SN/T 1316-2011 牛海绵状脑病检疫技术规范 SN/T1316-2011 标准压缩包解压密码：www.bzxz.net

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T1316—2011
代替SN/T1316—2003
牛海绵状脑病检疫技术规范
Quarantineprotocol for bovine spongiform encephalopathy2011-05-31发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2011-12-01实施
中华人民共和国出人境检验检疫行业标准
牛海绵状脑病检疫技术规范
SN/T1316—2011
中国标准出版社出版
北京复兴门外三里河北街16号
邮政编码：100045
网址spc.net.cn
电话：6852394668517548
中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷开本880×1230
印张2
字数57千字
2011年11月第一版
2011年11月第一次印刷
印数1-1600
书号：155066：2-22588
定价30.00元
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本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准代替SN/T1316—2003《牛海绵状脑病病理组织学检查方法》。本标准与SN/T1316—2003相比，主要的技术性变化如下：增加了牛海绵状脑病的采样；
增加了蛋白免疫印迹方法；
增加了酶联免疫吸附试验方法（ELISA）；一增加了免疫层析试纸条检测方法。SN/T1316—2011
本标准参考了国际动物卫生组织（OIE)的《诊断试验和疫苗标准手册》（2008版）《ManualofDiagnosticTestsandVaccinesforTerrestrialAnimals》）中第2.4.6章“牛海绵状脑病的诊断技术”。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国北京出入境检验检疫局起草本标准主要起草人：马贵平、李炎鑫、李冰玲、刘全国、史喜菊、刘旭辉。本标准所代替标准的历次版本发布情况为：SN/T1316—2003。
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1范围
牛海绵状脑病检疫技术规范
SN/T1316—2011
本标准规定了牛海绵状脑病的采样、组织病理学检查方法、免疫组织化学方法、蛋白免疫印迹方法、酶联免疫吸附试验方法、免疫层析试纸条检测方法等检测方法的技术要求和操作规范。其中组织病理学检查方法为免疫组织化学方法的辅助方法，免疫组织化学方法和SAF蛋白免疫印迹诊断为确诊方法，蛋白免疫印迹方法、酶联免疫吸附试验方法和免疫层析试纸条检测方法为筛选方法。本标准适用于牛海绵状脑病的诊断，也可用于其他动物的传染性海绵状脑病的诊断。2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB19489实验室生物安全通用要求3临床诊断
3.1牛海绵状脑病（BSE)平均潜伏期为4年～5年。病牛临床表现为精神异常、运动障碍和感觉障碍。
3.2精神异常：主要表现为不安、恐惧、狂暴等，当有人靠近或追逼时往往出现攻击性行为。3.3运动障碍：主要表现为共济失调、颤抖或倒下。病牛步态呈“鹅步”状，四肢伸展过度，后肢运动失调、震颤和跌倒、麻痹、轻瘫：有时倒地难以站立3.4感觉障碍：最常见的是对触摸、声音和光过度敏感，这是BSE病牛很重要的临床诊断特征。用手触摸或用钝器触压牛的颈部肋部，病牛会异常紧张颤抖，用扫帚轻碰后蹄，也会出现紧张的踢腿反应；病牛听到敲击金属器械的声音，会出现震惊和颤抖反应；病牛在黑暗环境中，对突然打开的灯光，出现惊吓和额抖反应。
实验室诊断
4.1采样及样品准备方法
