SN/T 1315-2010
基本信息
标准号： SN/T 1315-2010
中文名称：牛地方流行性白血病检疫技术规范
标准类别：商检行业标准(SN)
标准状态：现行
发布日期：2010-01-10
实施日期：2010-07-16
出版语种：简体中文
下载格式：.rar .pdf
下载大小：3568904
标准分类号
关联标准
替代情况：替代SN/T 1315-2003
出版信息
出版社：中国标准出版社
标准价格：0.0 元
出版日期：2010-07-16
相关单位信息
发布部门：中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局
标准简介
SN/T 1315-2010 牛地方流行性白血病检疫技术规范 SN/T1315-2010 标准下载解压密码：www.bzxz.net
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标准内容
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T1315-—2010
代替SN/T1315-2003
牛地方流行性白血病检疫技术规范Protocol of quarantinefor enzootic bovine leukosis2010-01-10发布
数码肪伪
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2010-07-16实施
SN/T13152010
本标准代替SN/T1315一2003《牛地方流行性白血病琼脂免疫扩散试验操作规程》。本标准与SN/T1315一2003相比，主要变化如下：一标准名称改为《牛地方流行性白血病检疫技术规范》；增加了临床诊断部分；
-实验室诊断增加了病原分离鉴定、间接酶联免疫吸附试验、阻断酶联免疫吸附试验和核酸检测方法：
对已有的琼脂凝胶免疫扩散试验的操作方法和结果判定进行了修订完善。本标准的附录A、附录B、附录C均为规范性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国北京出境检验检疫局。本标准主要起草人：乔彩霞、张鹤晓、赣平安、高志强、昊丹、蒲静。本标准所代替标准的历次版本发布情况为：SN/T1315—2003。
1范围
牛地方流行性白血病检疫技术规范本标准规定了牛地方流行性白血病临床诊断和实验室诊断的操作内容。本标准适用于牛地方流行性白血病的检疫。2规范性引用文件
SN/T1315—2010
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。SN/T1917牛地方流行性白血病聚合酶链反应操作规程3缩略语
下列缩略语适用于本标准。
牛地方流行性白血病。
牛白血病病毒。
胎牛肺。
放射性免疫试验。
聚合酶链反应。
琼脂凝胶免疫扩散。
ELISA'
酶联免疫吸附试验。
4临床诊断
4.1流行病学
牛感染BLV后将终生带毒，成为传染源，其传播方式有垂直传播和水平传播两种。该疫病自1878年发现于德国以来，日前在德国、波兰、罗马尼亚和前苏联等多数国家均有发生，而与我国近邻的SN/T1315—2010
日本也因输人性传播导致该病在全国蔓延。4.2临床症状
牛白血病的潜伏期较长，可达4年～5年，多数感染牛不呈现临床症状，以在血液中存在白血病抗体并出现持续的淋巴细胞增多症和异常淋巴细胞为特征。疫病发展形成肿瘤后则出现淋巴结肿大和一些组织脏器的生理机能障碍，并表现体重减轻、贫血和泌乳减少等症状。4.3病理变化
感染BLV后.病牛会出现淋巴结肿大，遍及全身各个脏器，形成大小不等的结节性或弥漫性肉芽肿病灶。特别是真胃、心脏和子宫等为最常发的器官。根据流行病学、临床症状和病理变化可作出牛地方流行性白血病的初步诊断，进一步的确诊有赖于实验室诊断。
5实验室诊断
5.1病原分离及鉴定
5.1.1原理
BLV是一种外源反转录病毒，其主要靶细胞是B淋巴细胞。BLV不仅以前病毒的形式存在于感染牛的血液淋巴细胞和肿瘤细胞中，而且存在于动物体的各种体液（鼻腔、支气管渗出液，唾液和牛奶等)中，利用外周血液血淋巴细胞可对其进行培养分离，然后用电镜或BLV抗原测定法鉴定。也可直接用PCR检查外周血和肿瘤中存在的BLV前病毒DNA。5.1.2材料准备
5.1.2.1器材和设备：无菌注射器，倒置光学显微镜，二氧化碳培养箱，冰箱（一20℃保存血清，一70℃保存种毒），无菌96孔细胞培养板，微量可调移液器（50μL、100μL），微量滴头，吸管（5mL、10 mL)。
