SN/T 2531-2010
基本信息
标准号： SN/T 2531-2010
中文名称：贝类和水样中札如病毒检测方法
标准类别：商检行业标准(SN)
标准状态：现行
出版语种：简体中文
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标准简介
SN/T 2531-2010 贝类和水样中札如病毒检测方法
SN/T2531-2010
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标准内容
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T2531—2010
贝类和水样中札如病毒检测方法普通
RT-PCR方法和实时荧光RT-PCR方法Determination of Sapovirus in shellfish and water-Conventional RT-PCR and real-time RT-PCR2010-03-02发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2010-09-16实施
本标准附录A为规范性附录，附录B为资料性附录本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国上海出入境检验检疫局。本标准主要起草人：潘良文、卢钟山、邓恬宁、吕蓉、张舒亚、李想、刘月明、高琴。本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准http：//foodmate.netSN/T2531—2010
1范围
贝类和水样中札如病毒检测方法普通RT-PCR方法和实时荧光RT-PCR方法SN/T2531—2010
本标准规定了贝类和水样中札如病毒普通RT-PCR方法和实时荧光RT-PCR方法。本标准适用于贝类和水样中札如病毒的定性检测。2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。SN/T1193基因检验实验室技术要求3术语和定义
下列术语和定义适用于本标准。3.1
Ct值cycle threshold
每个反应管内的荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数。3.2
质粒标准分子plasmidreferencemolecule一种包含病毒特异性cDNA片段的重组质粒分子，可作为病毒PCR检测中的阳性对照。4方法提要
用合适的裂解液（如Tri-reagent）提取贝类样品中病毒RNA，并根据札如病毒RNA3'末端含有Poly（A)的结构·用连接Oligo(dT）的磁珠特异性吸附札如病毒RNA进行纯化。对水样中的病毒进行富集后，采用合适的方法提取和纯化病毒RNA。利用普通RT-PCR或实时荧光RT-PCR方法进行检测。本研究通过构建质粒标准分子（每个质粒分子包含1拷贝扩增片段），确定札如病毒普通RTPCR体系检测下限为100拷贝，实时荧光RT-PCR体系检测下限均为10拷贝，5试剂
所有实验用试剂均为分析纯；除特别说明外，实验用水为蒸馏水或去离子水。5.1阳性标本：札如病毒，一80℃冰箱保存；或含札如病毒检测目的片段的质粒标准分子，一20℃冰箱保存。
5.2甘氨酸缓冲液：见附录A.1.1。5.3PEG8000溶液：见附录A.1.2。5.4裂解液：Tri-reagent或其他等效裂解液（如：TRIzol)。5.5Oligo(dT)2磁珠：Dynabeads-oligo(dT）2或等效品。5.6超纯水（无RNase和DNase污染）：见附录A.2.3。5.775%乙醇：见附录A.2.4。
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三氯甲烷。
异丙醇。
5.101XRNA吸附缓冲液：见附录A.2.5。5.112XRNA吸附缓冲液：见附录A.2.6。5.12
漂洗缓冲液：见附录A.2.7。
TaKaRaRNAPCRKit(AMV)Ver3.0,TaKaRa,Cat.No.DRRo19A5.14PremixExTaqTM（PerfectRealTime）及配套ROX荧光校正试剂（50X）,TaKaRa，Cat.No.DRR039A。
5.15引物和探针：根据表1和表2的序列合成引物和探针，加超纯水（无RNase和DNase污染）配制成10μmol/L储备液。
表 1札如病毒普通 RT-PCR检测引物名称
SLV5317
SLV5749
5'-CTCGCCACCTACRAWGCBTGGTT-35-CGGRCYTCAAAVSTACCBCCCCA-3
注：R:A/G:W:A/T:B:G/T/C;Y:C/T:V:G/A/C;S:G/C。表2札如病毒实时荧光RT-PCR检测引物和探针引物和探针
注1:Y.C/T:S.G/C:R.A/G
SaV124F
SaV1245R
SaV124TP
SaV5TP
扩增片段大小/bp
5'-GAYCAS GCTCTCGCYACC TAC-3\5-TTGGCCCTCGCCACCTAC-3
5'-TTT GAA CAA GCT GTG GCA TGC TAC-3'5'-CCCTCCATYTCAAACACTA-3'
5-FAM-CCRCCTATRAACCA-MGB-3
5°-FAM-TGC CAC CAA TGT ACC A-MGB-3\注2：探针也可选用具有与FAM和MGB荧光基团相同检测效果的其他合适的荧光报告基团和荧光淬灭基团组合。
5.16DNA相对分子质量标记：DL2000（显示条带范围100bp～2000bp）或其他具有相近DNA条带显示范围的相对分子质量标记。5.1750×TAE缓冲液：见附录A.1.35.18
溴化乙锭（EB）溶液（10mg/mL）：见附录A.1.4含0.5μg/mL漠化乙锭（EB)的1.5%琼脂糖凝胶：见附录A.1.5。10×加样缓冲液：见附录A.1.6。QIAampViralRNAMiniKit.Qiagen.Cat.No.52904.见附录A.2.8。6仪器
实时荧光PCR仪。
6.2PCR仪。
6.3电泳仪。
凝胶成像分析系统。
