SN/T 1674-2011
基本信息
标准号： SN/T 1674-2011
中文名称：锦鲤疱疹病毒病检疫技术规范
标准类别：商检行业标准(SN)
标准状态：现行
出版语种：简体中文
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标准分类号
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标准简介
SN/T 1674-2011 锦鲤疱疹病毒病检疫技术规范
SN/T1674-2011
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标准内容
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代替SN/T1674—2005
锦鲤疱疹病毒病检疫技术规范
Quarantineprotocol forKoiherpersvirus disease2011-05-31发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2011-12-01实施
本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。SN/T1674—2011
本标准代替了SN/T1674一2005《锦鲤疱疹病毒分离和聚合酶链反应操作规程》。本标准与SN/T1674一2005相比，主要技术变化如下：修改了标准的名称；
增加了“病理变化观察”“电镜观察”及“间接免疫荧光（IFAT)”方法；修改了原标准的PCR方法
本标准修改采用国际兽疫局（OIE）《水生动物疾病诊断手册》（2009版）中第2.3.6章，主要修改如下：
原文中“Diseaseinformation”内容经修改简缩后作为本标准附录A；原文第5节内容删去：
一原文格式及内容顺序排版上作了调整本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国湖北出人境检验检疫局、中华人民共和国深圳出入境检验检疫局。
本标准主要起草人：郭明星、江育林、刘、陈建军、黄晟、罗志萍、朱堂明、赵晖。本标准所代替标准的历次版本发布情况为：SN/T1674—2005。
TYKAONTKAca
1范围
锦鲤疱疹病毒病检疫技术规范
SN/T 1674—2011
本标准规定了锦鲤疱疹病毒病诊断的临床症状、采样、间接免疫荧光、组织病理学观察、病毒分离、电镜观察、PCR检测等检疫技术规范。本标准适用于进出境锦鲤疱疹病毒病的检疫规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T18088出人境动物检疫采样
3试剂和材料
3.1锦鲤疱疹病毒（Koiherpesuirus，KHV）：标准毒株由OIE参考实验室或国家质量监督检验检疫总局指定的实验室提供。
3.2细胞系：锦鲤鳍细胞（KF-1）、脑组织（CCB）细胞系由国家质量监督检验检疫总局指定实验室提供。
3.3引物
3.3.1KHV胸腺啶脱氧核苷激酶（TK)基因PCR扩增引物序列：上游引物：5'-GGGTTACCTGTACGAG-3下游引物：5'-CACCCAGTAGATTATGC-3”扩增产物大小为410bp。
3.3.2基于检测KHVGraySph基因建立PCR方法的引物序列为：KHVSphI5F:5-GACACCACATCTGCAAGGAG-3KHVSphI5R:5-GACACATGTTACAATGGTCGC-3扩增产物大小为292bp。
3.4Taq酶。
3.5dNTPs：含dCTP、dGTP、dATP、dTTP各10mmol/L。3.6无水乙醇：使用前预冷到-20℃。3.7蛋白酶K。
DNAMarker。
溴化乙锭。
器材和设备
4.1PCR扩增仪。
4.2电泳仪及电泳槽。
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SN/T1674—2011
4.3凝胶成像分析仪。
4.4恒温培养箱。
4.5高速冷冻离心机。
4.6细胞培养瓶或培养板。
4.7普通光学显微镜、倒置显微镜及电子显微镜。4.8切片机。
临床症状