5.1.2.2试剂：淋巴细胞分离液、20%胎牛血清的MEM培养液和细胞分散液配制见附录A。5.1.2.3胎牛肺细胞：无菌采取出生转牛脑，磨碎或剪碎，再用胰蛋白酶消化制备细胞，置37℃二氧化碳培养箱，长成良好单层备用。5.1.3样品制备
5.1.3.1样品采集
用无菌注射器或采血专用真空管针无菌从牛静脉采血并加入抗凝剂，采集样品立即放人4冰箱保存，在24h内送到实验室。
5.1.3.2样品处理
取1.5mL抗凝血，轻轻加人等量的淋巴细胞分离液，注意不要摇动打乱液层，2000r/min离心20min，离心后分成多层，最上层是血浆层，中间层是分离液，最下层是红细胞，在血浆层与分离液之间是一层较致密的白色层，为淋巴细胞层，用毛细吸管插入并吸取该层放人另一离心管中，以PBS洗涤后备用。
5.1.4病毒分离
取5.1.3.2得到的淋巴细胞与2X10°FBL细胞在40mL含20%胎牛血清的MEM中共同培养，置于37℃5%二氧化碳培养箱，逐日观察细胞变化，并在3d～4d后收获培养物上清，保存于一70℃待鉴定。
5.1.5病毒鉴定
病毒致细胞变化特点是细胞产生合胞体。取上述细胞培养物，经冻融、裂解两次后，以10000r/min离心10min，取上清通过RIA、ELISA或AGID等方法检测其中是否含有p24和gp51抗原，并通过电子显微镜观察上清中包含的病毒粒子，或者用PCR方法检测上清中的BLV前病毒核酸（方法见SN/T1917），从而确诊样品中是否包含有BLV。2
5.2血清学试验
5.2.1琼脂凝胶免疫扩散试验
5.2.1.1原理
SN/T 1315—2010
抗原及其特异性抗体在凝胶中呈自由扩散形式，不同抗原在凝胶中的扩散速度不同，当抗原与相应抗体经扩散后在凝胶中相遇，形成抗原抗体复合物，其相对分子质量增大，因而不再继续扩散而形成沉淀，呈现出线状，称为免疫沉淀线或免疫沉淀带。AGID即根据抗原与阳性血清之间出现的沉淀线来判定被检血清中是否存在特异性抗体。5.2.1.2材料准备
5.2.1.2.1·器材和设备：吸管、量筒、量杯、三角瓶、平Ⅲ（直径90mm）、7孔梅花样金属打孔器（内径5mm）、微量移液器（0.1μL~50μL-0-μL100-μL）)观察灯-温箱(25℃）。5.2.1.2.2试剂：PBS(0.05mo1/pH7.2)和琼脂糖凝胶平板配制方法见附录B。5.2.1.2.3标准抗原：由指定单位提供。由感染EBL病毒的胎羊肾细胞(FLK)培养液经提取和浓缩制成，是以病毒囊膜糖蛋白(gp)为主，并含核蛋白(p)的混合抗原，试验时与阳性血清之间应在24h内出现清晰的沉淀线，与标准阴性血清之问间不得出现任何沉淀线。5.2.1.2.4标准阳性血清：由指定单位提供。能与标准抗原在24h内产生明显的细直而致密的一条沉淀线（gP抗体），末端接触两侧相邻孔的边缘。5.2.1.3样品制备
被检血清，用无菌注射器或采用真空管针无菌自牛静脉采血，无菌分离血清后编号，样品应无溶血，经5630min灭活处理，保存于4
5.2.1.4操作方法
5.2.1.4.1打孔
℃，时间不宜超过3周。
按图1和图2的模式在制备好的琼脂板上打孔，孔径为5mm，孔间距3mm，反应孔现用现打。将孔中的琼脂用针头轻轻挑出或吸出切勿损坏边以及使琼脂层脱离来皿，为防止渗漏，最好封底。5
SN/T1315—2010
5.2.1.4.2加样
七孔型（如图1所示），中央孔加抗原（G)，1、4孔加标准阳性血清，2、3、5、6孔分别加三份被检血清；六十三孔型（如图2所示)，按图“G\孔加抗原。“十\孔加标准阳性血清，数字孔加被检血清（同时可检查40份样品）。每孔均以加满不溢出为度，约50L/孔，每加一个样品应换一个吸头。5.2.1.4.3反应
加样完毕后，静置10min，将平皿水平例倒置，放人湿盒，置于20℃～25℃作用，分别在24h，48h和72h观察并记录结果。
5.2.1.5结果判定
5.2.1.5.1判定方法
将琼脂板置日光灯或侧强光下观察，标准阳性血清与抗原孔之间出现一条清晰致密的白色沉淀线，则试验成立。
5.2.1.5.2判定标准
阳性：出现清晰致密的沉淀线，并与标准阳性血清的沉淀线末端相融合（如图3所示6孔）。被检血清可能在此沉淀线的外侧，还出现粗而直的第二条沉淀线，这是p沉淀线（核蛋白p24与其特异性抗体形成的沉淀线)(如图3所示6孔）。图3
