和一个正常细胞孔，置湿盒内，37℃30min。5.3.2.2PBS漂洗3次，每次5min，室温干燥。5.3.2.3滴加稀释成工作浓度的酶结合物，置湿盒内，37℃30min。5.3.2.4PBS漂洗3次，每次5min。5.3.2.5将室玻片放人底物溶液中，室温下显色5min~10min。PBS漂洗2次，再用蒸馏水漂洗1次。
5.3.2.6吹干后，在普通光学显微镜下观察，判定结果。5.3.3结果判定Www.bzxZ.net
5.3.3.1在阴性血清对照、阳性血清对照成立的情况下，即阴性血清与正常细胞和病毒感染细胞反应均无色；阳性血清与正常细胞反应无色，与病毒感染细胞反应成棕黄色至棕褐色，即可判定结果；否则应重试。
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待检血清与正常细胞和病毒感染细胞反应均呈无色，即可判为CDV抗体阴性。3待检血清与正常细胞反应呈无色，而与病毒感染细胞反应成棕黄色至棕褐色，即可判为CDV5.3.3.3
抗体阳性。
5.4免疫酶组织化学试验
5.4.1材料准备
5.4.1.1试剂
5.4.1.1.1
5. 4. 1.1.2
5.4.1.1.3
5. 4. 1.1. 4
5.4.1.1.5
5.4.1.1.6
5.4.1.1.7
磷酸盐缓冲液（PBS)：配制见附录C。标准陷性血清和标准阴性血清：由指定单位提供。酶结合物：HRP标记的SPA，使用时用PBS稀释至工作浓度。过氧化氢甲醇溶液：配制见附录C。盐酸乙醇溶液：配制见附录C。
胰蛋白酶溶液：配制见附录C。
底物溶液：配制见附录C。
5. 4.1.2.1
5.4.1.2.2
普通光学显微镜。
可调微量加样器（50μL～200μL）。5.4.1.2.3
石蜡切片机或冷冻切片机。
载玻片和盖玻片。
5.4.1.2.4
37℃恒温培养箱或水浴箱。
5.4.1.2.5
5.4.1.3样品
对疑似CDV的病死犬或扑杀犬，立即采集肺脏、牌脏、胸腺、淋巴结和脑等组织，置冰瓶内立即送检，不能立即送检的，将组织块切成1cmX1cm左右大小，浸于10%福尔马林溶液中固定，保存、送检。5.4.2操作方法
5.4.2.1新鲜组织按常规方法制成冰冻切片或石蜡切片。冰冻切片风干后用丙酮固定10min～15min；新鲜组织或固定组织按常规方法制备石蜡切片，常规脱腊至PBS（切片应用白胶或铬明胶做粘合剂，以防脱片）。
5.4.2.2去内源酶：用过氧化氢甲醇溶液或盐酸乙醇溶液37℃作用20min。5.4.2.3
胰蛋白酶消化：室温下，用胰蛋白酶溶液消化处理2min，以便充分暴露抗原。漂洗：PBS漂洗3次，每次5min。5.4.2.4
30min。
封闭：滴加体积浓度为5%的新生牛血清或1：10稀释的正常马血清，37℃湿盒中作用分别加入稀释成工作浓度的标准阳性血清或标准阴性血清，37℃湿盒中作用1h；或37℃湿盒中作用30min后4℃过夜。
漂洗同5.4.2.4。
滴加稀释成工作浓度的酶结合物，37℃湿盒中作用1h。漂洗同5.4.2.4。
底物显色：新鲜配制的底物溶液显色5min～10min后漂洗。衬染：苏木素或甲基绿衬染细胞核或细胞质。从90%乙醇开始脱水、透明、封片、普通光学显微镜观察。试验同时设阳性组织对照和阴性组织对照。结果判定
阳性组织对照与标准阴性血清反应片、阴性组织对照和标准阳性血清与标准阴性血清反应5.4.3.1
片、被检组织与标准阴性血清反应片本底清晰，背景无非特异性着染；阳性组织对照和标准阳性血清反4