锦鲤疱疹病毒病（Koiherpesvirusdisease，KHVD)是一种由锦鲤疱疹病毒引起的鲤鱼和锦鲤的高度传染性败血症疾病，主要临床表现为行动迟缓，鱼眼凹陷，平衡失调，皮肤和鳃苍白、颜色不规则伴有中度至严重的鳃坏死，体表多黏液。该病的传染源为临床上被感染的鱼及隐性带毒鱼，临床症状同许多普通细菌与寄生虫感染的症状相似。患病鱼往往在1d～2d内即出现死亡（参见附录A）。6采样
6.1直接采样
按照GB/T18088采样，取鳃、肾、脾脏、脑等组织作为样品。6.2共同培养后取样
通常用于检疫比较贵重的鱼，如比较名贵的锦鲤进出境展览检疫等。处理方法：将待检鱼与经检查没有感染KHV的鲤鱼放在检疫隔离场于23℃～28℃下共同饲养2周～4周，按6.1的要求取鲤鱼样作为检疫样品。
7检验方法
7.1病理变化观察
取鳃、肾、脾、肝组织制成病理切片，在普通显微镜下观察组织细胞病理变化。典型KHV感染可观察到鳃组织增生、次级鳃丝肥大融合、鳃上皮细胞的细胞核肿大并出现弥散性嗜酸性核内包涵体，肾、脾、肝实质细胞坏死。
7.2电镜观察
电子显微镜下进一步观察组织切片，KHV感染的病鱼细胞中能看到弥散性嗜酸性核内包涵体，并可见到有疱疹病毒样粒子。
7.3间接免疫荧光（IFAT）
将待检鱼放血后，取其肾组织印迹于干净载玻片或者细胞培养皿，空气中风干20min.0.01mol/L磷酸盐缓冲液（PBS.PH值7.2）冲洗次·然后一20℃预冷的丙酮或30%+内酮70%乙醇混合溶液轻轻冲洗3次。按0.5mL/2cm加入固定液，固定15min，风干至少30min后立刻进行下一步处理或一20℃保存。用0.01mol/LPBST（0.05%Tween-20.pH值7.2的PBS）冲洗润湿四次，然后彻底风干。用0.01mol/LPBST以合适的比例稀释KHV的血清或纯化抗体，以0.25mL/2cm2的抗体稀释2
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SN/T1674—2011
液在恒湿箱中37℃处理1h，再PBST冲洗四次。然后用5%的脱脂牛奶或1%的牛血清白蛋白BSA的PBST在37℃封闭30min，再PBST冲洗四次，接着用FITC标记的二抗处理在37℃处理1h，再PBST冲洗四次，然后用0.5mL/2cm2PBS冲洗，立刻用10×目镜和20×~40X物镜在紫外光下进行观察。同时设立阳性对照、阴性对照。7.4病毒分离
7.4.1.样品处理
取待检样品用组织研磨器匀浆成糊状，按1：10加人含双抗（1000IU/mL青霉素和1000μg/mL链霉素）的细胞培养液（见B.2)悬浮，收于灭菌离心管中，15℃静置2h4h或4℃过夜。7000r/min离心15min，收集上清液。
7.4.2病毒分离
细胞接种前用胰酶-EDTA混合消化液（见B.1）处理，并将1：10的组织匀浆上清液再依次10倍稀释，然后将1：10、1：100和1：1000三个稀释度的上清液以适当体积分别接种到生长24h～48h单层细胞中，每孔（5cm）的细胞单层最多接种100μL稀释液。18℃～22℃吸附0.5h～1h后，加人细胞培养液（1mL/cm~1.5mL/5cm），置于20℃~25℃培养。试验应有2孔阳性对照（接种KHV标准株)和空白对照（未接种病毒的细胞）。阳性对照和待测样品都接种细胞后，7d内每天用40×～100X倒置显微镜检查。空白对照细胞应当正常。如果接种了被检匀浆上清液稀释液的细胞培养中出现细胞病变（CPE），应立即进行鉴定。如果除阳性对照细胞外，没有CPE出现，则在培养7d后再用敏感细胞进行传代培养。传代时，将接种了组织匀浆上清液稀释液的细胞单层培养物冻融一次，以7000r/min，4℃离心15min，收集上清液。将上清液接种到新鲜细胞单层，培养7d。每天用40×～r/min，4℃离心15min，收集上清液。将上清液接种到新鲜细胞单层，培养7d。每天用40×～100×倒置显微镜检查。若阳性对照未出现CPE，则应换用敏感细胞和一批新的组织样品重新进行另一系列的病毒学检查。
7.5PCR检测
7.5.1核酸抽提
按1/10（质量/体积）将待检样品（鱼鳃去掉表面黏液）与灭菌生理盐水混合匀浆。取100μL组织勾浆加到有500μL组织裂解液（见B.3)的1.5mL离心管中，65℃处理1h。加人20L蛋白酶K（20mg/mL），55℃孵育30min。加入等体积酚-三氯甲烷-异戊醇（25：24：1）振荡混匀，静置20s，13500r/min，4℃，离心3min。取水相移人新管中，加入等体积三氯甲烷-异戊醇（24：1）混匀，静置20s.10000r/min，4℃.离心15min取上层水相溶液（约600uL）到新的离心管中。加入1.5倍体积（约900μL），一20℃预冷无水乙醇混勾，静置20℃过夜，15000r/min，4℃，离心5min，弃上清液。加人500μL的70%乙醇，轻轻漂洗DNA沉淀两遍，弃上清液，吸水纸去除残余的乙醇，自然干燥10min～15min。加50uL双蒸水溶解沉淀，置一20℃保存。