弱阳性：不出现沉淀线，但两侧标准阳性血清形成的沉淀线末端向被检血清孔弯曲（如图3所示5孔）。凡弱阳性者应重复试验一次，如仍为弱阳性则判为阳性，否则判为阴性。阴性：不出现沉淀线，且相邻孔的标准阳性血清形成的沉淀线直伸到被检血清孔的边缘（如图3所示2孔）。
非特异性反应：出现的沉淀线粗而浑浊并与标准阳性血清形成的沉淀线交叉并直伸，为非特异反应（如图3所示3孔）。应重新试验，若仍出现非特异反应则判为阴性。5.2.2间接酶联免疫吸附试验
5.2.2.1原理
利用抗原抗体的特异性反应，用BLV抗原直接包被微量反应板，或先用BLV多克隆或者单克隆抗体进行包被之后捕获所加人的BLV抗原，当待测的血清或奶样品中含有相应的特异性抗体时，则可与所包被的抗原相结合，并能继续与加入的酶标记的抗牛IgG抗体结合形成复合物。随后加入的底物可在酶分子的作用下呈现颜色反应，颜色反应的深浅可与样品中相应抗体的量呈正比，通过酶标仪可检测颜色反应的光密度值，从而判定待测样品中是否含有牛白血病病毒的特异性抗体（本标准只作定性用）。5.2.2.2材料准备
器材和设备：96孔微量反应板，酶标测定仪，单孔道或多孔道微量移液器，振荡器，37℃恒5.2.2.2.1
温箱。
5.2.2.2.2FLISA所用溶液：包被液、洗涤液、封闭液、底物缓冲液、底物显色液及终止液的配方详见附录C，各种试剂均为分析纯试剂。5.2.2.2.3BLV抗原：由指定单位提供。与AGID相同的制备方式从病毒感染的细胞培养液中提取，并用包被缓冲液稀释后用。
SN/T1315—2010
5.2.2.2.4BLV标准阳性和阴性血清：由指定单位提供，使用时经56℃30min灭活处理。5.2.2.2.5抗牛IgG抗体：由指定单位提供。5.2.2.3样品制备
被检血清：用无菌注射器或采用真空管针无菌自牛静脉采血，无菌分离血清后编号，样品应无溶血，经56℃30min灭活处理，保存于4℃，时间不宜超过3周。被检奶样：所采集的奶样需在4℃冰箱中放置24h～48h，直至乳脂层形成，期间不能振荡；或者也可于2000r/min离心10min使奶样形成乳脂层，在检测前，将所形成的乳脂层去除。5.2.2.4操作方法
5.2.2.4.1包被
BLV抗原和阴性对照抗原分列依次包被微量反应板，每孔100μL，4℃过夜。5.2.2.4.2洗涤
取出包被过夜的酶标板，甩掉孔内的包被液，加人洗涤液至反应孔的顶端，静置1min～2min或用干，并用吸水纸沥干，如此重复3次，也可用洗板机洗涤。5.2.2.4.3封闭
每孔加人200μL封闭液，置37℃温箱孵育90min，甩掉液体按5.2.2.4.2所述标准程序进行洗涤。
5.2.2.4.4加样及抗体吸附
检测血清样品时，先在用于检测样品的反应孔中，每孔加人100μL稀释液。之后在BLV抗原包被孔和阴性对照抗原包被孔中分别加入4μL待检血清样品，同时设阳性和阴性血清对照，每份样品需重复测定两孔。
检测奶样时，将100uL待检奶样、阳性和阴性奶样分别加入BLV抗原和阴性抗原包被的两种反应孔中，每份样品需重复测定两孔。将加好样的酶标板在振荡器上充分振荡混匀后，37℃孵育1h。5.2.2.4.5加酶标二抗
将上述反应板按5.2.2.4.2所述标准程序进行洗涤后，每孔加入用洗涤液稀释的辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗体100μL，37℃孵育1h。5.2.2.4.6显色
将上述反应板按5.2.2.4.2所述标准程序进行洗涤后，每孔加人100μL底物显色液，室温孵育10min。
5.2.2.4.7终止
每孔加入50L反应终止液，振荡混匀，加终止液的顺序应与加底物的顺序一致。5.2.2.4.8测定OD值
在反应终止后的15min内在酶标以上测定反应孔在450nm波长处的光吸收值（OD值）。5.2.2.4.9结果判定
5.2.2.4.10OD值的校准
每份样品在包被有BLV抗原的反应孔所测的OD值减去其阴性抗原对照孔所测的OD值即为该样品校准的OD值（ODcorr）。
5.2.2.4.11计算样品PP值
样品PP值的计算见式（1)：
样品PP值（PercentPositivityValue）=样品ODcorr/阳性血清ODcorr×10o...(1)
5.2.2.4.12判定标准
检测结果中阳性对照的ODcorr值大于1.0、阴性对照的ODcorr值小于0.1且阴性对照的PP值小于临界值（血液样品为10，奶样为6），本次检测结果成立。如其中有一项不符则检测结果判为无效，5
SN/T13152010
重新进行试验。