6.5冷冻离心机。
http:
6.6匀浆器。bzxz.net
6.7恒温孵育器
6.8振荡器。
6.9微量加样器：2.5μL、10μL、100μL、200μL和1mL。6.10高压灭菌锅。
6.11生物安全柜。
6.12-80℃冰箱，-20℃冰箱，
6.13无RNase和DNase污染的玻璃容器：见A.2.1。SN/T2531—2010
6.14无RNase和DNase污染的离心管（1.5mL、15mL、50mL），无RNase和DNase污染的移液器吸嘴（10μL、200μL1mL），无RNase和DNase污染的药匙，无RNase和DNase污染的0.2mLPCR扩增反应管：见A.2.2。
6.15磁性抽提架。
6.16已灭菌直径为47mm，孔径为0.45um的乙酸/硝酸混合纤维素滤膜[密理博（上海）贸易有限公司.Cat.No.R7SN201861及配套过滤器。6.17无菌一次性50mL针管。
6.18聚乙烯薄膜袋：50mm×70mm自封袋，使用前紫外杀菌20min。7检测方法
7.1实验室要求
实验室设施应达到SN/T1193实验室技术要求7.2样品制备和札如病毒RNA提取7.2.1贝类样品中札如病毒RNA提取7.2.1.1小心切开贝类样品组织，解剖取下贝类的肠腺组织。7.2.1.2取5g左右中肠腺组织加入35mL甘氨酸缓冲液。7.2.1.3使用匀浆器高速匀浆3min～5min，使肠腺组织完全被打碎并与缓冲液混合均匀，将匀浆液装人50mL离心管，250r/min37℃或室温振荡30min。7.2.1.4将样品勾浆液于4℃.10000g离心30min。7.2.1.5移取上清液至一新的50mL离心管，加入等体积的PEG8000溶液，颠倒混5次。冰上放置至少1h后，4℃，10000g离心5min，弃尽上清液，保留沉淀。7.2.1.6向沉淀中加人5mL裂解液，剧烈振荡30s，室温放置5min7.2.1.7转移溶液至一15mL离心管，加人1.2mL三氯甲烷，剧烈振荡30s，室温放置5min12000g离心5min，吸取上清液至另一15mL离心管。7.2.1.8向上清液中加人0.5倍体积（约2.5mL）异丙醇，颠倒混匀后，室温放置5min，4℃，5000g离心5min。
7.2.1.9弃尽上清液，用5mL，4℃预冷的75%乙醇洗涤沉淀。7.2.1.10重复步骤7.2.1.9两次，最后一次弃尽上清液。沉淀重悬于300μL超纯水（无RNase和DNase污染）中，将悬液转移至一1.5mL离心7.2. 1. 11
管中。
2加人400μL1XRNA吸附缓冲液，振荡30s，60℃放置3min。7.2.1.12
3加入100uLOligo（dT）2磁珠，轻柔混合，磁性抽提架上放置1min7.2.1.14
奔尽上清液.加人500uL2×RNA吸附缓冲液，室温下晃动5min洗涤。7.2.1.15
离心管在磁性抽提架上放置1min，弃尽上清液。加人500uL漂洗缓冲液，颠倒混匀5次，离心管在磁性抽提架上放置1min，弃去上清液3
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7.2.1.16重复步骤7.2.1.15三次。7.2.1.17沉淀用100μL超纯水（无RNase和DNase污染）悬浮，90℃放置2min释放RNA。离心管在磁性抽提架上放置1min。将上清液移至另一1.5mL离心管中，可即吸取5uL进行RT-PCR检测7.2.2水样中札如病毒RNA提取（使用Qiagen公司QIAampViralRNAMiniKit）7.2.2.1用50ml针管分次取100mL~200mL水样过直径为47mm，孔径为0.45um的乙酸/硝酸混合纤维素滤膜，小心取出滤膜，平整放于聚乙烯薄膜袋中。7.2.2.2向薄膜袋中加人1130μLBufferAVL-carrierRNA混合液.使滤膜充分浸于缓冲液中，剧烈振荡15s~30s，室温浸泡滤膜20min30min后，小心将液体完全转移到15mL离心管中。7.2.2.3（可选步骤）若回收液体中存在明显可见的固体物质.4000g离心3min，转移上清液至一新15mL离心管中。
7.2.2.4加人1120μL无水乙醇，剧烈振荡15s.5000g离心15s收集液体7.2.2.5将上述液体630μL转移至带有2mL收集管的离心柱中，6000g离心1min，弃收集管中液体。
7.2.2.6重复步骤7.2.2.5，直至所有混合液均通过离心柱，最后一次离心后将离心柱放入一新2mL收集管中。
7.2.2.7加人500μLBufferAW1.6000g离心1min，将离心柱放入一新2mL收集管中。7.2.2.8加人500μLBufferAW2,20000g离心3min。7.2.2.9将离心柱放人一新2mL收集管中，20000g离心1min以彻底除去残余在离心柱膜上液体。7.2.2.10将离心柱放人一新1.5mL离心管中，小心的在离心柱膜中央加入60μLBufferAVE，室温放置1min~2min，6000g离心1min。1.5mL离心管中的液体即为提取的病毒RNA样品可即吸取5μL进行RT-PCR检测。
7.3RT-PCR检测
7.3.1普通RT-PCR
7.3.1.1普通RT-PCR反应体系
病毒RNA逆转录为cDNA的反应体系见表3,PCR反应体系见表4。反应体系中各试剂的量可根据不同试剂盒进行适当调整。每个反应体系设置两个平行反应。以札如病毒cDNA或含机如病毒检测目的片段的质粒标准分子DNA作为阳性对照模板，以不含有札如病毒cDNA或札如病毒检测目的片段的质粒标准分子DNA的样品作为阴性对照模板，以水代替DNA模板作为空白对照。表3病毒RNA逆转录反应体系2）
逆转录反应缓冲液
氯化镁（MgCl）
RNase抑制剂
通转录酶
随机引物
储液浓度
25mmol/L
各10mmol/L
5U/μL
5U/μL
20μmol/L
终浓度
5mmol/L
各1mmol/L
0.125U/μL
0.25U/μL
1 pmol/L
使用量/μL
