SN/T 2436-2010 山羊和绵羊布鲁氏菌病检疫规程 SN/T2436-2010 标准下载解压密码：www.bzxz.net

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T2436—2010
山羊和绵羊布鲁氏菌病检疫规程Protocol of quarantine for Brucella in sheep and goat2010-01-10发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2010-07-16实施
SN/T2436—2010
本标准参考OIE《陆生动物诊断试验和疫苗手册》(2008版）第2.7.2章“山羊和绵羊布氏杆菌病”和第2.7.9章“绵羊型布氏杆菌病”编写而成。本标准的附录F、附录G为规范性附录，附录A、附录B、附录C、附录D、附录E、附录H、附录I、附录」为资料性附录。
本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国天津出入境检验检疫局、中华人民共和国内蒙古出人境检验检疫局、中华人民共和国山东出人境检验检疫局。本标准主要起草人：王玉玲、姜红、赵林立、岳志芹、赵祥平、陈本龙、肖妍、葛含光、刘红梅、宋玉丽。本标准系首次发布的出人境检验检疫行业标准。范围
山羊和绵羊布鲁氏菌病检疫规程SN/T2436—2010
本标准规定了山羊和绵羊布鲁氏菌病的虎红平板凝集试验、试管凝集试验、补体结合试验、酶联免疫吸附试验、琼脂扩散试验等技术要求。本标准适用于山羊和绵羊牛种、羊种、绵羊种布鲁氏菌病的检疫。2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用标准，然面
是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件GB/T6682分析实验室用规格和试验方法GB16548病害动物和病害动物产
参见附录A。
临床症状与病理变化
参见附录B。
被检血清样品采集
采血和分离
按常规方法采血和分离血清
5.2运送和保存
品生物安全
理规程
青应新鲜，
，无明显蛋白凝
防止血清冻结和受热，若3内不能保存备用。
实验室检验
6.1山羊和绵羊牛种、羊种布氏杆菌病实验
注日期的引用文件，其随后所有励根据本标准达成协议的各方研究实最新版本适用于本标准。
血和无腐败气味。
6.1.1虎红平板凝集试验（rosebengalplateagglutinationtest，RBT）6.1.1.1
试剂和材料
6.1.1.1.1
6.1.1.1.2
6.1.1.1.3
6. 1.1. 1. 4
送血清。血清应放至4℃冰箱内
抗原：按说明书使用，使用前置室温（22℃～25℃）30min～60min，并充分摇匀。阳性对照血清：冻于品：使用前按说明用蒸馈水溶解至规定容积。阴性对照血清：冻干品，使用前按说明用蒸馏水溶解至规定容积。玻璃板：约45cm×30cm，要求洁净，划成32个方格，横数8个格，纵数4个格，每格4cm×4cm，每一格下再划1cm宽的小格，用于填写血清号。6.1.1.1.5
6. 1.1. 1.6
牙签：扁形圆头或类似小棒。
移液器：吸取量25μL、75μL。试验程序
6. 1.1.2. 1
试验前血清应置室温（22℃～25℃）30min60min。1
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6.1.1.2.2将玻璃板上各格标上被检血清号，然后加人相应的被检血清75μL。6.1.1.2.3在被检血清旁加25μL虎红平板凝集抗原。6.1.1.2.4用牙签搅动被检血清和抗原使之均匀混合，形成直径约2cm的液区。轻微摇动，室温下于4min内观察结果，同时作阳性血清和阴性血清对照。6.1.1.2.5每次操作以不超过20份血清样品为宜，以免样品干燥而不易观察结果。6.1.1.3判定