血清样品：PP值小于10判为阴性，PP值大于等于10则判为阳性。奶样：PP值小于6判为阴性，PP值大于等于6则判为阳性。5.2.3阻断酶联免疫吸附试验
5.2.3.1原理
用BLV多克隆抗体或单克隆抗体包被微量反应板，之后加人抗原，被抗体捕获的抗原进一步可与待检血清样品中的BLV抗体发生结合，从而阻断生物素标记BLV抗体与抗原的结合，面阴性样品则不会发生阻断，所结合的标记抗体促使底物发生反应，转变为可检测的信号。5.2.3.2材料准备
5.2.3.2.1器材和设备：同间接酶联免疫吸附试验。5.2.3.2.2ELISA所用溶液：同间按酶联免疫吸附试验。5.2.3.2.3BLV抗原：同间接酶联免疫吸附试验。5.2.3.2.4BLV标准阳性和阴性血清：同间接酶联免疫吸附试验。：BLV多克隆或单克隆抗体：由指定单位提供。5.2.3.2.5
生物素标记BLV抗体和HRP标记亲和素：由指定单位提供。5.2.3.2.6
5.2.3.3样品制备
被检血清：同间接酶联免疫吸附试验。5.2.3.4操作方法
5.2.3.4.1包被
用碳酸盐缓冲液将BLV多克隆或单克隆抗体稀释后，每孔.100μL4℃过夜包被微量反应板。5.2.3.4.2洗涤
取出包被过夜的酶标板，按5.2.2.4:2所述标准释序进行洗涤。5.2.3.4.3抗原捕获
用洗涤缓冲液将BLV抗原稀释后，每孔i100L加入酶标板，37℃孵育2h。5.2.3.4.4加样
将上述反应板按5.2.2.4.2所述标准程序进行洗涤后，将标准阳性和阴性血清用洗涤液按1/2稀释后，每孔100μL加人酶标板，重复4孔！待检的混合样品，如86分血清，用洗涤液作1/2稀释后每孔加入100μL。待检的单一样品，则按1/100用稀释液稀释后每孔100μL加样。加样完毕后，在4℃孵有18h。
5.2.3.4.5加生物素标记的抗体和酶标记的亲和素将反应板按5.2.2.4.2所述标准程序进行洗涤后，用含10%胎牛血清的洗涤液将生物素标记的抗体稀释后，按每孔100μL加人酶标板中，37℃孵育1h，按5.2.2.4.2所述标准程序进行洗涤。之后每孔加人100μL用洗涤液稀释的HRP标记的亲和素，置于摇床，在37℃孵育30min。按5.2.2.4.2所述标准程序进行洗涤。
5.2.3.4.6显色和终止
将反应板按5.2.2.4.2所述标准程序进行洗涤后，每孔加入100L底物显色液，在暗环境下显色9min，之后加入50μL终止液终止反应，并在60min内在酶标仪上测定OD值。5.2.3.4.7测定OD值
在490nm波长处，使用空孔作为调零孔，并用测定样品的OD值。其阴性对照样品的OD值应位于0.7～1.5范围之内，否则应重新试验，并调节5.2.3.4.6相应的底物显色时间，小于0.7应延长显色时间，大于1.5应缩短显色时间。阳性对照的OD值应小于阴性对照的OD值的1/4。5.2.3.5结果判定
阳性：待检样品2个反应孔的平均OD值≤0.5×阴性反应孔平均OD值时判为阳性。6
SN/T1315-2010
阴性：待检样品2个反应孔的平均OD值≥0.65×阴性反应孔平均OD值时判为阴性。可疑：待检样品2个反应孔的平均OD值位于上述两者之间时判为可疑，重新进行检测或在1个月之后重新取样检测。
5.3核酸检测方法
可直接用于临床样品的检测，具体方法见SN/T1917。SN/T1315—2010
附录A
（规范性附录）
病原分离试剂配制
A.1淋巴细胞分离液（聚蔗糖-泛影葡胺液，1.077土0.001)取9%聚蔗糖（相对分子质量400000)24份与33.9%泛影葡胺10份混匀，过滤除菌或114.3℃高压灭菌15min，分装于棕色瓶中，置于4℃保存，一般可保存3个月。A.220%胎牛血清的培养液
199培养基（或MEM培养基），加人含20%无病毒抗体胎牛血清，抽滤除菌，加青霉素200IU/mL，链霉素200IU/mL。
A.3细胞分散液
胰蛋白酶
乙二胺四乙酸二钠(EDTA)
无钙镁PBS
混匀抽滤除菌。
A.4无钙镁PBS
氯化钠
氯化钾
无水磷酸氢二钠
无水磷酸二氢钾
加蒸馏水
1000mL
至1000mLWww.bzxZ.net
将上述成分依次溶解、分装、高压灭菌（68.94kPa15min)或抽滤除菌备用。8
附录B
(规范性附录）
琼脂凝胶免疫扩散试验试剂配制B.1磷酸盐缓冲液(0.05mol/LpH7.2)一水磷酸二氢钠(NaH,PO：·H,O)七水磷酸氢二钠(NazHPO，·7H,O)氟化钠(NaCI）
加蒸馏水
至1000mL