1）水样中病毒RNA的提取方法是针对QIAampViralRNAMiniKit，Qiagen.Cat.No.52904给出的，给出这一信息是为了方便本标准使用者，并不表示只认可该产品，如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用等效产品。2）该反应体系针对TaKaRaRNAPCRKit（AMV）Ver3.0，TaKaRa.Cat.No.DRRo19A给出，给出这一信息是为了方便本标准使用者，并不表示只认可该产品，如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用等效产品。ht
OligodTPrimer
模板RNA
超纯水（无RNase和DNase污染）总体积
PCR反应缓冲液
氯化镁（MgCl）
引物SLV5317
引物SLV5749
TaqDNA聚合酶
超纯水（无RNase和DNase污染）总体积
表3（续）
储液浓度
2.5μmol/L
终浓度
0.125umol/L
表4札如病毒普通PCR反应体系2
储液浓度
25mmol/L
2.5mmol/L
10μmol/L
10μmol/L
5U/μL
普通RT-PCR反应参数
终浓度
4mmol/L
0.06mmol/L
0.2μmol/L
0.2μmol/L
0.05U/μL
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使用量/μL
使用量/uL
病毒RNA逆转录为cDNA的反应参数：30℃，10min；42℃，60min；99℃，5min；5℃，5min;
普通PCR反应参数：94℃5min94℃.30s，55℃，30s，72℃，40s，45个循环；72℃.5min。7.3.1.3PCR产物的琼脂糖凝胶电泳检测将适量50XTAE稀释成1XTAE溶液，配制溴化乙锭含量为0.5ug/mL的1.5%琼脂糖凝胶取PCR产物15uL，加1.5uL上样缓冲液点样进行电泳，并在其中一孔道加入DNA分子量标记以判断PCR产物的片段大小。电压大小根据电泳槽长度来确定，一般控制在3V/cm～5V/cm，当溴酚蓝移动到凝胶边缘时关闭电源，电泳检测结果用凝胶成像分析系统记录。7.3.1.4普通RT-PCR检测下限
札如病毒的普通RT-PCR体系检测下限为100拷贝质粒标准分子DNA。7.3.2实时荧光RT-PCR
7.3.2.1实时荧光RT-PCR反应体系病毒RNA逆转录为cDNA的反应体系见表3，PCR反应体系见表5。每个反应体系设置两个平行反应。以札如病毒cDNA或含札如病毒检测目的片段的质粒标准分子DNA作为阳性对照模板，以不含有札如病毒cDNA或札如病毒检测目的片段的质粒标准分子DNA的样品作为阴性对照模板，以水代替DNA模板作为空白对照。
1）反应参数可根据不同型号PCR仪及PCR反应体系作适当调整。2）该反应体系针对TaKaRaRNAPCRKit（AMV）Ver3.0，TaKaRa.Cat.No.DRRo19A给出.给出这一信息是为了方便本标准使用者，并不表示只认可该产品，如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用等效产品。5
http
TEITETT
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表 5札如病毒实时荧光PCR反应体系1储液浓度
Premix Ex TaqTM(Perfect Real Time)SaV124F
SaV1245R
SaV124TP
SaV5TP
ROX荧光校正试剂
超纯水（无RNase和DNase污染）总体积
10μmol/L
10μmol/L
10μmol/L
10μmol/L
10μmol/L
10μmol/L
终浓度
0.32μmol/L
0.32μmol/L
0.32μmol/L
0.32μmol/L
0.032μmol/L
0.032μmol/L
a该试剂只在具有ROX荧光校正通道的实时荧光PCR仪上进行扩增时添加，否则用水补齐7.3.2.2实时荧光RT-PCR反应参数2加样量/μL
病毒RNA逆转录为cDNA的反应参数：30℃.10min；42℃60min；99℃，5min；5℃，5min;
实时荧光PCR反应参数：95℃，10S；95℃，5S，60℃，31S，45个循环。7.3.2.3实时荧光RT-PCR检测下限札如病毒实时荧光RT-PCR体系检测下限为10拷贝质粒标准分子DNA。8
结果判断及表述
8.1结果判定
8.1.1普通RT-PCR
阴性对照和空白对照未出现条带，阳性对照出现434bp的目的扩增条带则表明反应体系运行正常，否则需重新进行普通PCR扩增：对样品进行普通RT-PCR检测，如果阴性对照和空白对照未出现条带，阳性对照出现434bpb）
的扩增条带，而样品未出现扩增条带，则可判定样品未检出札如病毒；c)
如果阴性对照和空白对照未出现条带，阳性对照和样品出现434bp的扩增条带，对PCR产物进行测序分析比对，PCR产物核酸序列与相应的札如病毒cDNA序列相-致，则可判定样品检出札如病毒。也可采用本标准中实时荧光RT-PCR的方法进行确证。8.1.2实时荧光RT-PCR
阴性对照和空白对照无荧光增幅现象，阳性对照有荧光增幅现象则表明反应体系运行正常，否则需重新进行实时荧光PCR扩增：
若待检测样品无荧光增幅现象，则判定样品未检出札如病毒；若待检测样品有荧光增幅现象，且Ct值≤40时，则可判定样品检出札如病毒；b）
该反应体系针对PremixExTagTM（PerfectRealTime）及配套ROX荧光校正试剂（50X），TaKaRa，Cat.No1
DRR039A给出，给出这一信息是为了方便本标准使用者，并不表示只认可该产品，如果其他等效产品具有相同的效果。则可使用等效产品。
2）反应参数可根据不同型号PCR仪及PCR反应体系作适当调整。6
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c）若待检测样品Ct值介于40和45之间时，应重新进行实时荧光RT-PCR检测。重新检测后设定同一域值条件下，若Ct值≥45时，则可判定样品未检出札如病毒。重新检测后的Ct值仍介于40和45之间，则判定样品中含有札如病毒8.2结果表述
8.2.1根据8.1描述判定检出札如病毒，则表述为检出札如病毒或札如病毒阳性8.2.2根据8.1描述判定未检出札如病毒，则表述为未检出札如病毒或札如病毒阴性http：//foodmate.netSN/T2531—2010