当阴性血清对照不出现凝集（一），阳性血清对照出现凝集（十）时，则试验成立，可以判定。否则应重做。
在4min内出现肉眼可见凝集现象者判为阳性（十），不出现凝集者判为阴性（一）。出现阳性反应的样品，还需经补体结合试验或其他辅助试验方可定性。6.1.2试管凝集试验（tubeagglultinationtest,SAT）6.1.2.1试剂和材料
6.1.2.1.1稀释液：0.5%石碳酸的10%盐溶液（含0.5%石碳酸、10%氯化钠溶液）。抗原：按照说明书使用。使用时充分摇匀，用稀释液作1：20(工作浓度)稀释。6.1.2.1.2
6.1.2.1.3
6.1.2.1.4
阳性对照血清：冻干品，使用前用蒸馏水溶解至规定容积。阴性对照血清：冻干品，使用前用蒸馏水溶解至规定容积。6.1.2.1.5
试管架。
6.1.2.1.6
6.1.2.1.7
玻璃试管：规格为13mm×100mm，圆底，洁净。微量移液器。
6.1.2.1.8
可调连续加样器。
6.1.2.2试验程序
6.1.2.2.1稀释被检血清
被检血清的最终稀释度为1：25、1：50、1：100、1：200。大规模检疫时可用1：25、1：50稀释度。为测定强阳性血清效价，稀释度可以增加。每份被检血清用4支试管，标记检验编号后第1管加1.15mL稀释液，第2～4管各加入0.5mL稀释液。取被检血清0.1mL，加人第1管，充分混匀后吸弃0.25mL。从第1管中吸取0.5mL加入到第2管，混合均匀后，再从第2管吸取0.5mL至第3管，如此倍比稀释至第4管，从第4管弃去0.5mL，稀释完毕。从第1至第4管的血清稀释度分别为1：12.5、1：25、1：50、1：1006.1.2.2.2加抗原
将0.5mL抗原(1：20)加入已稀释好的各血清管中，并振据均匀。各管血清稀释度则依次变为1：25、1：50、1：100、1200。各反应管反应总量为1mL。6.1.2.2.3设立对照
每次试验都应设立下列对照。
阴性对照：阴性对照血清的稀释和加抗原的方法与被检血清同。阳性对照：阳性对照血清的最高稀释度应超过其效价滴度，加抗原的方法与被检血清同。抗原对照：在0.5mL稀释液中，加0.5mL抗原（1：20）。6.1.2.2.4配制比浊管
每次试验均应配制比浊管，作为判定凝集反应程度的依据，先将抗原（1：20)用等量稀释液作一倍稀释，然后按表1配制比浊管。
试管号
抗原稀释液1：40
0.5%石碳酸生理盐水
清亮度/%
凝集度标记
比浊管的配制
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注：++十+完全凝集，菌体100%下沉，上层液体100%清亮。十十+几乎完全凝集，上层液体75%清亮。+十凝集很显著，液体50%清亮。十有沉淀，液体25%清亮。一无沉淀，液体不清亮。6.1.2.2.5
所有试验管充分振荡后，置37℃温箱感作20h。6.1.2.3判定
比照比浊管判读，出现十十以上凝集现象的最高血清稀释度为血清凝集价。当阴性血清对照和抗原对照不出现凝集（一），阳性血清的凝集价达到其标准效价士1个滴度，则证明试验成立，可以判定。否则，试验应重做。山羊和绵羊于1：50血清稀释度出现“十十”以上的凝集现象时，被检血清判定为阳性反应。需要采用国际凝集单位表示试验结果时，可参照附录C中的换算公式换算成国际凝集单位。6.1.3补体结合试验（complementfixationtest，CFT）6.1.3.1
试剂和材料
6.1.3.1.1试剂
6. 1.3.1. 1.1
6.1.3.1.1.2
6.1.3.1.1.3
6.1.3.1.1. 4
6. 1.3. 1. 1.5
6.1.3.1.1.6
6.1.3. 1.1.7
6.1.3.1.1.8
蒸馏水：GB/T6682中的三级水。稀释液：灭菌生理盐水。
补体结合抗原：按说明书使用，使用前充分播匀。阳性对照血清：使用前用蒸馏水溶解至规定容积。阴性对照血清：使用前用蒸馏水溶解至规定容积。溶血素：使用前用蒸馏水溶解至规定容积。补体：使用前用蒸馏水溶解至规定容积。绵羊全血：选健康成年绵羊，无菌颈静脉采血，60mL阿氏液中加人40mL血，混勾，4℃冰箱内保存5d后备用。