将上述成分依次溶解、分装、高压灭菌（68.94kPa15min)或抽滤除菌备用。B.2琼脂糖平板的制备
琼脂糖凝胶的配方：
琼脂糖
氯化钠
1%硫柳汞
磷酸盐缓冲液（0.05mol/LpH7.2）1.0 g
SN/T1315—2010
将琼脂糖凝胶在水浴中充分煮沸融化，冷却至50℃～60℃时，将经干热灭菌的直径为90mm的洁净平皿置于水平台面上，然后每个平皿加人15mL～17mL液体，注意不要产生气泡，凝胶板厚度约为2mm，静置10min～15min，待凝固后加盖，将平皿例置，防止水分蒸发，置4℃冰箱保存备用，平板最好在24h内使用。
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2010-07-16实施
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本标准代替SN/T1315一2003《牛地方流行性白血病琼脂免疫扩散试验操作规程》。本标准与SN/T1315一2003相比，主要变化如下：一标准名称改为《牛地方流行性白血病检疫技术规范》；增加了临床诊断部分；
-实验室诊断增加了病原分离鉴定、间接酶联免疫吸附试验、阻断酶联免疫吸附试验和核酸检测方法：
对已有的琼脂凝胶免疫扩散试验的操作方法和结果判定进行了修订完善。本标准的附录A、附录B、附录C均为规范性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国北京出境检验检疫局。本标准主要起草人：乔彩霞、张鹤晓、赣平安、高志强、昊丹、蒲静。本标准所代替标准的历次版本发布情况为：SN/T1315—2003。
1范围
牛地方流行性白血病检疫技术规范本标准规定了牛地方流行性白血病临床诊断和实验室诊断的操作内容。本标准适用于牛地方流行性白血病的检疫。2规范性引用文件
SN/T1315—2010
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。SN/T1917牛地方流行性白血病聚合酶链反应操作规程3缩略语
下列缩略语适用于本标准。
牛地方流行性白血病。
牛白血病病毒。
胎牛肺。
放射性免疫试验。
聚合酶链反应。
琼脂凝胶免疫扩散。
ELISA'
酶联免疫吸附试验。
4临床诊断
4.1流行病学
牛感染BLV后将终生带毒，成为传染源，其传播方式有垂直传播和水平传播两种。该疫病自1878年发现于德国以来，日前在德国、波兰、罗马尼亚和前苏联等多数国家均有发生，而与我国近邻的SN/T1315—2010
日本也因输人性传播导致该病在全国蔓延。4.2临床症状
牛白血病的潜伏期较长，可达4年～5年，多数感染牛不呈现临床症状，以在血液中存在白血病抗体并出现持续的淋巴细胞增多症和异常淋巴细胞为特征。疫病发展形成肿瘤后则出现淋巴结肿大和一些组织脏器的生理机能障碍，并表现体重减轻、贫血和泌乳减少等症状。4.3病理变化
感染BLV后.病牛会出现淋巴结肿大，遍及全身各个脏器，形成大小不等的结节性或弥漫性肉芽肿病灶。特别是真胃、心脏和子宫等为最常发的器官。根据流行病学、临床症状和病理变化可作出牛地方流行性白血病的初步诊断，进一步的确诊有赖于实验室诊断。
5实验室诊断
5.1病原分离及鉴定
5.1.1原理
BLV是一种外源反转录病毒，其主要靶细胞是B淋巴细胞。BLV不仅以前病毒的形式存在于感染牛的血液淋巴细胞和肿瘤细胞中，而且存在于动物体的各种体液（鼻腔、支气管渗出液，唾液和牛奶等)中，利用外周血液血淋巴细胞可对其进行培养分离，然后用电镜或BLV抗原测定法鉴定。也可直接用PCR检查外周血和肿瘤中存在的BLV前病毒DNA。5.1.2材料准备
5.1.2.1器材和设备：无菌注射器，倒置光学显微镜，二氧化碳培养箱，冰箱（一20℃保存血清，一70℃保存种毒），无菌96孔细胞培养板，微量可调移液器（50μL、100μL），微量滴头，吸管（5mL、10 mL)。
5.1.2.2试剂：淋巴细胞分离液、20%胎牛血清的MEM培养液和细胞分散液配制见附录A。5.1.2.3胎牛肺细胞：无菌采取出生转牛脑，磨碎或剪碎，再用胰蛋白酶消化制备细胞，置37℃二氧化碳培养箱，长成良好单层备用。5.1.3样品制备
5.1.3.1样品采集
用无菌注射器或采血专用真空管针无菌从牛静脉采血并加入抗凝剂，采集样品立即放人4冰箱保存，在24h内送到实验室。
5.1.3.2样品处理