应片细胞胞浆呈黄色至棕褐色着染；则试验成立。SN/T2428—2010
5.4.3.2被检组织与标准阳性血清反应片细胞胞浆偶见细胞核呈黄色至棕褐色着染，即可判为CDV抗原阳性。
5.4.3.3被检组织与标准阳性血清反应片本底清晰，背景无非特异性着染，即可判为CDV抗原阴性。6综合判定
当在临床上怀疑有CDV感染时，可根据实际情况在上述方法中选一种或两种进行确诊。对于未接种过CDV疫苗的犬及其他犬科动物，采用任何一种方法检测呈现阳性结果时，都可最终判定为CDV感染动物。对于接种过CDV疫苗的犬及其他犬科动物，当病毒分离鉴定试验为阳性结果时，可最终判为感染CDV动物；若仅血清学试验呈阳性结果，应结合病史、疫苗接种史综合判定。SN/T2428—2010
附录A
（资料性附录）
犬瘟热概述
犬瘟热(CanineDistemper，CD)是由犬瘟热病毒(CDV)感染引起的一种急性、高度接触性、致死性传染病。犬瘟热病毒(CDV)为副粘病毒科麻疹病毒属成员，呈圆形、短杆状或椭圆形，有时呈长丝状，大小150nm～30Qnm，有双层囊膜，表面有长约1.3nm的纤突，病毒基因组为负链RNA。CD宿主谱广泛，遍布世界各地，不同物种间可交叉感染，可感染食肉目所有的8个科、偶蹄目猪科、灵长目的猕猴属和鳍足目海豹科等多种动物。CI传架性强，发病率高，经常引起大批犬、貂、孤等动物发病，病死率30%～80%，雪貂高达100%，经济损失严重，严重危害养犬业、经济动物养殖业的健康发展以及野生动物的生存。临床诊断以双相热型、粘膜卡他、中枢神经系统症状及足垫肿胀为主要特征，患病动物在康复后还留有麻痹、抽搐、癫痫样发作等后遗症。本病一年四季均可发生，多发生于寒冷季节(0月到第2年的2月），似有一定的周期性，每2年～3年流行一次，但现在有些地方这种周期性不明显，常年发生。CDV的变异是CD流行具有周期性的原因之一。CDV只有一个血清型，但CDW的种间传播、病毒的不断变异以及不同地域来源，病毒的生物学特性的差异，使其具有更大的基困多样性。CDV-可跨宿主传播是-GD流行的重要因素。CDV经野生动物多次传代后可能增大其基因多样性，从而使毒力增强，若再次传给无抵抗力的动物群体，可引发疾病暴发。
CD的传染源，主要是病犬和带毒犬，其次是患CD的其他动物和带毒动物。病毒主要存在于肝、脾、肺、脑、肾和淋巴结等多种器官和组织虫，通过眼洱算汁、唾液、尿液以及呼出空气等排出病毒。有些康复动物，带毒可长达6个月，可电机体排泄物和分泌物中排出病毒。传播途径主要是呼吸道，其次是消化道。通过飞沫、食物或不洁的医疗用具，经眼结膜、口腔、鼻腔黏膜以及阴道、直肠黏膜而感染。CD最早发现于18世纪后叶
1905年在英国由卡尔(Carre)发现其病原为病毒，所以本病也叫Carre氏病。此病分布于全世界。1980年我国分离获得本病毒目前，发达国家如美国、英国、法国、澳大利亚、日本等都按政府规定按期注射疫苗，因比本病得到有效控制。但是在发展中国家，对犬很难全部注射疫苗，因此对其控制有一定难度，我国各地亦时有发生。B. 1发病症状
附录B
(资料性附录）
犬瘟热临床诊断
SN/T 2428—2010
CD的临床表现多种多样，与CDV的毒力、环境条件、宿主的年龄、品种及免疫状态有关，在犬、貂、狐等不同动物表现的临床症状不一。早期表现双相热、急性鼻卡他以及随后的支气管炎、卡他性肺炎、严重的胃肠炎和神经症状为特征，少数病犬的算和足垫可发生角化过度。病犬体温升高至40℃以上，鼻流清滞至脓性鼻汁，脓性眼屎，有咳嗽、呼吸急促等肺炎症状，腹下可见米粒大丘疹。严重病例发生腹泻，类成水样，恶臭，混有黏液和血液。病犬消瘦，脱水，体重下降，脚垫和鼻过度角质化。病后期CDV侵害大脑时出现神经症状，头、颈、四肢抽描。B.2病理变化