也可用其他商业化试剂盒或其他方法抽提病毒DNA。7.5.2反应体系
反应体系构成：10倍PCR缓冲液10μL、25mmol/L氯化镁10μL、dNTP2μL、引物（40pmol）各2.5μL、Taq酶5U、模板10μL，加水到100μL。设立标准毒株感染的鱼组织按7.5.1抽提的DNA为TTKANTKACa
SN/T1674—2011
模版作为阳性对照、健康鱼组织按7.5.1为模板作为阴性对照、双蒸水为模板作为空白对照7.5.3反应条件
KHV胸腺嘧啶脱氧核苷激酶（TK)基因的PCR扩增：94℃预变性5min，然后95℃60s、55℃60s、72℃60s，40个循环，最后72℃延伸10min.4℃保存。KHVGraySph基因的PCR扩增：94℃预变性5min，然后95℃60s、63℃60s、72℃60s，30个循环，最后72℃延伸10min，4℃保存。7.5.4电泳
使用1%琼脂糖凝胶进行电泳，溴化乙锭终浓度为0.5μg/mL~1ug/mL100V电泳约20min。采用凝胶成像分析仪进行扩增产物的分析。阳性对照的KHV胸腺嘧啶脱氧核苷激酶TK基因的PCR扩增产物为41Obp,GraySph基因的PCR扩增产物为292bp；阴性对照扩增无产物。样品扩增片段大小与阳性对照一致即为阳性，若样品扩增无产物或者产物片段大小不一致即为阴性。阳性扩增片段需进行测序并与参考序列（参见C.1、C.2)进行比对。
8综合判断标准
8.1可疑病例的确定
出现下列的一种或多种情形，即为可疑：鱼群出现锦鲤疱疹病毒病的典型临床症状；a)
组织切片呈现锦鲤疱疹病毒病的典型组织病理变化；样品接种敏感细胞，培养后观察到典型的CPE，但未鉴定病原；在电镜下能观察到核内包涵体中有疱疹病毒样粒子；d）
IFAT结果为阳性；
PCR检测结果阳性；
从锦鲤疱疹病毒病确诊或可疑区域转移至非锦鲤疱疹病毒病区域的带病的活鱼；g）
h）与锦鲤疱疹病毒病确诊区域有相关的其他确定的流行病学联系。8.2确诊病例的判定
若出现与锦鲤疱疹病毒病一致的典型临床症状、组织病理变化和死亡，且下列至少一种检测结果为阳性，即可确诊：
a）PCR检测结果呈阳性；
b）IFAT结果为阳性；
c）病毒分离鉴定为阳性
若未出现与锦鲤疱疹病毒病一致的典型临床症状、组织病理变化和死亡,则以上两种及以上不同方法的检测结果呈阳性才能确诊为锦鲤疱疹病毒病。4
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附录A
（资料性附录）
锦鲤疱疹病毒病
SN/T1674—2011
锦鲤疱疹病毒病（KoiHerpesvirus disease，KHVD)是锦鲤疱疹病毒引起的一种鲤鱼和锦鲤的高度传染性败血症疾病，主要临床表现为行动迟缓鱼眼凹陷，平衡失调，皮肤和鳃苍白、颜色不规则伴有中度至严重的鳃坏死，体表多黏液，但大多数无皮肤溃疡或出血。该病的传染源为临床上被感染的鱼及隐性带毒鱼，临床症状同许多普通细菌与寄生虫感染的症状相似。患病鱼在1d～2d内就会死亡。传播方式为水平传播，感染KHV的锦鲤在低温下不发病，成为传染源。KHV的发病温度是16℃～25℃，带毒鱼13℃～23℃条件下运输会大批死亡。患病锦鲤常发生继发或并发感染。自然条件下，鲤鱼、锦鲤及其杂交品种对KHV易感。感染KHV的鱼苗最快在3d内发病，一般情况下，8d~21 d可在新鱼苗中观察到病症。锦鲤疱疹病毒（KoiHerpesuirus，KHV)，是球状、有囊膜的DNA病毒，基因组为150kb、277kb和295kb不等。直径170nm~230nm，去掉囊膜后的衣壳直径100nm~110nm。病毒在35℃48h以及在pH值大于11或小于3的条件下丧失感染力，60℃30min可以灭活病毒；在水中病毒能存活至少20h。该病毒该病在北美、亚洲、欧洲、非洲和中东流行，有很高的传染性和几乎100%的积累死亡率，一且发生很难根除，严重影响水产养殖业安全和观赏鱼国际贸易TYKAONTKACa
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B.1胰酶-EDTA混和消化液