取1.5mL抗凝血，轻轻加人等量的淋巴细胞分离液，注意不要摇动打乱液层，2000r/min离心20min，离心后分成多层，最上层是血浆层，中间层是分离液，最下层是红细胞，在血浆层与分离液之间是一层较致密的白色层，为淋巴细胞层，用毛细吸管插入并吸取该层放人另一离心管中，以PBS洗涤后备用。
5.1.4病毒分离
取5.1.3.2得到的淋巴细胞与2X10°FBL细胞在40mL含20%胎牛血清的MEM中共同培养，置于37℃5%二氧化碳培养箱，逐日观察细胞变化，并在3d～4d后收获培养物上清，保存于一70℃待鉴定。
5.1.5病毒鉴定
病毒致细胞变化特点是细胞产生合胞体。取上述细胞培养物，经冻融、裂解两次后，以10000r/min离心10min，取上清通过RIA、ELISA或AGID等方法检测其中是否含有p24和gp51抗原，并通过电子显微镜观察上清中包含的病毒粒子，或者用PCR方法检测上清中的BLV前病毒核酸（方法见SN/T1917），从而确诊样品中是否包含有BLV。2
5.2血清学试验
5.2.1琼脂凝胶免疫扩散试验
5.2.1.1原理
SN/T 1315—2010
抗原及其特异性抗体在凝胶中呈自由扩散形式，不同抗原在凝胶中的扩散速度不同，当抗原与相应抗体经扩散后在凝胶中相遇，形成抗原抗体复合物，其相对分子质量增大，因而不再继续扩散而形成沉淀，呈现出线状，称为免疫沉淀线或免疫沉淀带。AGID即根据抗原与阳性血清之间出现的沉淀线来判定被检血清中是否存在特异性抗体。5.2.1.2材料准备
5.2.1.2.1·器材和设备：吸管、量筒、量杯、三角瓶、平Ⅲ（直径90mm）、7孔梅花样金属打孔器（内径5mm）、微量移液器（0.1μL~50μL-0-μL100-μL）)观察灯-温箱(25℃）。5.2.1.2.2试剂：PBS(0.05mo1/pH7.2)和琼脂糖凝胶平板配制方法见附录B。5.2.1.2.3标准抗原：由指定单位提供。由感染EBL病毒的胎羊肾细胞(FLK)培养液经提取和浓缩制成，是以病毒囊膜糖蛋白(gp)为主，并含核蛋白(p)的混合抗原，试验时与阳性血清之间应在24h内出现清晰的沉淀线，与标准阴性血清之问间不得出现任何沉淀线。5.2.1.2.4标准阳性血清：由指定单位提供。能与标准抗原在24h内产生明显的细直而致密的一条沉淀线（gP抗体），末端接触两侧相邻孔的边缘。5.2.1.3样品制备
被检血清，用无菌注射器或采用真空管针无菌自牛静脉采血，无菌分离血清后编号，样品应无溶血，经5630min灭活处理，保存于4
5.2.1.4操作方法
5.2.1.4.1打孔
℃，时间不宜超过3周。
按图1和图2的模式在制备好的琼脂板上打孔，孔径为5mm，孔间距3mm，反应孔现用现打。将孔中的琼脂用针头轻轻挑出或吸出切勿损坏边以及使琼脂层脱离来皿，为防止渗漏，最好封底。5
SN/T1315—2010
5.2.1.4.2加样
七孔型（如图1所示），中央孔加抗原（G)，1、4孔加标准阳性血清，2、3、5、6孔分别加三份被检血清；六十三孔型（如图2所示)，按图“G\孔加抗原。“十\孔加标准阳性血清，数字孔加被检血清（同时可检查40份样品）。每孔均以加满不溢出为度，约50L/孔，每加一个样品应换一个吸头。5.2.1.4.3反应
加样完毕后，静置10min，将平皿水平例倒置，放人湿盒，置于20℃～25℃作用，分别在24h，48h和72h观察并记录结果。
5.2.1.5结果判定
5.2.1.5.1判定方法
将琼脂板置日光灯或侧强光下观察，标准阳性血清与抗原孔之间出现一条清晰致密的白色沉淀线，则试验成立。
5.2.1.5.2判定标准
阳性：出现清晰致密的沉淀线，并与标准阳性血清的沉淀线末端相融合（如图3所示6孔）。被检血清可能在此沉淀线的外侧，还出现粗而直的第二条沉淀线，这是p沉淀线（核蛋白p24与其特异性抗体形成的沉淀线)(如图3所示6孔）。图3
弱阳性：不出现沉淀线，但两侧标准阳性血清形成的沉淀线末端向被检血清孔弯曲（如图3所示5孔）。凡弱阳性者应重复试验一次，如仍为弱阳性则判为阳性，否则判为阴性。阴性：不出现沉淀线，且相邻孔的标准阳性血清形成的沉淀线直伸到被检血清孔的边缘（如图3所示2孔）。
非特异性反应：出现的沉淀线粗而浑浊并与标准阳性血清形成的沉淀线交叉并直伸，为非特异反应（如图3所示3孔）。应重新试验，若仍出现非特异反应则判为阴性。5.2.2间接酶联免疫吸附试验
5.2.2.1原理