CD的病理变化随病程长短，临床病型和继发感染的种类与程度而不同。CDV为泛嗜性病毒，对上皮细胞有特殊的亲和力，因此病变分布广泛。新生幼犬胸腺常明显缩，且多呈胶陈状。有些病例皮肤出现水疱性、脓疱性皮疹；有些病例鼻和脚底表皮角质层增生而呈角化症。上呼吸道、眼结膜呈卡他性和化脓性炎。肺呈现卡他性或化脓性支气管炎，支气管或肺泡中充满渗出液。消化道中可见胃黏膜潮红。卡他性或出血性肠炎，大肠常有过量粘液，直肠黏膜皱装出血。脾肿大。肾上腺皮质变性。轻度间质性附睾炎和率丸炎。中枢神经系统的大体病变包括脑膜出血、脑室扩张和因脑水肿所致的脑脊液增加。
CDV的包涵体通常嗜酸性，當位于胞浆内，直径1μm5μm，多数成卵圆形，可在黏膜上皮细胞、网状细胞、白细胞、神经胶质细胞和神经元中发规。核内包涵体多位于被覆上皮细胞、腺上皮细胞和神经节细胞。
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附录C
(规范性附录）
试剂配制
C.1磷酸盐缓冲液(PBS,0.01mol/LpH7.4)氟化钠（NaCI)
氯化钾
十二水磷酸氢二钠
磷酸二氢钾
蒸馏水
加至1000mL
将上述成分依次溶解，分装，121℃高压灭菌15min，室温保存，有效期1个月。C.2细胞培养液
199培养基（也可用DMEM培养基或其他培养基），加人10%(DMEM培养基为8%)无CDV抗体的胎牛血清（56℃，30min灭活），抽滤除菌，分装，置4℃保存备用，有效期1个月。用于制备组织悬液，（不加胎牛血清）时，使用前加人双抗，使其终浓度为含青霉素2000IU/mL、链霉素2000μg/mL。用于细胞培养时，使用前加人双抗，使其终浓度为含青霉素索200IU/mL、链霉素200μg/mL。C.3细胞维持液
199培养基（也可用DMEM培养基或其他培养基），加人2%(DMEM培养基不加)无CDV抗体的胎牛血清（56℃，30min灭活），抽滤除菌，分装，置4℃保存备用，有效期1个月。使用前加人双抗，使其终浓度为含青霉素200IU/mL、链霉素200μg/mL。C.4
细胞分散液
乙二胺四乙酸二钠EDTA）
0.01mol/LpH7.4PBS
1000mL
抽滤除菌，分装，置一20℃保存备用，有效期6个月。50.02%伊文斯蓝溶液
伊文斯蓝
0.01mol/LpH7.4PBS
溶解后室温保存，使用时用PBS做10倍稀释。6碳酸盐缓冲甘油
碳酸盐缓冲液：3mL0.5mol/L碳酸钠（NazCO,）和1mL0.5mol/L碳酸氢钠（NaHCO.）混合为pH9.0～9.5,0.5mol/L碳酸盐缓冲液。碳酸盐缓冲甘油：按碳酸盐缓冲液：甘油=1：1等量混合。c.7
底物溶液
3，3-二胺基联苯胺盐酸盐（DAB）40mg8
30%过氧化氢
滤纸过滤后使用，现用现配。
C.8过氧化氢甲醇溶液
30%过氧化氢
现用现配。
盐酸乙醇溶液（1%）
75%乙醇
C.10胰蛋白酶溶液
胰蛋白酶
低温保存。使用时，用PBS稀释成浓度为0.05%的溶液。SN/T2428—2010
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