A.1普通溶液的配制
附录A
（规范性附录）
溶液的配制
A.1.1甘氨酸缓冲液：含0.1mol/L甘氨酸0.3mol/L氯化钠（NaCI),pH9.5甘氨酸
氯化钠
双蒸水
5mol/L氢氧化钠溶液
调pH至9.5
加双蒸水至1000mL.121℃，15min灭菌备用A.1.2PEG8000溶液：含16%（质量浓度）PEG8000.0.525mol/L氯化钠PEG8000
氯化钠
加双蒸水至100mL，121℃，15min灭菌备用。A.1.350×TAE缓冲液
A.1.3.10.5mol/LEDTA-Na2·2H,0（二水乙二铵四乙酸钠）溶液，pH8.0EDTA-Na2·2H,O
灭菌双蒸水
5mol/L氢氧化钠溶液
调pH至8.0
灭菌双蒸水加至1000mL,121℃,15min灭菌备用。A.1.3.2TAE电泳缓冲液（50×）羟基甲基氨基甲烷(Tris）
冰乙酸
0.5mol/LEDTA-Na溶液，pH8.0
灭菌双蒸水加至1000mL，121℃，15min灭菌备用。使用时用灭菌双蒸水稀释至1×使用。A.1.4溴化乙锭（EB）溶液（10μg/μL）EB
灭菌双蒸水
A.1.5含0.5μg/mL溴化乙锭（EB）的1.5%琼脂糖凝胶琼脂糖
1XTAE电泳缓冲液
加至100mL
混合后加热至完全融化，待冷却至50℃～55℃时，加EB溶液5uL，轻轻晃动摇匀，避免产生气泡，将梳子置人电泳槽中，然后将琼脂糖溶液倒入电泳板上，待完全凝固后（需约40min），取下梳子，备用。
510×加样缓冲液
聚蔗糖
灭菌双蒸水
溴酚蓝
三甲苯青
ht
A.2RNase的去除和无RNase和DNase溶液的配制SN/T2531—2010
配制溶液用的酒精、异丙醇、Tris、EDTA、氯化锂、浓盐酸、氢氧化钠等应采用非开封的新品。配制溶液所用的超纯水、玻璃容器、移液器吸嘴、药勺等用具应无RNase和DNase污染。操作过程中，应自始至终佩戴抛弃式橡胶或乳胶手套，并经常更换，以避免皮肤上的细菌和真菌以及人体自身分泌的RNase污染用具或带人溶液，
A.2.1玻璃容器应在240℃烘烤4h以降解RNase和DNase。A.2.2离心管、移液器吸嘴、药勺等用具应用0.01%的焦碳酸二乙酯（DEPC)水室温浸泡过夜，灭菌，烘干：或直接购买无RNase和DNase的相应规格离心管、移液器吸嘴等用具。A.2.3超纯水（无RNase和DNase污染）超纯水
混合后室温放置过夜，121℃，灭菌15min，或直接购买无RNase和DNase的超纯水。A.2.475%乙醇
无水乙醇
超纯水（无RNase和DNase污染）现配现用。
A.2.51XRNA吸附缓冲液
A.2.5.1 1 mol/L Tris-HCI pH7.5Tris
超纯水（无RNase和DNase污染）36.5%盐酸
1mol/L盐酸
调pH至7.5
加超纯水（无RNase和DNase污染）至10mL，分装到1.5mL无RNase离心管中，一20℃保存。A.2.5.20.5mol/LEDTA-Na2·2HO溶液.pH7.5EDTA-Naz·2H,O
超纯水（无RNase和DNase污染）5mol/L氢氧化钠溶液
调pH至7.5
加超纯水（无RNase和DNase污染）至10mL，分装到1.5mL无RNase离心管中，一20℃保存。A.2.5.35mol/L氯化锂（LiCI)
氯化锂
超纯水（无RNase和DNase污染）2.12g
加超纯水（无RNase和DNase污染）至10mL，分装到1.5mL无RNase离心管中，一20C保存。A.2.5.41XRNA吸附缓冲液：含20mmol/LTris-HCl(pH7.5），1mol/L氯化锂，2mmol/LEDTANaz·2H,O(pH7.5)
1 mol/L Tris-HCI(pH7.5)
5mol/L氯化锂
0.5 mol/L EDTA-Naz .2H,O(pH7.5)超纯水（无RNase和DNase污染）总体积
现配现用。
200μL
2000μL
7760μL
A.2.62×RNA吸附缓冲液：含40mmol/LTris-HCl(pH7.5）.2mol/L氯化锂，4mmol/LEDTANaz·2H,0(pH7.5)
ht
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1mol/LTris-HCI(pH7.5)
5mol/L氯化锂
0.5mol/LEDTA-Naz·2H,O(pH7.5)超纯水（无RNase和DNase污染）总体积
现配现用。
400μL
4000μ
5520μL
A.2.7漂洗缓冲液：含10mmol/LTris-HCl(pH7.5），0.15mol/L氯化锂，1mmol/LEDTA-Naz2H,O(pH7.5)
1mol/LTris-HCl(pH7.5)
5mol/L氯化锂
0.5mol/LEDTA-Na2:2H,O(pH7.5)超纯水（无RNase和DNase污染）总体积
现配现用。
100μL
300μl
A.2.8QIAampViralRNAMiniKit,Qiagen.Cat.No.52904A.2.8.1BufferAVL-carrierRNA混合液从QIAampViralRNAMiniKit中取出装有310ugcarrierRNA冻干粉的试管，小心加人310μLBufferAVE至carrierRNA溶液终浓度为1μg/μL。颠倒试管使carrierRNA完全溶解，并混合均匀。将配制好的carrierRNA分装至多管，每管含量以方便使用为准（如分装为每管20μL，可用于三份样品的RNA提取），储存于一20℃，不可冻融3次以上。配制BufferAVL-carrierRNA混合液，即根据BufferAVL体积的1%加入carrierRNA，如1120μL的BufferAVL.即加入11.2μL的carrierRNA至终体积约1130μL。
A.2.8.2BufferAW1
在第一次使用前，根据QIAampViralRNAMiniKit说明书的要求，向BufferAW1中加入一定体积的无水乙醇，并混合均匀备用。如原BufferAW1为19mL，则加人无水乙醇25mL至终体积44mL。