4.1.1材料
4.1.1.1被检组织
待检牛脑。
4.1.1.2试剂
10%中性福尔马林溶液（见附录A）；消毒液：2%次氯酸钠，2mo1/L氢氧化钠；98%～99%甲酸；无水乙醇；95%乙醇溶液70%乙醇溶液；二甲苯；石蜡（熔点为54℃~56℃，56℃~58℃，58℃～60℃）。1
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4.1.1.3仪器设备
脱水包埋盒、镊子、吸水纸、pH计、手术刀、专用取样勺、刀板、剪刀、锯、载玻片（多聚赖氨酸或其他等效物质处理过）、自动脱水浸蜡机、包埋机、冰箱、切片机、展片槽、烘干台、天平、温箱（37℃）、pH计、计时器、安全设施、BⅡ生物安全柜、通风橱、一次性手套、防护服、防护面罩或口罩、防护眼镜、防切割手套、鞋套、尖锐废弃物容纳盒、灭菌锅（121℃）、蒸汽灭菌器（温度不低于135℃，且蒸汽不外排）。4.1.2方法
4.1.2.1牛脑组织的采集
4.1.2.1.1疑似患有BSE的病牛在必要的情况下可以先注射镇静剂，再用浓缩巴比妥盐溶液静脉注射处死。
4.1.2.1.2将头部与躯体从枕骨大孔和第一颈椎之间分离，从断面孔可以看到脑干的尾部。4.1.2.1.3用锯锯开颅骨.取出整个脑组织（包括大脑、小脑和脑干）。4.1.2.1.4如果只取脑门部位，可以不锯开颅骨，用特制取样勺直接从枕骨大孔处进行取样。具体方法是：将分离的牛头顶部朝下放置，用边缘锋利的特制取样勺从枕骨大孔处的脑和头骨之间的缝隙插人，贴着颅骨左右移动，切断两侧的颅神经，切记紧贴颅骨以避免损坏脑组织，插入大约7cm，然后向下切割，即将延髓尾部（可能会带有一些小脑的部分）与脑的其他部分分离。将子拨出，将分离的脑干从颅腔中滑出。脑门部位的取材可按图1进行。图1脑门部位的取材
4.1.2.2牛海绵状脑病组织病理学、免疫组织化学诊断样品制备方法4.1.2.2.1修样
4.1.2.2.1.1在BⅡI生物安全柜进行修样。4.1.2.2.1.2对于有神经症状的病例，取材方法为：在小脑脚处切除小脑，暴露脑干，沿神经轴的横向切下大约3cm～5cm长度的组织。采取的解剖学部位包括：脑门部位延髓、小脑后脚部位延髓、脑桥、中脑包括前丘和红核部位、小脑（矢状切）、丘脑、大脑额叶和大脑枕叶。TTKANTKACa
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4.1.2.2.1.3对于进行普查的病例，取材方法为：在脑门部位横向切下延髓的一段。如果所取组织包括小脑，则先去除小脑后，再取脑门部位。脑干区域取材可按图2进行。建议切取的水平部位；
A-A=延髓脑门部位
a）背面
b）侧面
B-B-延髓小脑后脚部位
C-C=中脑前丘部位
图2切除小脑的脑干
4.1.2.2.1.4将所取样品固定于10倍体积的10%的中性福尔马林溶液中。通常情况下（室温18℃～25℃），3d后更换固定液。固定1周即可进行修样。4.1.2.2.1.5在刀板上将样品组织修成2mm~3mm厚的小块，装入脱水包埋盒中，放入10%中性福尔马林溶液中固定过夜。
4.1.2.2.1.6将装有组织的脱水包埋盒浸人98%~99%的甲酸溶液中，振荡1h。4.1.2.2.1.7取出脱水包埋盒.自来水充分冲洗4.1.2.2.1.8置于10%中性福尔马林溶液中。4.1.2.2.2组织脱水、浸蜡
将装有组织的脱水包埋盒放入自动脱水浸蜡机中，常规脱水浸蜡程序如下：a）10%中性福尔马林溶液30min；b）70%乙醇75min；
95%乙醇75min;
95%乙醇75min；
100%乙醇75min；
100%乙醇75min
100%乙醇75min；
二甲苯30min；
二甲苯45min；
二甲苯45min；
石蜡（熔点58℃~60℃）75min
石蜡（熔点58℃~60℃）1h；
m）石蜡（熔点58℃60℃）1h。
4.1.2.2.3包埋（使用包埋机或手工包埋，包埋石蜡熔点58℃～60℃）浸蜡后，使用包埋机进行常规石蜡包埋，包埋后的模具置于冷台上，至石蜡完全冷却。将模具与冷却的石蜡块分开。将制备好的组织石蜡包埋块放到4℃冰箱中待用。4.1.2.2.4切片、展片
