SN/T 1681-2011
基本信息
标准号： SN/T 1681-2011
中文名称：蜜蜂美洲幼虫腐臭病检疫技术规范
标准类别：商检行业标准(SN)
标准状态：现行
出版语种：简体中文
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标准分类号
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出版信息
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标准简介
SN/T 1681-2011 蜜蜂美洲幼虫腐臭病检疫技术规范
SN/T1681-2011
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标准内容
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 1681—2011
代替SN/T1681-2005
蜜蜂美洲幼虫腐臭病检疫技术规范Quarantineprotocolfor American foulbrood of honeybees2011-05-31发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2011-12-01实施
本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。本标准代替了SN/T1681—2005《蜜蜂美洲幼虫腐臭病诊断方法》。本标准与SN/T1681—2005相比，主要技术变化如下：修改了标准的名称；
-增加了“现场检验检疫”、“生理特征鉴定”及PCR检测”内容；修改了原标准的“采样方法”、“直接检查法”及“分离培养与鉴定”SN/T 1681—2011
本标准修改采用国际兽疫局（OIE）《陆生动物疾病诊断试验和疫苗标准手册》（2008版）中2.2.2章，主要修改如下：
原文中\introduction\等内容经修改简缩后作为本标准附录A；原文格式及内容顺序排版上做了调整。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国湖北出入境检验检疫局。本标准主要起草人：郭明星、曾宪东、冯汉利、陈建军、赵晖、颜志立、朱堂明、王振华。本标准所代替标准的历次版本发布情况为：SN/T1681-2005。
TIKANYKACA
1范围
蜜蜂美洲幼虫腐臭病检疫技术规范SN/T1681—2011
本标准规定了蜜蜂美洲幼虫腐臭病的现场检验检疫、采样、实验室诊断等检疫技术规范。本标准适用于进出境蜜蜂美洲幼虫腐臭病的检疫及本病的流行病学调查、诊断和监测规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T18088出人境动物检疫采样
3试剂和材料
3.1幼虫芽孢杆菌（Paenibacilluslarvaesubsp.larvae）标准菌株由OIE参考实验室或国家质量监督检验检疫总局指定的实验室提供。3.2引物
3.2.1PCR引物
E游I物:5'-CTTGTGTTTCTTTCGGGAGACGCC-3下游引物：5-TCTTAGAGTGCCCACCTCTGCG-3”扩增片段大小：1106bp。
3.2.2巢式PCR引物
3.2.2.1巢式PCR外侧引物
上游引物：5'-TCGAGCGGACCTTGTGTT-3下游引物:5-CTA TCTCAAAACCGGTCAGAG-3”扩增片段大小：969bp。
3.2.2.2巢式PCR内侧引物
上游引物：5'-CTTCGCATGAAGTCATG-3”下游引物：5'-TCAGTTATAGGCCAGAAAGC-3*扩增片段大小：572bp。
3.3Taq酶。
3.4dNTPs：含dCTP、dGTP、dATP、dTTP各10mmol/L。DNAMarker。
漠化乙锭。
3.7异丙醇。
10mmol/LTris·HCl-1mmol/LEDTA溶液(pH8.0)。3.8
3.9胡萝下酵母琼脂培养基。
马铃薯培养基。
3.11酵母浸膏培养基。
TTKANYKAa
SN/T 1681—2011
4器材和设备
4.1PCR扩增仪。
4.2电泳仪及电泳槽。
4.3凝胶成像分析仪。
4.4恒温培养箱。
4.5高速冷冻离心机。
4.6普通光学显微镜。
5现场检验检疫
临床变化特征结合病原鉴定是诊断蜜蜂美洲幼虫腐臭病的依据（参见附录A）。开箱，提蜂脾查看，出现下列病理变化特征之一者，可做出初步诊断。颜色变化：房盖潮湿、下陷、颜色发暗显油光。通常，患病幼虫身体变软，虫体在患病1周内体色为白色至棕黄色，2周后为深棕色，3周后为棕黑色。死亡幼虫的头部朝向房盖，虫体顺着背部下塌，虫体由正常呈“C”型变为呈竖立姿势。惠病幼虫残体1个月后十调，形成硬黑色的鳞片，紧贴巢房下侧，在310nm～400nm紫外光照射下可发出荧光。巢房变化：出现“插花子脾”现象，即后期房盖穿孔，巢脾上出现空巢房与卵房、幼虫房、封盖房相间排列的现象。