3BufferAW2
在第一次使用前，根据QIAampViralRNAMiniKit说明书的要求，向BufferAW2中加入一定体积的无水乙醇，并混合均匀备用。如原BufferAW2为13mL，则加人无水乙醇30mL至终体积43mL。
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贝类和水样中札如病毒检测方法普通
RT-PCR方法和实时荧光RT-PCR方法Determination of Sapovirus in shellfish and water-Conventional RT-PCR and real-time RT-PCR2010-03-02发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2010-09-16实施
本标准附录A为规范性附录，附录B为资料性附录本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国上海出入境检验检疫局。本标准主要起草人：潘良文、卢钟山、邓恬宁、吕蓉、张舒亚、李想、刘月明、高琴。本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准http：//foodmate.netSN/T2531—2010
1范围
贝类和水样中札如病毒检测方法普通RT-PCR方法和实时荧光RT-PCR方法SN/T2531—2010
本标准规定了贝类和水样中札如病毒普通RT-PCR方法和实时荧光RT-PCR方法。本标准适用于贝类和水样中札如病毒的定性检测。2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。SN/T1193基因检验实验室技术要求3术语和定义
下列术语和定义适用于本标准。3.1
Ct值cycle threshold
每个反应管内的荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数。3.2
质粒标准分子plasmidreferencemolecule一种包含病毒特异性cDNA片段的重组质粒分子，可作为病毒PCR检测中的阳性对照。4方法提要
用合适的裂解液（如Tri-reagent）提取贝类样品中病毒RNA，并根据札如病毒RNA3'末端含有Poly（A)的结构·用连接Oligo(dT）的磁珠特异性吸附札如病毒RNA进行纯化。对水样中的病毒进行富集后，采用合适的方法提取和纯化病毒RNA。利用普通RT-PCR或实时荧光RT-PCR方法进行检测。本研究通过构建质粒标准分子（每个质粒分子包含1拷贝扩增片段），确定札如病毒普通RTPCR体系检测下限为100拷贝，实时荧光RT-PCR体系检测下限均为10拷贝，5试剂
所有实验用试剂均为分析纯；除特别说明外，实验用水为蒸馏水或去离子水。5.1阳性标本：札如病毒，一80℃冰箱保存；或含札如病毒检测目的片段的质粒标准分子，一20℃冰箱保存。
5.2甘氨酸缓冲液：见附录A.1.1。5.3PEG8000溶液：见附录A.1.2。5.4裂解液：Tri-reagent或其他等效裂解液（如：TRIzol)。5.5Oligo(dT)2磁珠：Dynabeads-oligo(dT）2或等效品。5.6超纯水（无RNase和DNase污染）：见附录A.2.3。5.775%乙醇：见附录A.2.4。
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三氯甲烷。
异丙醇。
5.101XRNA吸附缓冲液：见附录A.2.5。5.112XRNA吸附缓冲液：见附录A.2.6。5.12
漂洗缓冲液：见附录A.2.7。
TaKaRaRNAPCRKit(AMV)Ver3.0,TaKaRa,Cat.No.DRRo19A5.14PremixExTaqTM（PerfectRealTime）及配套ROX荧光校正试剂（50X）,TaKaRa，Cat.No.DRR039A。
5.15引物和探针：根据表1和表2的序列合成引物和探针，加超纯水（无RNase和DNase污染）配制成10μmol/L储备液。
表 1札如病毒普通 RT-PCR检测引物名称
SLV5317
SLV5749
5'-CTCGCCACCTACRAWGCBTGGTT-35-CGGRCYTCAAAVSTACCBCCCCA-3
注：R:A/G:W:A/T:B:G/T/C;Y:C/T:V:G/A/C;S:G/C。表2札如病毒实时荧光RT-PCR检测引物和探针引物和探针
注1:Y.C/T:S.G/C:R.A/G
SaV124F
SaV1245R
SaV124TP
SaV5TP
扩增片段大小/bp
5'-GAYCAS GCTCTCGCYACC TAC-3\5-TTGGCCCTCGCCACCTAC-3
5'-TTT GAA CAA GCT GTG GCA TGC TAC-3'5'-CCCTCCATYTCAAACACTA-3'
5-FAM-CCRCCTATRAACCA-MGB-3
5°-FAM-TGC CAC CAA TGT ACC A-MGB-3\注2：探针也可选用具有与FAM和MGB荧光基团相同检测效果的其他合适的荧光报告基团和荧光淬灭基团组合。
5.16DNA相对分子质量标记：DL2000（显示条带范围100bp～2000bp）或其他具有相近DNA条带显示范围的相对分子质量标记。5.1750×TAE缓冲液：见附录A.1.35.18
溴化乙锭（EB）溶液（10mg/mL）：见附录A.1.4含0.5μg/mL漠化乙锭（EB)的1.5%琼脂糖凝胶：见附录A.1.5。10×加样缓冲液：见附录A.1.6。QIAampViralRNAMiniKit.Qiagen.Cat.No.52904.见附录A.2.8。6仪器
实时荧光PCR仪。
6.2PCR仪。
6.3电泳仪。
凝胶成像分析系统。
6.5冷冻离心机。
http:
6.6匀浆器。bzxz.net
6.7恒温孵育器
6.8振荡器。
6.9微量加样器：2.5μL、10μL、100μL、200μL和1mL。6.10高压灭菌锅。
6.11生物安全柜。
6.12-80℃冰箱，-20℃冰箱，