4.1.2.2.4.1切片：将制备好的脑组织石蜡包埋块固定到切片机上，调整切片厚度为5um，匀速转动TYKAONTKACa
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切片机手柄切片。
4.1.2.2.4.2展片：将展片槽中的水加热到37℃～45℃，把石蜡包埋组织切片轻轻的移人展片槽中。4.1.2.2.4.3烘干：用处理好的载玻片将组织捞出，使之粘附于玻片的适当位置。将粘贴有石蜡包埋组织的载玻片放到烘干台（50℃）上，烘干30min后置于37℃温箱中过夜干燥。干燥后的组织切片在室温下保存，待检。
4.1.2.2.5去除污染
4.1.2.2.5.1将所有污染的平面喷酒2%次氯酸钠.放置1h后用吸水纸拭干后，用水充分冲（擦）洗4.1.2.2.5.2将所用器械浸泡于2mol/L氢氧化钠溶液中2h后充分冲洗。4.1.2.2.5.3将用过的吸水纸放人生物危险垃圾袋中，在安全柜中进行蒸发后，135℃高压30min。4.1.2.2.5.4剩余的样品重新放回福尔马林容器中，容器置于通风橱中至做出诊断。4.1.2.3蛋白免疫印迹方法、酶联免疫吸附试验方法（ELISA）、试纸条检测方法准备方法4.1.2.3.1样品编号。
4.1.2.3.2所有的样品通过完成检测记录能够追踪到。4.1.2.3.3在BIⅡ生物安全柜中切割组织。4.1.2.3.4在BⅡ生物安全柜或安全罩内从延髓的脑门部位切取一块组织，把脑切块放人天平上事先称量的匀浆管中，组织块应在0.45g～0.70g之间（最好是0.5g～0.55g）。4.1.2.3.5在切板上修整组织块，用纸巾吸取多余的血液。用2%的漂白粉消毒切板和纸巾1h，冲洗。把器械放人2mol/L的氢氧化钠浸泡2h，冲洗。在生物安全柜中将纸放人开口的生物危害袋中，135℃，高压消毒30min。
4.1.2.3.6在放人组织块的匀浆管中加入10倍体积的1×匀浆缓冲液（质量浓度），盖上盖子。4.1.2.3.7用FASTH\或MediFASTH\匀浆机自动勾浆45s。4.1.2.3.8每份样品吸取900μL~1000uL匀浆组织液到96孔1.2mL的样品主板里主板可在4℃保存或在一20℃或一70℃长期保存（12个月）。所有步骤在室温条件下进行，主板和消化板每板有48份样品。
4.2组织病理学诊断
4.2.1材料
4.2.1.1被检组织
待检牛脑组织切片。
4.2.1.1.1
4.2.1.1.2对照组织切片（用于苏木素-伊红染色质控）。4.2.1.2试剂
4.2.1.2.1二甲苯。
4.2.1.2.2无水乙醇、95%乙醇溶液、70%乙醇溶液。4.2.1.2.3苏木素染色液（Gill's)（见A.1)。4.2.1.2.4饱和碳酸锂溶液。
伊红染色液（见A.2）。
4.2.1.2.5
1）FASTH是由瑞士Prionics公司提供的商品名。给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。4
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二级水（见GB/T6682）。
4.2.1.2.6
4.2.1.2.7中性树胶。
仪器设备
4.2.1.3. 1
4. 2. 1. 3. 2
4.2.1.3.3
4.2.1.3. 4
4.2.1. 3.5
4.2.1.3.6
4.2.1.3.7
4.2.1.3.8
自动染色机。
封片机。
光学显微镜
盖玻片。
染色架。
温箱或恒温孵育器（58℃~60℃）。移液器及适配吸头。
磁力搅拌器。
将待染切片置于58℃～60℃的温箱中至少1h进行熔蜡4.2.2.2
苏木素-伊红（H.E)染色
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将待检牛脑组织切片和对照组织切片置于染色架上，放人自动染色机，也可以手动染色。染色程序如下：
二甲苯3min~10min；
b）二甲苯3min~10min;