（规范性附录）
试剂及其配制
NaCl0.8g,KCI0.02g.KH,PO,0.02g,KzHPO,0.115g,EDTA0.02g,胰酶0.25g,双蒸水100mL.混匀，抽滤除菌。
2细胞培养液
Eagle氏MEM基础培养基90%，胎牛血清（FBS）10%，青霉素1000IU/mL，链霉素1000μg/mL，抽滤除菌。培养板中使用时，另加HEPES（终浓度为0.02mol/L)后，抽滤除菌。3组织裂解液
CTAB1%.Tris-HCl(pH8.0)0.05mol/L.NaCl0.7mol/L,EDTA0.01mol/L6
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（资料性附录）
扩增产物参考序列
检测KHV胸腺嘧啶脱氧核苷激酶（TK）基因的PCR扩增产物参考序列C.1
gggttacctg
ttccccgacc
acggggactt
gctgacggcg
gacctggtce
tggcccagta
tacgaggtga
tctacgaggg
tatgcagcag
gtgtgcatga
aggttggagg
cgagctgtac
tgcagcgtct
agtcgtgcag
cccttcaagc
agtgcaagat
cgccgagtct
ggtccgccgc
ggaggaatac
ctgctgaccg
aggtgacggc
gcgcgacgca
taccaggcgg
ctcctcctcc
gacgccgtgg
cgggcaagta
gttggtgccc
cccttcaccg
tgtgtcgtcc
tgcgcataat
检测KHVGraySph基因的PCR扩增产物参考序列gacaccacat
cagcacgtgc
gaggaccgct
ggtgagacga
ctgcaaggagtgctcgaaca
ccgcagtgca
acaagagcct
cggcgaggac
gtaacatgtg tc
gggacccgag
cttcaagctg
agctgcccgc
catcgtgggg
acgccgcaac
ccgcagcgca
ccgtcgacga
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ctgtctcacg
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中国标准出版社出版
北京复兴门外三里河北街16号
邮政编码：100045
网址spc.net.cn
电话：6852394668517548
中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷开本880×12301/16
2011年11月第一版
印张0.75
字数15千字
2011年11月第一次印刷
印数1—1600
书号：155066·2-22614定价16.00元TKANTKAca-
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中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2011-12-01实施
本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。SN/T1674—2011
本标准代替了SN/T1674一2005《锦鲤疱疹病毒分离和聚合酶链反应操作规程》。本标准与SN/T1674一2005相比，主要技术变化如下：修改了标准的名称；
增加了“病理变化观察”“电镜观察”及“间接免疫荧光（IFAT)”方法；修改了原标准的PCR方法
本标准修改采用国际兽疫局（OIE）《水生动物疾病诊断手册》（2009版）中第2.3.6章，主要修改如下：
原文中“Diseaseinformation”内容经修改简缩后作为本标准附录A；原文第5节内容删去：
一原文格式及内容顺序排版上作了调整本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国湖北出人境检验检疫局、中华人民共和国深圳出入境检验检疫局。
本标准主要起草人：郭明星、江育林、刘、陈建军、黄晟、罗志萍、朱堂明、赵晖。本标准所代替标准的历次版本发布情况为：SN/T1674—2005。
TYKAONTKAca