利用抗原抗体的特异性反应，用BLV抗原直接包被微量反应板，或先用BLV多克隆或者单克隆抗体进行包被之后捕获所加人的BLV抗原，当待测的血清或奶样品中含有相应的特异性抗体时，则可与所包被的抗原相结合，并能继续与加入的酶标记的抗牛IgG抗体结合形成复合物。随后加入的底物可在酶分子的作用下呈现颜色反应，颜色反应的深浅可与样品中相应抗体的量呈正比，通过酶标仪可检测颜色反应的光密度值，从而判定待测样品中是否含有牛白血病病毒的特异性抗体（本标准只作定性用）。5.2.2.2材料准备
器材和设备：96孔微量反应板，酶标测定仪，单孔道或多孔道微量移液器，振荡器，37℃恒5.2.2.2.1
温箱。
5.2.2.2.2FLISA所用溶液：包被液、洗涤液、封闭液、底物缓冲液、底物显色液及终止液的配方详见附录C，各种试剂均为分析纯试剂。5.2.2.2.3BLV抗原：由指定单位提供。与AGID相同的制备方式从病毒感染的细胞培养液中提取，并用包被缓冲液稀释后用。
SN/T1315—2010
5.2.2.2.4BLV标准阳性和阴性血清：由指定单位提供，使用时经56℃30min灭活处理。5.2.2.2.5抗牛IgG抗体：由指定单位提供。5.2.2.3样品制备
被检血清：用无菌注射器或采用真空管针无菌自牛静脉采血，无菌分离血清后编号，样品应无溶血，经56℃30min灭活处理，保存于4℃，时间不宜超过3周。被检奶样：所采集的奶样需在4℃冰箱中放置24h～48h，直至乳脂层形成，期间不能振荡；或者也可于2000r/min离心10min使奶样形成乳脂层，在检测前，将所形成的乳脂层去除。5.2.2.4操作方法
5.2.2.4.1包被
BLV抗原和阴性对照抗原分列依次包被微量反应板，每孔100μL，4℃过夜。5.2.2.4.2洗涤
取出包被过夜的酶标板，甩掉孔内的包被液，加人洗涤液至反应孔的顶端，静置1min～2min或用干，并用吸水纸沥干，如此重复3次，也可用洗板机洗涤。5.2.2.4.3封闭
每孔加人200μL封闭液，置37℃温箱孵育90min，甩掉液体按5.2.2.4.2所述标准程序进行洗涤。
5.2.2.4.4加样及抗体吸附
检测血清样品时，先在用于检测样品的反应孔中，每孔加人100μL稀释液。之后在BLV抗原包被孔和阴性对照抗原包被孔中分别加入4μL待检血清样品，同时设阳性和阴性血清对照，每份样品需重复测定两孔。
检测奶样时，将100uL待检奶样、阳性和阴性奶样分别加入BLV抗原和阴性抗原包被的两种反应孔中，每份样品需重复测定两孔。将加好样的酶标板在振荡器上充分振荡混匀后，37℃孵育1h。5.2.2.4.5加酶标二抗
将上述反应板按5.2.2.4.2所述标准程序进行洗涤后，每孔加入用洗涤液稀释的辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗体100μL，37℃孵育1h。5.2.2.4.6显色
将上述反应板按5.2.2.4.2所述标准程序进行洗涤后，每孔加人100μL底物显色液，室温孵育10min。
5.2.2.4.7终止
每孔加入50L反应终止液，振荡混匀，加终止液的顺序应与加底物的顺序一致。5.2.2.4.8测定OD值
在反应终止后的15min内在酶标以上测定反应孔在450nm波长处的光吸收值（OD值）。5.2.2.4.9结果判定
5.2.2.4.10OD值的校准
每份样品在包被有BLV抗原的反应孔所测的OD值减去其阴性抗原对照孔所测的OD值即为该样品校准的OD值（ODcorr）。
5.2.2.4.11计算样品PP值
样品PP值的计算见式（1)：
样品PP值（PercentPositivityValue）=样品ODcorr/阳性血清ODcorr×10o...(1)
5.2.2.4.12判定标准
检测结果中阳性对照的ODcorr值大于1.0、阴性对照的ODcorr值小于0.1且阴性对照的PP值小于临界值（血液样品为10，奶样为6），本次检测结果成立。如其中有一项不符则检测结果判为无效，5
SN/T13152010
重新进行试验。
血清样品：PP值小于10判为阴性，PP值大于等于10则判为阳性。奶样：PP值小于6判为阴性，PP值大于等于6则判为阳性。5.2.3阻断酶联免疫吸附试验
5.2.3.1原理
用BLV多克隆抗体或单克隆抗体包被微量反应板，之后加人抗原，被抗体捕获的抗原进一步可与待检血清样品中的BLV抗体发生结合，从而阻断生物素标记BLV抗体与抗原的结合，面阴性样品则不会发生阻断，所结合的标记抗体促使底物发生反应，转变为可检测的信号。5.2.3.2材料准备
5.2.3.2.1器材和设备：同间接酶联免疫吸附试验。5.2.3.2.2ELISA所用溶液：同间按酶联免疫吸附试验。5.2.3.2.3BLV抗原：同间接酶联免疫吸附试验。5.2.3.2.4BLV标准阳性和阴性血清：同间接酶联免疫吸附试验。：BLV多克隆或单克隆抗体：由指定单位提供。5.2.3.2.5