100%乙醇3min~10min；
100%乙醇3min~10min；
95%乙醇3min~5min；
95%乙醇3min~5min
70%乙醇3min~5min
自来水洗1min~3min；
苏木素10 s（根据染色液状况调整）；自来水洗4min~10min；
饱和碳酸锂1min~2min；
自来水洗4min~10min；
70%乙醇1min~3min；
伊红1min~5min；
95%乙醇1min~3min；
95%乙醇1min~3min；
100%乙醇1min~3min；
100%乙醇1min~3min；
二甲苯1min~3min；
二甲苯1min~3min；
二甲苯3min~5min。
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4.2.2.3封片
染色完成后，用中性树胶封片，室温下干燥。可以手工封片，也可以使用封片机进行封片。4.2.2.4显微镜观察
4.2.2.4.1显微镜下观察对照组织切片，正常的染色结果应为：细胞核为蓝色，胞浆RNA为蓝色，胞浆为深浅不同的粉色，肌纤维为深粉色，胶原为浅粉色，红细胞为亮粉色。4.2.2.4.2显微镜下观察待检组织切片，观察特征性变化，做出诊断。4.2.2.4.3记录对照切片和待检切片的染色结果。4.2.3结果解释
4.2.3.1阳性结果：在特定的解剖学部位（见图3)呈现如下特征性病理变化.包括：灰质神经纤维的空泡化、神经元空泡化、神经元变性和缺失、神经胶质细胞增生、淀粉斑（不常见）、非炎性变化。4.2.3.2阴性结果：在被检牛脑组织切片未呈现4.2.3.1所述的特征性病理变化。4.2.3.3不确定结果：如果样品不是来自推荐取样的解剖学部位或者由于样品自溶严重不能看到是否存在特征性病理变化。
1抓束核；
三叉神经核：
迷走背根神经核
图3脑门部位的横断面（深颜色的区域显示用于牛海绵状脑病组织病理学和免疫组织化学诊断的关键目标区域）注：在特定的解剖学部位未见上述特征性病理变化不能排除待检样品为阳性的可能，应结合免疫组织化学染色结果进行确诊。
4.3免疫组织化学诊断方法
4.3.1材料
被检组织
待检牛脑组织。
4.3.1.1.1
4.3.1.1.2阴性对照脑组织切片。6
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4.3.1.1.3阳性对照脑组织切片。2试剂
4. 3. 1.2. 1
二甲苯。
4.3.1.2.2
2无水乙醇、95%乙醇溶液、70%乙醇溶液。4.3.1.2.3
4.3.1.2.4
4.3.1.2.5
4.3.1.2.6
4. 3. 1.2.7
4.3.1.2.8
4.3.1.2.9
4.3.1.2.10
4.3. 1.2.11
4.3.1.2.12
4.3.1.2.13
4.3.1.2.14
4.3.1.2.15
4.3.1.2.16
4. 3. 1.2. 17
98%~99%甲酸，
磷酸盐吐温缓冲液（PBST),（pH7.4)（见附录A）。抗原修复缓冲液（见附录A）。
正常羊血清工作液
抗体稀释缓冲液。
3%过氧化氢甲醇溶液。
自来水。
二级水（见GB/T6682）。
苏木素染色液（Gill's）。
抗PrP单克隆抗体工作液（按照该抗体使用说明书的要求进行稀释）。辣根过氧化物酶标记的二抗（或其他商品化检测系统）。二氨基联苯胺(DAB)显色试剂盒
饱和碳酸锂溶液。
中性树胶。
消毒液：2%次氯酸钠，2mol/L氢氧化钠仪器设备
4.3.1.3.1
4.3.1.3.2
4.3.1.3.3
全自动免疫组化仪。
自动染色机。
封片机
4.3.1.3.4
光学显微镜。
4.3.1.3.5
4.3.1.3.6
4. 3. 1. 3.7
4.3. 1.3.8
4.3.1.3.9
盖玻片。
温箱或恒温孵育器（37℃，58℃~60℃）。染色架。
镊子。
天平。
4.3.1.3.10
pH计。
4.3.1.3.11
4.3.1.3.12
4.3.1.3.13
4.3.1.3.14
2方法
湿盒。
移液器（25μL，100μL，1000μL）和适配枪头。计时器。