6.1.3.1.2
6.1.3. 1.2.1
6.1.3.1.2.2
6.1.3.1.2.3
6.1.3.1.2.4
6.1.3.1.2.5
6.1.3.1.2.6
6.1.3.1.2.7
6.1.3.1.2.8
6. 1.3.1.2.9
玻璃试管：10mm×75mm，圆底，洁净。试管架。
可调微量移液器。
可调连续加样器。
96孔“U\型微量板。
96孔平底（)微量板。
水平转子离心机。
酶标仪。
水浴箱。
6.1.3.2预备试验
6.1.3.2.13%绵羊红细胞悬浮液的制备6.1.3.2.1.1绵羊全血充分混匀后，取所需量用稀释液洗三次，每次水平转子离心机500g离心5min，最后一次离心10min。
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6.1.3.2.1.2
6.1.3.2.1.3
6.1.3.2.1.4
6.1.3.2.1.5
式中：
取1份下沉血泥加人到24份稀释液中，充分混匀，制成红细胞悬浮液取出250μL红细胞悬浮液加人到4.75mL蒸馏水中，使红细胞充分破解（液体清亮）。取100μL加人到平底微量板孔内，纵向加8个孔。用酶标仪540nm下读OD值，算出平均OD值，代入校正红细胞浓度见式（1)：A=
稀释液加人量；
平均OD值；
红细胞悬浮液量。
取校正红细胞浓度时
所需的稀释液量加入到红细胞悬6. 1.3.2. 1.6
6.1.3.2.2
溶血素效价的测定
稀释溶血素
6.1.3.2.2.1
取0.2mL溶血素原液，加入到19.8mL稀释液同稀释倍数的溶血素。
稀释倍数
1:1000
1:1500
1:2000
1:3000
1:5000
1:10000
注；如果溶血素是由等量甘油保6.1.3.2.2.2
制备不同稀释倍数
取7个试管，每管加1.5mL
1.5mL，混匀，37℃水浴箱中感作溶血素效价的确定
6.1.3.2.2.3
制成1：
溶血素的稀释
1:100溶血素
1:100落血素2.0
100格系0.5
1:100溶血
·1000
血素原酒
血素1.0
溶血素
文红细月
中倍，并相应
液中即得3%红细胞悬浮液。www.bzxz.net
稀释的溶血素，再按表2稀释成不生理盐水/mL
的红细胞悬浮
液，然后分别缓
将补体原液预稀释至1：150，按表3进行测定。表3
试管号
稀释液/mL
1/150补体/mL
不同稀释液倍数致敏红细胞/mL
溶血素稀释倍数
冷穆释液/mL
溶血素效价测定
1/1000
1/1500
1/2000
释液量。
慢加人不同稀释倍数的溶血素
1/3 000
1/5 000
37C水浴30min（每间隔5min振1次）2.0
1/10 000
将各管用水平转子离心机500g离心3min，取上清液100μL分注平底微量板，540nm下读OD按OD值×100/0.115算出各管溶血度，在普通坐标纸上以溶血素的稀释度为横坐标，溶血度为纵值。
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坐标，绘制曲线，确定出现平高线的点，比此浓度高25%的稀释度定为溶血素的工作效价（即为1.25倍，溶血素稀释倍数80%=溶血素工作效价)（参见附录D)。6.1.3.2.3制备致敏红细胞悬浮液按测定的溶血素效价稀释溶血素，缓慢加入到等量的3%绵羊红细胞悬浮液中，混合均匀，置37℃水浴箱中感作15min。
6.1.3.2.4补体效价的测定
补体预稀释至1/150，做2组重复管，按表4进行测定。表4
补体效价测定
试管号
1/150补体/mL
稀释液/mL
第一次感作
致敏红细胞/mL
第二次感作
冷稀释液/mL
将各管用水平转子离心机500
#间隔5min振1次）
0.115计算出各管的溶血度（Y)，在双对数坐标纸上以Y/100Y
一直线，找出50%溶血时补体的用单位
量，即得出本试验补体工作效价（含2.5个C\Hso单位)（参见附录E)。6.1.3.2.5抗原效价的测定