6.13无RNase和DNase污染的玻璃容器：见A.2.1。SN/T2531—2010
6.14无RNase和DNase污染的离心管（1.5mL、15mL、50mL），无RNase和DNase污染的移液器吸嘴（10μL、200μL1mL），无RNase和DNase污染的药匙，无RNase和DNase污染的0.2mLPCR扩增反应管：见A.2.2。
6.15磁性抽提架。
6.16已灭菌直径为47mm，孔径为0.45um的乙酸/硝酸混合纤维素滤膜[密理博（上海）贸易有限公司.Cat.No.R7SN201861及配套过滤器。6.17无菌一次性50mL针管。
6.18聚乙烯薄膜袋：50mm×70mm自封袋，使用前紫外杀菌20min。7检测方法
7.1实验室要求
实验室设施应达到SN/T1193实验室技术要求7.2样品制备和札如病毒RNA提取7.2.1贝类样品中札如病毒RNA提取7.2.1.1小心切开贝类样品组织，解剖取下贝类的肠腺组织。7.2.1.2取5g左右中肠腺组织加入35mL甘氨酸缓冲液。7.2.1.3使用匀浆器高速匀浆3min～5min，使肠腺组织完全被打碎并与缓冲液混合均匀，将匀浆液装人50mL离心管，250r/min37℃或室温振荡30min。7.2.1.4将样品勾浆液于4℃.10000g离心30min。7.2.1.5移取上清液至一新的50mL离心管，加入等体积的PEG8000溶液，颠倒混5次。冰上放置至少1h后，4℃，10000g离心5min，弃尽上清液，保留沉淀。7.2.1.6向沉淀中加人5mL裂解液，剧烈振荡30s，室温放置5min7.2.1.7转移溶液至一15mL离心管，加人1.2mL三氯甲烷，剧烈振荡30s，室温放置5min12000g离心5min，吸取上清液至另一15mL离心管。7.2.1.8向上清液中加人0.5倍体积（约2.5mL）异丙醇，颠倒混匀后，室温放置5min，4℃，5000g离心5min。
7.2.1.9弃尽上清液，用5mL，4℃预冷的75%乙醇洗涤沉淀。7.2.1.10重复步骤7.2.1.9两次，最后一次弃尽上清液。沉淀重悬于300μL超纯水（无RNase和DNase污染）中，将悬液转移至一1.5mL离心7.2. 1. 11
管中。
2加人400μL1XRNA吸附缓冲液，振荡30s，60℃放置3min。7.2.1.12
3加入100uLOligo（dT）2磁珠，轻柔混合，磁性抽提架上放置1min7.2.1.14
奔尽上清液.加人500uL2×RNA吸附缓冲液，室温下晃动5min洗涤。7.2.1.15
离心管在磁性抽提架上放置1min，弃尽上清液。加人500uL漂洗缓冲液，颠倒混匀5次，离心管在磁性抽提架上放置1min，弃去上清液3
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7.2.1.16重复步骤7.2.1.15三次。7.2.1.17沉淀用100μL超纯水（无RNase和DNase污染）悬浮，90℃放置2min释放RNA。离心管在磁性抽提架上放置1min。将上清液移至另一1.5mL离心管中，可即吸取5uL进行RT-PCR检测7.2.2水样中札如病毒RNA提取（使用Qiagen公司QIAampViralRNAMiniKit）7.2.2.1用50ml针管分次取100mL~200mL水样过直径为47mm，孔径为0.45um的乙酸/硝酸混合纤维素滤膜，小心取出滤膜，平整放于聚乙烯薄膜袋中。7.2.2.2向薄膜袋中加人1130μLBufferAVL-carrierRNA混合液.使滤膜充分浸于缓冲液中，剧烈振荡15s~30s，室温浸泡滤膜20min30min后，小心将液体完全转移到15mL离心管中。7.2.2.3（可选步骤）若回收液体中存在明显可见的固体物质.4000g离心3min，转移上清液至一新15mL离心管中。
7.2.2.4加人1120μL无水乙醇，剧烈振荡15s.5000g离心15s收集液体7.2.2.5将上述液体630μL转移至带有2mL收集管的离心柱中，6000g离心1min，弃收集管中液体。
7.2.2.6重复步骤7.2.2.5，直至所有混合液均通过离心柱，最后一次离心后将离心柱放入一新2mL收集管中。
7.2.2.7加人500μLBufferAW1.6000g离心1min，将离心柱放入一新2mL收集管中。7.2.2.8加人500μLBufferAW2,20000g离心3min。7.2.2.9将离心柱放人一新2mL收集管中，20000g离心1min以彻底除去残余在离心柱膜上液体。7.2.2.10将离心柱放人一新1.5mL离心管中，小心的在离心柱膜中央加入60μLBufferAVE，室温放置1min~2min，6000g离心1min。1.5mL离心管中的液体即为提取的病毒RNA样品可即吸取5μL进行RT-PCR检测。
7.3RT-PCR检测
7.3.1普通RT-PCR
7.3.1.1普通RT-PCR反应体系
病毒RNA逆转录为cDNA的反应体系见表3,PCR反应体系见表4。反应体系中各试剂的量可根据不同试剂盒进行适当调整。每个反应体系设置两个平行反应。以札如病毒cDNA或含机如病毒检测目的片段的质粒标准分子DNA作为阳性对照模板，以不含有札如病毒cDNA或札如病毒检测目的片段的质粒标准分子DNA的样品作为阴性对照模板，以水代替DNA模板作为空白对照。表3病毒RNA逆转录反应体系2）
逆转录反应缓冲液
氯化镁（MgCl）
RNase抑制剂
通转录酶
随机引物
储液浓度
25mmol/L
各10mmol/L
5U/μL
5U/μL
20μmol/L
终浓度
5mmol/L
各1mmol/L
0.125U/μL
0.25U/μL
1 pmol/L
使用量/μL
1）水样中病毒RNA的提取方法是针对QIAampViralRNAMiniKit，Qiagen.Cat.No.52904给出的，给出这一信息是为了方便本标准使用者，并不表示只认可该产品，如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用等效产品。2）该反应体系针对TaKaRaRNAPCRKit（AMV）Ver3.0，TaKaRa.Cat.No.DRRo19A给出，给出这一信息是为了方便本标准使用者，并不表示只认可该产品，如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用等效产品。ht