1范围
锦鲤疱疹病毒病检疫技术规范
SN/T 1674—2011
本标准规定了锦鲤疱疹病毒病诊断的临床症状、采样、间接免疫荧光、组织病理学观察、病毒分离、电镜观察、PCR检测等检疫技术规范。本标准适用于进出境锦鲤疱疹病毒病的检疫规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T18088出人境动物检疫采样
3试剂和材料
3.1锦鲤疱疹病毒（Koiherpesuirus，KHV）：标准毒株由OIE参考实验室或国家质量监督检验检疫总局指定的实验室提供。
3.2细胞系：锦鲤鳍细胞（KF-1）、脑组织（CCB）细胞系由国家质量监督检验检疫总局指定实验室提供。
3.3引物
3.3.1KHV胸腺啶脱氧核苷激酶（TK)基因PCR扩增引物序列：上游引物：5'-GGGTTACCTGTACGAG-3下游引物：5'-CACCCAGTAGATTATGC-3”扩增产物大小为410bp。
3.3.2基于检测KHVGraySph基因建立PCR方法的引物序列为：KHVSphI5F:5-GACACCACATCTGCAAGGAG-3KHVSphI5R:5-GACACATGTTACAATGGTCGC-3扩增产物大小为292bp。
3.4Taq酶。
3.5dNTPs：含dCTP、dGTP、dATP、dTTP各10mmol/L。3.6无水乙醇：使用前预冷到-20℃。3.7蛋白酶K。
DNAMarker。
溴化乙锭。
器材和设备
4.1PCR扩增仪。
4.2电泳仪及电泳槽。
TYKAONTKACa
SN/T1674—2011
4.3凝胶成像分析仪。
4.4恒温培养箱。
4.5高速冷冻离心机。
4.6细胞培养瓶或培养板。
4.7普通光学显微镜、倒置显微镜及电子显微镜。4.8切片机。
临床症状
锦鲤疱疹病毒病（Koiherpesvirusdisease，KHVD)是一种由锦鲤疱疹病毒引起的鲤鱼和锦鲤的高度传染性败血症疾病，主要临床表现为行动迟缓，鱼眼凹陷，平衡失调，皮肤和鳃苍白、颜色不规则伴有中度至严重的鳃坏死，体表多黏液。该病的传染源为临床上被感染的鱼及隐性带毒鱼，临床症状同许多普通细菌与寄生虫感染的症状相似。患病鱼往往在1d～2d内即出现死亡（参见附录A）。6采样
6.1直接采样
按照GB/T18088采样，取鳃、肾、脾脏、脑等组织作为样品。6.2共同培养后取样
通常用于检疫比较贵重的鱼，如比较名贵的锦鲤进出境展览检疫等。处理方法：将待检鱼与经检查没有感染KHV的鲤鱼放在检疫隔离场于23℃～28℃下共同饲养2周～4周，按6.1的要求取鲤鱼样作为检疫样品。
7检验方法
7.1病理变化观察
取鳃、肾、脾、肝组织制成病理切片，在普通显微镜下观察组织细胞病理变化。典型KHV感染可观察到鳃组织增生、次级鳃丝肥大融合、鳃上皮细胞的细胞核肿大并出现弥散性嗜酸性核内包涵体，肾、脾、肝实质细胞坏死。
7.2电镜观察
电子显微镜下进一步观察组织切片，KHV感染的病鱼细胞中能看到弥散性嗜酸性核内包涵体，并可见到有疱疹病毒样粒子。
7.3间接免疫荧光（IFAT）
将待检鱼放血后，取其肾组织印迹于干净载玻片或者细胞培养皿，空气中风干20min.0.01mol/L磷酸盐缓冲液（PBS.PH值7.2）冲洗次·然后一20℃预冷的丙酮或30%+内酮70%乙醇混合溶液轻轻冲洗3次。按0.5mL/2cm加入固定液，固定15min，风干至少30min后立刻进行下一步处理或一20℃保存。用0.01mol/LPBST（0.05%Tween-20.pH值7.2的PBS）冲洗润湿四次，然后彻底风干。用0.01mol/LPBST以合适的比例稀释KHV的血清或纯化抗体，以0.25mL/2cm2的抗体稀释2
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SN/T1674—2011
液在恒湿箱中37℃处理1h，再PBST冲洗四次。然后用5%的脱脂牛奶或1%的牛血清白蛋白BSA的PBST在37℃封闭30min，再PBST冲洗四次，接着用FITC标记的二抗处理在37℃处理1h，再PBST冲洗四次，然后用0.5mL/2cm2PBS冲洗，立刻用10×目镜和20×~40X物镜在紫外光下进行观察。同时设立阳性对照、阴性对照。7.4病毒分离
7.4.1.样品处理
取待检样品用组织研磨器匀浆成糊状，按1：10加人含双抗（1000IU/mL青霉素和1000μg/mL链霉素）的细胞培养液（见B.2)悬浮，收于灭菌离心管中，15℃静置2h4h或4℃过夜。7000r/min离心15min，收集上清液。