6.1.3.2.5.1
30min。
6.1.3.2.5.2
阳性对照血清和阴
然后将阳性对照血
6.1.3.2.5.3
将抗原从1/10作
6. 1.3.2.5. 4
建立方阵试验：
+25μL补体-37℃振荡感作4
对照、抗原对照、补体对照（见附录记录测定结果：取出
6.1.3.2.5.5
血清分
释（见附
型微量
孔的配制见附录G)比较，观察溶血度，记用稀释液价
中进行。
数红细胞
转子离
读OD值，按平均OD值×100/
黄坐标，补体用量为纵坐标，制成释倍数/10×50%溶血时补体用
10稀释，置60℃水浴箱中灭活
试验利
序：25uL血清+25uL抗原
振荡感作30min，同时设立血清
g离心3min，与标准比色孔（比色抗原效价的确定：在对照成立时，与阳性对照血清各稀释度发生抑制溶血最强的抗原最6.1.3.2.5.6
高稀释度为抗原效价，即为1个单位抗原，本试验抗原使用1个单位为其工作效价。6.1.3.3正式试验
6.1.3.3.1溶血素、抗原、补体按预试验测定的工作效价稀释。6.1.3.3.2在玻璃试管中将被检血清和阳性对照血清、阴性对照血清做1/10稀释后，置60℃水浴箱中灭活30min。
6.1.3.3.3将灭活后的血清在“U”形微量反应板中从1/10开始进行倍比稀释。一般阳性对照血清做六个稀释度，阴性对照血清可做三个稀释度。被检血清在做筛选试验时一般作一个稀释度，在做确证试验时一般作六个稀释度。
6.1.3.3.425μL血清+25μL抗原+25μL补体-→37℃振荡感作40min-→+加25μL致敏红细胞-→37℃振荡感作30min，同时建立阳性对照、阴性对照、血清抗补体对照、抗原对照、补体对照和红细胞对照（见表5)。
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6.1.3.3.5
取出微量反应板，水平转子离心机500g离心3min，比照标准比色孔，记录结果。表5
血清效价的测定
血清试验孔
血清/μL
抗原/μL
稀释液/μL
补体/μL
第一次感作
致敏红细胞/μL
第二次感作
6.1.3.4判定
抗补体
37℃振荡40min
37振满30min
补体对照
比照标准比色孔判读，达到50%抑制溶血时血清的最高稀释度为该血清的效价。0.625
各对照的结果成立时，可进行判定。否则，补体的效价应重新测定，并重新做6.1.3.3试验。阳性对照：阳性对照血清效价与已知效价或预测效价变化范围不超过一个滴度。阴性对照：100%溶血。
红细胞
血清抗补体对照：抗补体对照孔100%溶血（如果抗补体对照孔与试验孔的抑制溶血程度相同说明该血清为抗补体)。
抗原对照：100%溶血。
补体对照：2.5个单位补体对照：100%溶血。1.25个单位补体对照：部分溶血。0.625个单位补体对照：不溶血。红细胞对照：不溶血。
阳性判定：一般被检血清稀释1/10以上达到50%抑制溶血时判为阳性。阴性判定：一般被检血清稀释1/10小于50%抑制溶血时判为阴性。6.1.4间接酶联免疫吸附试验（indirectenzymelinkedimmunosorbentassay，iELISA）参见附录H。
6.1.5竞争酶联免疫吸附试验（competitiveenzymelinkedimmunosorbentassay，cELISA）参见附录I。
6.2绵羊种布鲁氏菌病
6.2.1补体结合试验(CFT)
方法参见6.1.3。
6.2.2琼脂扩散试验（AGID)
6.2.2.1试剂
6.2.2.1.1琼脂糖：分析纯。
氯化钠：分析纯。
6.2.2.1.2
硼酸盐缓冲液：硼酸12.4g（分析纯）、氯化钾（14.5g）、蒸馏水1600mL,用0.2mol/L氢6.2.2.1.3
氧化钠调pH值至8.3，最后补加蒸馏水至2000mL。6
6.2.2.1.4阳性对照血清。
6.2.2.1.5抗原。
6.2.2.2材料
6.2.2.2.1平皿：规格90mm×15mm，一次性平血或洁净灭菌的玻璃平血。6.2.2.2.2七孔打孔器：孔径3mm，孔距3mm。6.2.2.3试验程序