OligodTPrimer
模板RNA
超纯水（无RNase和DNase污染）总体积
PCR反应缓冲液
氯化镁（MgCl）
引物SLV5317
引物SLV5749
TaqDNA聚合酶
超纯水（无RNase和DNase污染）总体积
表3（续）
储液浓度
2.5μmol/L
终浓度
0.125umol/L
表4札如病毒普通PCR反应体系2
储液浓度
25mmol/L
2.5mmol/L
10μmol/L
10μmol/L
5U/μL
普通RT-PCR反应参数
终浓度
4mmol/L
0.06mmol/L
0.2μmol/L
0.2μmol/L
0.05U/μL
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使用量/μL
使用量/uL
病毒RNA逆转录为cDNA的反应参数：30℃，10min；42℃，60min；99℃，5min；5℃，5min;
普通PCR反应参数：94℃5min94℃.30s，55℃，30s，72℃，40s，45个循环；72℃.5min。7.3.1.3PCR产物的琼脂糖凝胶电泳检测将适量50XTAE稀释成1XTAE溶液，配制溴化乙锭含量为0.5ug/mL的1.5%琼脂糖凝胶取PCR产物15uL，加1.5uL上样缓冲液点样进行电泳，并在其中一孔道加入DNA分子量标记以判断PCR产物的片段大小。电压大小根据电泳槽长度来确定，一般控制在3V/cm～5V/cm，当溴酚蓝移动到凝胶边缘时关闭电源，电泳检测结果用凝胶成像分析系统记录。7.3.1.4普通RT-PCR检测下限
札如病毒的普通RT-PCR体系检测下限为100拷贝质粒标准分子DNA。7.3.2实时荧光RT-PCR
7.3.2.1实时荧光RT-PCR反应体系病毒RNA逆转录为cDNA的反应体系见表3，PCR反应体系见表5。每个反应体系设置两个平行反应。以札如病毒cDNA或含札如病毒检测目的片段的质粒标准分子DNA作为阳性对照模板，以不含有札如病毒cDNA或札如病毒检测目的片段的质粒标准分子DNA的样品作为阴性对照模板，以水代替DNA模板作为空白对照。
1）反应参数可根据不同型号PCR仪及PCR反应体系作适当调整。2）该反应体系针对TaKaRaRNAPCRKit（AMV）Ver3.0，TaKaRa.Cat.No.DRRo19A给出.给出这一信息是为了方便本标准使用者，并不表示只认可该产品，如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用等效产品。5
http
TEITETT
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表 5札如病毒实时荧光PCR反应体系1储液浓度
Premix Ex TaqTM(Perfect Real Time)SaV124F
SaV1245R
SaV124TP
SaV5TP
ROX荧光校正试剂
超纯水（无RNase和DNase污染）总体积
10μmol/L
10μmol/L
10μmol/L
10μmol/L
10μmol/L
10μmol/L
终浓度
0.32μmol/L
0.32μmol/L
0.32μmol/L
0.32μmol/L
0.032μmol/L
0.032μmol/L
a该试剂只在具有ROX荧光校正通道的实时荧光PCR仪上进行扩增时添加，否则用水补齐7.3.2.2实时荧光RT-PCR反应参数2加样量/μL
病毒RNA逆转录为cDNA的反应参数：30℃.10min；42℃60min；99℃，5min；5℃，5min;
实时荧光PCR反应参数：95℃，10S；95℃，5S，60℃，31S，45个循环。7.3.2.3实时荧光RT-PCR检测下限札如病毒实时荧光RT-PCR体系检测下限为10拷贝质粒标准分子DNA。8
结果判断及表述
8.1结果判定
8.1.1普通RT-PCR
阴性对照和空白对照未出现条带，阳性对照出现434bp的目的扩增条带则表明反应体系运行正常，否则需重新进行普通PCR扩增：对样品进行普通RT-PCR检测，如果阴性对照和空白对照未出现条带，阳性对照出现434bpb）
的扩增条带，而样品未出现扩增条带，则可判定样品未检出札如病毒；c)
如果阴性对照和空白对照未出现条带，阳性对照和样品出现434bp的扩增条带，对PCR产物进行测序分析比对，PCR产物核酸序列与相应的札如病毒cDNA序列相-致，则可判定样品检出札如病毒。也可采用本标准中实时荧光RT-PCR的方法进行确证。8.1.2实时荧光RT-PCR
阴性对照和空白对照无荧光增幅现象，阳性对照有荧光增幅现象则表明反应体系运行正常，否则需重新进行实时荧光PCR扩增：
若待检测样品无荧光增幅现象，则判定样品未检出札如病毒；若待检测样品有荧光增幅现象，且Ct值≤40时，则可判定样品检出札如病毒；b）
该反应体系针对PremixExTagTM（PerfectRealTime）及配套ROX荧光校正试剂（50X），TaKaRa，Cat.No1
DRR039A给出，给出这一信息是为了方便本标准使用者，并不表示只认可该产品，如果其他等效产品具有相同的效果。则可使用等效产品。
2）反应参数可根据不同型号PCR仪及PCR反应体系作适当调整。6
htt
SN/T2531—2010
c）若待检测样品Ct值介于40和45之间时，应重新进行实时荧光RT-PCR检测。重新检测后设定同一域值条件下，若Ct值≥45时，则可判定样品未检出札如病毒。重新检测后的Ct值仍介于40和45之间，则判定样品中含有札如病毒8.2结果表述
8.2.1根据8.1描述判定检出札如病毒，则表述为检出札如病毒或札如病毒阳性8.2.2根据8.1描述判定未检出札如病毒，则表述为未检出札如病毒或札如病毒阴性http：//foodmate.netSN/T2531—2010
A.1普通溶液的配制
附录A
（规范性附录）
溶液的配制
A.1.1甘氨酸缓冲液：含0.1mol/L甘氨酸0.3mol/L氯化钠（NaCI),pH9.5甘氨酸
氯化钠
双蒸水
5mol/L氢氧化钠溶液
调pH至9.5