7.4.2病毒分离
细胞接种前用胰酶-EDTA混合消化液（见B.1）处理，并将1：10的组织匀浆上清液再依次10倍稀释，然后将1：10、1：100和1：1000三个稀释度的上清液以适当体积分别接种到生长24h～48h单层细胞中，每孔（5cm）的细胞单层最多接种100μL稀释液。18℃～22℃吸附0.5h～1h后，加人细胞培养液（1mL/cm~1.5mL/5cm），置于20℃~25℃培养。试验应有2孔阳性对照（接种KHV标准株)和空白对照（未接种病毒的细胞）。阳性对照和待测样品都接种细胞后，7d内每天用40×～100X倒置显微镜检查。空白对照细胞应当正常。如果接种了被检匀浆上清液稀释液的细胞培养中出现细胞病变（CPE），应立即进行鉴定。如果除阳性对照细胞外，没有CPE出现，则在培养7d后再用敏感细胞进行传代培养。传代时，将接种了组织匀浆上清液稀释液的细胞单层培养物冻融一次，以7000r/min，4℃离心15min，收集上清液。将上清液接种到新鲜细胞单层，培养7d。每天用40×～r/min，4℃离心15min，收集上清液。将上清液接种到新鲜细胞单层，培养7d。每天用40×～100×倒置显微镜检查。若阳性对照未出现CPE，则应换用敏感细胞和一批新的组织样品重新进行另一系列的病毒学检查。
7.5PCR检测
7.5.1核酸抽提
按1/10（质量/体积）将待检样品（鱼鳃去掉表面黏液）与灭菌生理盐水混合匀浆。取100μL组织勾浆加到有500μL组织裂解液（见B.3)的1.5mL离心管中，65℃处理1h。加人20L蛋白酶K（20mg/mL），55℃孵育30min。加入等体积酚-三氯甲烷-异戊醇（25：24：1）振荡混匀，静置20s，13500r/min，4℃，离心3min。取水相移人新管中，加入等体积三氯甲烷-异戊醇（24：1）混匀，静置20s.10000r/min，4℃.离心15min取上层水相溶液（约600uL）到新的离心管中。加入1.5倍体积（约900μL），一20℃预冷无水乙醇混勾，静置20℃过夜，15000r/min，4℃，离心5min，弃上清液。加人500μL的70%乙醇，轻轻漂洗DNA沉淀两遍，弃上清液，吸水纸去除残余的乙醇，自然干燥10min～15min。加50uL双蒸水溶解沉淀，置一20℃保存。
也可用其他商业化试剂盒或其他方法抽提病毒DNA。7.5.2反应体系
反应体系构成：10倍PCR缓冲液10μL、25mmol/L氯化镁10μL、dNTP2μL、引物（40pmol）各2.5μL、Taq酶5U、模板10μL，加水到100μL。设立标准毒株感染的鱼组织按7.5.1抽提的DNA为TTKANTKACa
SN/T1674—2011
模版作为阳性对照、健康鱼组织按7.5.1为模板作为阴性对照、双蒸水为模板作为空白对照7.5.3反应条件
KHV胸腺嘧啶脱氧核苷激酶（TK)基因的PCR扩增：94℃预变性5min，然后95℃60s、55℃60s、72℃60s，40个循环，最后72℃延伸10min.4℃保存。KHVGraySph基因的PCR扩增：94℃预变性5min，然后95℃60s、63℃60s、72℃60s，30个循环，最后72℃延伸10min，4℃保存。7.5.4电泳
使用1%琼脂糖凝胶进行电泳，溴化乙锭终浓度为0.5μg/mL~1ug/mL100V电泳约20min。采用凝胶成像分析仪进行扩增产物的分析。阳性对照的KHV胸腺嘧啶脱氧核苷激酶TK基因的PCR扩增产物为41Obp,GraySph基因的PCR扩增产物为292bp；阴性对照扩增无产物。样品扩增片段大小与阳性对照一致即为阳性，若样品扩增无产物或者产物片段大小不一致即为阴性。阳性扩增片段需进行测序并与参考序列（参见C.1、C.2)进行比对。
8综合判断标准
8.1可疑病例的确定
出现下列的一种或多种情形，即为可疑：鱼群出现锦鲤疱疹病毒病的典型临床症状；a)
组织切片呈现锦鲤疱疹病毒病的典型组织病理变化；样品接种敏感细胞，培养后观察到典型的CPE，但未鉴定病原；在电镜下能观察到核内包涵体中有疱疹病毒样粒子；d）
IFAT结果为阳性；
PCR检测结果阳性；
从锦鲤疱疹病毒病确诊或可疑区域转移至非锦鲤疱疹病毒病区域的带病的活鱼；g）
h）与锦鲤疱疹病毒病确诊区域有相关的其他确定的流行病学联系。8.2确诊病例的判定
若出现与锦鲤疱疹病毒病一致的典型临床症状、组织病理变化和死亡，且下列至少一种检测结果为阳性，即可确诊：