磁力搅拌器。
将待染切片置于58℃～60℃的温箱中至少1h进行熔蜡。4.3.2.2
脱蜡、脱二甲苯
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将放有切片的染色架放入自动染色机脱蜡、脱二甲苯，也可手动进行。程序如下TKANTKAca-
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a）二甲苯5min；
b）二甲苯5min；
c）100%乙醇4min；
100%乙醇4min;
95%乙醇3min；
70%乙醇3min；
g）自来水洗2min；
h）二级水1min。
过氧化氢甲醇溶液处理
将切片从切片机中取出，放入3%过氧化氢甲醇溶液中10min。4冲洗
二级水冲洗1min。
甲酸处理
放入98%~99%甲酸中5min。
6冲洗
二级水冲洗2次，每次1min。
4.3.2.7PBST浸泡
PBST(pH7.4).3min。
3PBST浸泡
PBST(pH7.4),5min。
抗原修复液处理
将放有切片的染色架置于抗原修复液中，121℃高压25min～30min（根据使用的一抗来确定高压时间）。
4.3.2.10冷却
取出染色架，使玻片冷却至室温后放入PBST(pH7.4)中，至少5min。取出玻片，可以放入全自动免疫组化仪中继续以下步骤，也可以手动进行4.3.2.11免疫组织化学手动染色4.3.2.11.1在玻片组织上滴加正常羊血清100uL.室温湿盒中孵育15min。4.3.2.11.2滴加一抗工作液100μL，4℃过夜。4.3.2.11.3从冰箱中取出玻片室温下放置15min。4.3.2.11.4PBST(pH7.4)中洗5min，其间振荡。滴加辣根过氧化物酶标记的二抗（或其他检测系统）100μL，室温湿盒中孵育30min（或根4.3.2.11.5
据说明书调整）。
PBST(pH7.4）中洗2minX3次，其间振荡4.3.2.11.6
4.3.2.11.7滴加300μLDAB，室温反应15min。4.3.2.11.8二级水洗2min。
4.3.2.12免疫组织化学自动染色全自动免疫组化仪程序设定如下：a）正常羊血清100μL，15min；吹去羊血清；
一抗工作液100μL，1h；
PBST(pH7.4）洗3次；
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辣根过氧化物酶标记的二抗（或其他检测系统）100uL，30min（或根据说明书调整）；PBST(pH7.4)洗3次；
DAB300μL,15min;
二级水洗3次；
从免疫组化仪中取出玻片。
复染、脱水（可以放入自动染色机中进行，也可以手动进行4. 3.2. 13. 1
4.3.2.13.2
4.3.2.13.3wwW.bzxz.Net
4.3.2.13.4
4.3.2.13.5
4.3.2.13.6
4.3.2.13.7
4.3.2.13.8
4.3.2.13.9
4.3.2.13.10
4.3.2.13.11
4.3.2.13.12
4.3.2.13.13
自来水2min。
苏木素10s（根据染色液状况调整）。自来水洗5min。
饱和碳酸锂1min
自来水洗4min。
70%乙醇1min。
95%乙醇1min。
95%乙醇1min。
100%乙醇1min。
100%乙醇1min。
二甲苯1min。
二甲苯1min。
二甲苯3min。
4.3.2.14封片
染色完成后，用中性树胶封片，室温下干燥。可以手工封片，也可以使用封片机进行封片。4.3.2.15
显微镜观察
显微镜下观察阴性对照、阳性对照组织切片以及待检脑组织切片，记录对照切片和待检切片的染色结果。
4.3.3结果判定
诊断标准
阴性对照、阳性对照结果成立的情况下，进行阴、阳性结果判定。4.3.3.2
阳性结果
4.3. 3.2.1
牛海绵状脑病通常感染的目标区域包括三叉神经核、孤束核和迷走背根神经核，灰质神经9
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