加双蒸水至1000mL.121℃，15min灭菌备用A.1.2PEG8000溶液：含16%（质量浓度）PEG8000.0.525mol/L氯化钠PEG8000
氯化钠
加双蒸水至100mL，121℃，15min灭菌备用。A.1.350×TAE缓冲液
A.1.3.10.5mol/LEDTA-Na2·2H,0（二水乙二铵四乙酸钠）溶液，pH8.0EDTA-Na2·2H,O
灭菌双蒸水
5mol/L氢氧化钠溶液
调pH至8.0
灭菌双蒸水加至1000mL,121℃,15min灭菌备用。A.1.3.2TAE电泳缓冲液（50×）羟基甲基氨基甲烷(Tris）
冰乙酸
0.5mol/LEDTA-Na溶液，pH8.0
灭菌双蒸水加至1000mL，121℃，15min灭菌备用。使用时用灭菌双蒸水稀释至1×使用。A.1.4溴化乙锭（EB）溶液（10μg/μL）EB
灭菌双蒸水
A.1.5含0.5μg/mL溴化乙锭（EB）的1.5%琼脂糖凝胶琼脂糖
1XTAE电泳缓冲液
加至100mL
混合后加热至完全融化，待冷却至50℃～55℃时，加EB溶液5uL，轻轻晃动摇匀，避免产生气泡，将梳子置人电泳槽中，然后将琼脂糖溶液倒入电泳板上，待完全凝固后（需约40min），取下梳子，备用。
510×加样缓冲液
聚蔗糖
灭菌双蒸水
溴酚蓝
三甲苯青
ht
A.2RNase的去除和无RNase和DNase溶液的配制SN/T2531—2010
配制溶液用的酒精、异丙醇、Tris、EDTA、氯化锂、浓盐酸、氢氧化钠等应采用非开封的新品。配制溶液所用的超纯水、玻璃容器、移液器吸嘴、药勺等用具应无RNase和DNase污染。操作过程中，应自始至终佩戴抛弃式橡胶或乳胶手套，并经常更换，以避免皮肤上的细菌和真菌以及人体自身分泌的RNase污染用具或带人溶液，
A.2.1玻璃容器应在240℃烘烤4h以降解RNase和DNase。A.2.2离心管、移液器吸嘴、药勺等用具应用0.01%的焦碳酸二乙酯（DEPC)水室温浸泡过夜，灭菌，烘干：或直接购买无RNase和DNase的相应规格离心管、移液器吸嘴等用具。A.2.3超纯水（无RNase和DNase污染）超纯水
混合后室温放置过夜，121℃，灭菌15min，或直接购买无RNase和DNase的超纯水。A.2.475%乙醇
无水乙醇
超纯水（无RNase和DNase污染）现配现用。
A.2.51XRNA吸附缓冲液
A.2.5.1 1 mol/L Tris-HCI pH7.5Tris
超纯水（无RNase和DNase污染）36.5%盐酸
1mol/L盐酸
调pH至7.5
加超纯水（无RNase和DNase污染）至10mL，分装到1.5mL无RNase离心管中，一20℃保存。A.2.5.20.5mol/LEDTA-Na2·2HO溶液.pH7.5EDTA-Naz·2H,O
超纯水（无RNase和DNase污染）5mol/L氢氧化钠溶液
调pH至7.5
加超纯水（无RNase和DNase污染）至10mL，分装到1.5mL无RNase离心管中，一20℃保存。A.2.5.35mol/L氯化锂（LiCI)
氯化锂
超纯水（无RNase和DNase污染）2.12g
加超纯水（无RNase和DNase污染）至10mL，分装到1.5mL无RNase离心管中，一20C保存。A.2.5.41XRNA吸附缓冲液：含20mmol/LTris-HCl(pH7.5），1mol/L氯化锂，2mmol/LEDTANaz·2H,O(pH7.5)
1 mol/L Tris-HCI(pH7.5)
5mol/L氯化锂
0.5 mol/L EDTA-Naz .2H,O(pH7.5)超纯水（无RNase和DNase污染）总体积
现配现用。
200μL
2000μL
7760μL
A.2.62×RNA吸附缓冲液：含40mmol/LTris-HCl(pH7.5）.2mol/L氯化锂，4mmol/LEDTANaz·2H,0(pH7.5)
ht
SN/T2531—2010
1mol/LTris-HCI(pH7.5)
5mol/L氯化锂
0.5mol/LEDTA-Naz·2H,O(pH7.5)超纯水（无RNase和DNase污染）总体积
现配现用。
400μL
4000μ
5520μL
A.2.7漂洗缓冲液：含10mmol/LTris-HCl(pH7.5），0.15mol/L氯化锂，1mmol/LEDTA-Naz2H,O(pH7.5)
1mol/LTris-HCl(pH7.5)
5mol/L氯化锂
0.5mol/LEDTA-Na2:2H,O(pH7.5)超纯水（无RNase和DNase污染）总体积
现配现用。
100μL
300μl
A.2.8QIAampViralRNAMiniKit,Qiagen.Cat.No.52904A.2.8.1BufferAVL-carrierRNA混合液从QIAampViralRNAMiniKit中取出装有310ugcarrierRNA冻干粉的试管，小心加人310μLBufferAVE至carrierRNA溶液终浓度为1μg/μL。颠倒试管使carrierRNA完全溶解，并混合均匀。将配制好的carrierRNA分装至多管，每管含量以方便使用为准（如分装为每管20μL，可用于三份样品的RNA提取），储存于一20℃，不可冻融3次以上。配制BufferAVL-carrierRNA混合液，即根据BufferAVL体积的1%加入carrierRNA，如1120μL的BufferAVL.即加入11.2μL的carrierRNA至终体积约1130μL。
A.2.8.2BufferAW1
在第一次使用前，根据QIAampViralRNAMiniKit说明书的要求，向BufferAW1中加入一定体积的无水乙醇，并混合均匀备用。如原BufferAW1为19mL，则加人无水乙醇25mL至终体积44mL。
3BufferAW2
在第一次使用前，根据QIAampViralRNAMiniKit说明书的要求，向BufferAW2中加入一定体积的无水乙醇，并混合均匀备用。如原BufferAW2为13mL，则加人无水乙醇30mL至终体积43mL。
雪品伙伴欧ht
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