a）PCR检测结果呈阳性；
b）IFAT结果为阳性；
c）病毒分离鉴定为阳性
若未出现与锦鲤疱疹病毒病一致的典型临床症状、组织病理变化和死亡,则以上两种及以上不同方法的检测结果呈阳性才能确诊为锦鲤疱疹病毒病。4
TYKAONT KAca
附录A
（资料性附录）
锦鲤疱疹病毒病
SN/T1674—2011
锦鲤疱疹病毒病（KoiHerpesvirus disease，KHVD)是锦鲤疱疹病毒引起的一种鲤鱼和锦鲤的高度传染性败血症疾病，主要临床表现为行动迟缓鱼眼凹陷，平衡失调，皮肤和鳃苍白、颜色不规则伴有中度至严重的鳃坏死，体表多黏液，但大多数无皮肤溃疡或出血。该病的传染源为临床上被感染的鱼及隐性带毒鱼，临床症状同许多普通细菌与寄生虫感染的症状相似。患病鱼在1d～2d内就会死亡。传播方式为水平传播，感染KHV的锦鲤在低温下不发病，成为传染源。KHV的发病温度是16℃～25℃，带毒鱼13℃～23℃条件下运输会大批死亡。患病锦鲤常发生继发或并发感染。自然条件下，鲤鱼、锦鲤及其杂交品种对KHV易感。感染KHV的鱼苗最快在3d内发病，一般情况下，8d~21 d可在新鱼苗中观察到病症。锦鲤疱疹病毒（KoiHerpesuirus，KHV)，是球状、有囊膜的DNA病毒，基因组为150kb、277kb和295kb不等。直径170nm~230nm，去掉囊膜后的衣壳直径100nm~110nm。病毒在35℃48h以及在pH值大于11或小于3的条件下丧失感染力，60℃30min可以灭活病毒；在水中病毒能存活至少20h。该病毒该病在北美、亚洲、欧洲、非洲和中东流行，有很高的传染性和几乎100%的积累死亡率，一且发生很难根除，严重影响水产养殖业安全和观赏鱼国际贸易TYKAONTKACa
SN/T1674—2011
B.1胰酶-EDTA混和消化液
（规范性附录）
试剂及其配制
NaCl0.8g,KCI0.02g.KH,PO,0.02g,KzHPO,0.115g,EDTA0.02g,胰酶0.25g,双蒸水100mL.混匀，抽滤除菌。
2细胞培养液
Eagle氏MEM基础培养基90%，胎牛血清（FBS）10%，青霉素1000IU/mL，链霉素1000μg/mL，抽滤除菌。培养板中使用时，另加HEPES（终浓度为0.02mol/L)后，抽滤除菌。3组织裂解液
CTAB1%.Tris-HCl(pH8.0)0.05mol/L.NaCl0.7mol/L,EDTA0.01mol/L6
TTKASNTKAca
（资料性附录）
扩增产物参考序列
检测KHV胸腺嘧啶脱氧核苷激酶（TK）基因的PCR扩增产物参考序列C.1
gggttacctg
ttccccgacc
acggggactt
gctgacggcg
gacctggtce
tggcccagta
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tctacgaggg
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检测KHVGraySph基因的PCR扩增产物参考序列gacaccacat
cagcacgtgc
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ctgcaaggagtgctcgaaca
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SN/T1674—2011
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SN/T 1674-2011
中华人民共和国出人境检验检疫行业标准
锦鲤疱疹病毒病检疫技术规范
SN/T1674—2011
中国标准出版社出版
北京复兴门外三里河北街16号
邮政编码：100045
网址spc.net.cn
电话：6852394668517548
中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷开本880×12301/16
2011年11月第一版
印张0.75
字数15千字
2011年11月第一次印刷
印数1—1600
书号：155066·2-22614定价16.00元TKANTKAca-
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