生物素标记BLV抗体和HRP标记亲和素：由指定单位提供。5.2.3.2.6
5.2.3.3样品制备
被检血清：同间接酶联免疫吸附试验。5.2.3.4操作方法
5.2.3.4.1包被
用碳酸盐缓冲液将BLV多克隆或单克隆抗体稀释后，每孔.100μL4℃过夜包被微量反应板。5.2.3.4.2洗涤
取出包被过夜的酶标板，按5.2.2.4:2所述标准释序进行洗涤。5.2.3.4.3抗原捕获
用洗涤缓冲液将BLV抗原稀释后，每孔i100L加入酶标板，37℃孵育2h。5.2.3.4.4加样
将上述反应板按5.2.2.4.2所述标准程序进行洗涤后，将标准阳性和阴性血清用洗涤液按1/2稀释后，每孔100μL加人酶标板，重复4孔！待检的混合样品，如86分血清，用洗涤液作1/2稀释后每孔加入100μL。待检的单一样品，则按1/100用稀释液稀释后每孔100μL加样。加样完毕后，在4℃孵有18h。
5.2.3.4.5加生物素标记的抗体和酶标记的亲和素将反应板按5.2.2.4.2所述标准程序进行洗涤后，用含10%胎牛血清的洗涤液将生物素标记的抗体稀释后，按每孔100μL加人酶标板中，37℃孵育1h，按5.2.2.4.2所述标准程序进行洗涤。之后每孔加人100μL用洗涤液稀释的HRP标记的亲和素，置于摇床，在37℃孵育30min。按5.2.2.4.2所述标准程序进行洗涤。
5.2.3.4.6显色和终止
将反应板按5.2.2.4.2所述标准程序进行洗涤后，每孔加入100L底物显色液，在暗环境下显色9min，之后加入50μL终止液终止反应，并在60min内在酶标仪上测定OD值。5.2.3.4.7测定OD值
在490nm波长处，使用空孔作为调零孔，并用测定样品的OD值。其阴性对照样品的OD值应位于0.7～1.5范围之内，否则应重新试验，并调节5.2.3.4.6相应的底物显色时间，小于0.7应延长显色时间，大于1.5应缩短显色时间。阳性对照的OD值应小于阴性对照的OD值的1/4。5.2.3.5结果判定
阳性：待检样品2个反应孔的平均OD值≤0.5×阴性反应孔平均OD值时判为阳性。6
SN/T1315-2010
阴性：待检样品2个反应孔的平均OD值≥0.65×阴性反应孔平均OD值时判为阴性。可疑：待检样品2个反应孔的平均OD值位于上述两者之间时判为可疑，重新进行检测或在1个月之后重新取样检测。
5.3核酸检测方法
可直接用于临床样品的检测，具体方法见SN/T1917。SN/T1315—2010
附录A
（规范性附录）
病原分离试剂配制
A.1淋巴细胞分离液（聚蔗糖-泛影葡胺液，1.077土0.001)取9%聚蔗糖（相对分子质量400000)24份与33.9%泛影葡胺10份混匀，过滤除菌或114.3℃高压灭菌15min，分装于棕色瓶中，置于4℃保存，一般可保存3个月。A.220%胎牛血清的培养液
199培养基（或MEM培养基），加人含20%无病毒抗体胎牛血清，抽滤除菌，加青霉素200IU/mL，链霉素200IU/mL。
A.3细胞分散液
胰蛋白酶
乙二胺四乙酸二钠(EDTA)
无钙镁PBS
混匀抽滤除菌。
A.4无钙镁PBS
氯化钠
氯化钾
无水磷酸氢二钠
无水磷酸二氢钾
加蒸馏水
1000mL
至1000mLWww.bzxZ.net
将上述成分依次溶解、分装、高压灭菌（68.94kPa15min)或抽滤除菌备用。8
附录B
(规范性附录）
琼脂凝胶免疫扩散试验试剂配制B.1磷酸盐缓冲液(0.05mol/LpH7.2)一水磷酸二氢钠(NaH,PO：·H,O)七水磷酸氢二钠(NazHPO，·7H,O)氟化钠(NaCI）
加蒸馏水
至1000mL
将上述成分依次溶解、分装、高压灭菌（68.94kPa15min)或抽滤除菌备用。B.2琼脂糖平板的制备
琼脂糖凝胶的配方：
琼脂糖
氯化钠
1%硫柳汞
磷酸盐缓冲液（0.05mol/LpH7.2）1.0 g
SN/T1315—2010
将琼脂糖凝胶在水浴中充分煮沸融化，冷却至50℃～60℃时，将经干热灭菌的直径为90mm的洁净平皿置于水平台面上，然后每个平皿加人15mL～17mL液体，注意不要产生气泡，凝胶板厚度约为2mm，静置10min～15min，待凝固后加盖，将平皿例置，防止水分蒸发，置4℃冰箱保存备用，平板最好在24h内使用。
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