6.2.2.3.1琼脂平板的制备
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分别取琼脂糖1g、氯化钠10g、硼酸盐缓冲液100mL，加人到三角瓶中，在水浴中充分煮沸溶解，冷却至56℃左右，将平皿置于水平台上，每个平血将15mL（厚约2.5mm），凝固后加盖，把皿倒置，放4℃冷藏保存备用。
6.2.2.3.2打孔
反应孔现用现打，从冰箱中取品出制备好的琼脂平板，待平板恢复室温（20℃～25℃）后，用打孔器打孔，将孔中的琼脂柱用针头轻轻挑出或吸出，勿伤边缘。每个平板可打5组～7组孔。6.2.2.3.3加样
用可调微量移液器加样，可参见图1加样检血清。每孔均以加满而不溢出为度6.2.2.4判定
6.2.2.4.1于24h初判，48h终
当阳性对照血清孔
6.2.2.4.2
试验。
6.2.2.4.3如果被检血清孔与
端相融合，则判为阳性（见图2)。京原汇
“G”孔加
后将琼脂
时借取
向形成
铜形成
淀线，
原，“十”孔加阳性对照血清，其他孔均加被人有湿纱布的带盖的湿盒内，置室温中感作。、致密
直与阳性
时，本试验成立，否则需要重新做精孔和抗原孔间形成的沉淀线末6.2.2.4.4如果被检血清孔与抗原孔间无沉淀线形成，但阳性对照血清孔与抗原孔间形成的沉淀线末端在被检血清孔与抗原孔间向抗原孔侧弯曲，则判为弱阳性。应重复试验，仍为弱阳性者判为阳性（见图3)。
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5如果被检血清孔与抗原孔间形成的沉淀线和阳性对照血清孔与抗原孔之间形成的沉淀线6.2.2.4.5
交叉，则为非特异性沉淀线，应重复试验，仍出现非特异性沉淀线者判为阴性(见图4)。x
6.2.2.4.6如果被检血清孔与抗原孔间无沉淀线出现，阳性对照血清孔与抗原孔形成的沉淀线末端直伸向被检血清孔则判为阴性（见图5）。+
6.2.3间接酶联免疫吸附试验（iELISA)参见附录了。
综合判定
临床症状明显，用第6章中任一试验获阳性结果时，可判定动物为布鲁氏菌病感染。附录A
(资料性附录）
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山羊和绵羊布鲁氏菌病（Brucella）是由布氏杆菌（Brucellosis）引起的一种人畜共患病。病原主要三种一羊种布氏杆菌（Brucellosismeligensis）、绵羊种布氏杆菌（Brucellosisouis）和牛种布氏杆菌（Brucellosisabortus）。羊种布氏杆菌是山羊和绵羊布鲁氏菌病的主要病原。绵羊种布氏杆菌只引起绵羊发病，目前未见山羊有自然发病的病例。牛种布氏杆菌也可引起山羊和绵羊发病，但为偶尔发生。山羊和绵羊布鲁氏菌的检疫主要以临床症状、流行病学资料和病理变化为初步诊断，确诊主要依据实验室检验结果。目前，实验室检验主要检测血清中抗布氏杆菌抗体。检测羊种布氏杆菌抗体最常用的血清学方法有虎红平板凝集试验（RBT)和补体结合试验（CFT)，是国际贸易指定试验。感染畜群的筛选试验或保证畜群无布氏杆菌感染时适合采用RBT，但对动物个体的确诊还需要结合CFT的结果。CFT现多采用微量法。酶联免疫吸附试验（ELISA)现已有间接酶联免疫吸附试验和竞争酶联免疫吸附试验，其敏感性和特异性均高于凝集试验和补体结合试验，但诊断试剂还需要标化，因此现还未被推荐为国际贸易指定试验。检测绵羊种布氏杆菌抗体的血清学方法有琼脂扩散试验（AGID)、CFT和ELISA。CFT是国际贸易指定试验。但现已确定AGID的敏感性同CFT，而且操作简单。ELISA虽然没有标化，但许多独立的研究结果表明ELISA比CFT和AGID更敏感、特异。目前，在国际贸易中仍要求对山羊和绵羊进行牛种布氏杆菌抗体检测，指定的血清学方法主要有试管凝集试验和补体结合试验。
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