丝状、粘性物：用一根火柴杆插人虫体可拉出长10cm～15cm、褐色、胶体状、有鱼臭味的细丝。蛹舌现象：蛹期发生死亡的蛹在房顶部有蛹头突出的现象是美洲幼虫腐臭病典型的症状之一。6采样
按GB/T18088要求，采集蜂巢的病变区域或疑似受感染的蜜蜂幼虫作为首选样品，亦可用蜂房（不小于20cm2）或取临近蜂巢的蜜蜂食物（30g~50g）作为样品。7
实验室诊断
7.1病原形态学鉴定
取幼虫5条10条，置研钵中，加少量无菌水，制成悬液，取悬液涂片、风干、固定，加2滴5%孔雀绿加热至沸腾，待明水蒸于，用蒸馏水洗涤；再加0.5%番红染色30S，水洗、吸干，镜检，若发现游离状态呈绿色的芽孢即可判定
7.2病原分离培养
待检样品用无菌生理盐水1：5～1：10稀释，接种到胡萝下酵母琼脂培养基（见B.1)或马铃薯培养基（见B.2)或酵母浸膏培养基（见B.3）上，35℃～37℃培养24h，幼虫芽孢杆菌能形成浅乳白色、半透明、有光泽、微隆起的菌落。7.3生化特征鉴定
幼虫芽孢杆菌的生化特征鉴定包括过氧化氢酶反应（见C.1）、硝酸盐还原酶反应（见C.2）、酪蛋白水解反应（见C.3）、淀粉水解反应（见C.4）、柠檬酸盐反应（见C.5）、碳水化合物产酸反应（见C.6）、白2
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SN/T1681—2011
明胶液化反应（见C.7）等试验。生化特征如下：幼虫芽孢杆菌过氧化氢酶实验呈阴性反应，硝酸盐还原酶实验呈阴性反应，产吲哚和二羟基丙酮试验阳性，分解酪氨酸试验阴性，酪蛋白水解反应阳性，淀粉水解反应阴性，脲素水解反应阳性，柠檬酸盐反应阴性，发酵试验（D-葡萄糖十，L-阿拉伯糖一，甘露醇一，D-术糖一，甘油十，棉籽糖一）.能迟缓性液化白明胶，不产生靛基质，G+C为42%～43%。7.4生理特征鉴定
7.4.1改良悬滴技术
取可疑幼虫残留物样品水悬浮液一滴于盖玻片上，烘干固定，用石灰酸品红染色30s，用蒸馏水滴覆盖盖玻片，再将盖玻片倒置在涂有薄层镜油的载玻片上，用吸水纸轻轻吸干载玻片溢出的水分，在高倍显微镜下观察镜油中形成袋状水滴的区域，幼虫芽孢杆菌的芽孢在显微镜视野下呈布郎运动，其他芽孢杆菌的芽孢则静止不动。改良悬滴技术可以区别幼虫芽孢杆菌的芽孢与其他芽孢杆菌的芽孢，敏感性较低，不作为确诊的依据。
7.4.2Holst牛乳试验
取患病干虫户（或可疑样品鳞片、患病幼虫涂抹物）悬浮于加有1%脱脂牛奶溶液的小试管中，37℃孵育，若有幼虫芽孢杆菌及其芽孢存在，此时牛乳发生凝固，接着在10min～20min内变清7.5PCR检测
7.5.1核酸抽提
幼虫芽孢杆菌培养物的核酸抽提取可疑菌落悬浮于50uL蒸馏水中，95℃，水浴15min，5000g离心5min，其上清液作为核酸模板。
7.5.1.2可疑病理物的核酸抽提
将两只可疑患病幼虫于1mL无菌蒸馏水中勾质后，取该勾质液100μL加人到900uL无菌蒸馏水中混匀，再取100μL混悬液95℃，水浴15min，5000g.离心5min，取上清液作为模板7.5.1.3芽孢的核酸抽提
芽孢悬浮液4℃，6000g离心30min，弃上清液。沉淀物最大功率超声波处理5min，然后加人30μL10mmol/LTris·HCl-1mmol/LEDTA溶液（pH8.0）。蜂蜜中的芽孢，用无菌蒸馏水透析后进行上述处理。也可将芽孢培养后再提取DNA，即：将可疑样品接种营养肉汤，37℃培养2h～24h，14500g，离心5min，沉淀用无菌蒸馏水清洗两次，再用200μL的无菌蒸馏水悬浮。按照7.5.1.1煮沸法提取DNA。
7.5.2普通PCR
7.5.2.1反应体系
反应体系成分：10×PCR缓冲液5μL、25mmoL/L氯化镁5μL、25mmoL/LdNTP2μL、上游引物和下游引物（40pmol)各1.0μL、Taq酶2.5U、DNA10μL，加水到50μL。设立标准菌株悬液按7.5.1.1抽提的核酸为模板作为阳性对照、健康虫体按7.5.1.2抽提的核酸为模板作为阴性对照、双蒸水为模板作为空白对照。
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7.5.2.2反应条件
95℃预变性10min，然后93℃60s、55℃30s、72℃60s，30个循环，最后72℃延伸5min，4℃保存。
7.5.3巢式PCR
7.5.3.1外侧扩增反应体系及反应条件反应体系成分：10×PCR缓冲液5μL、25mmoL/L氯化镁5μL、25mmoL/LdNTP2μL、外部折增上游引物和下游引物（40pmol/L)各1.0μL、Taq酶1.25U、芽孢提取的DNA模板10μL，加水到50μL。设立标准菌株悬液按7.5.1.1抽提的核酸为模板作为阳性对照、健康虫体按7.5.1.2抽提的核酸为模板作为阴性对照、双蒸水为模板作为空白对照。外侧扩增反应条件：94℃30s、69℃59℃（每个循环退火温度降低0.5℃的TouchdownPCR)30s、72℃45s，20个循环，然后94℃30s、59℃30s、72℃45s.20个循环，最后72℃延伸5min，4℃保存。7.5.3.2内侧扩增反应体系及反应条件反应体系成分：10×PCR缓冲液5μL、25mmoL/L氯化镁5μL、25mmoL/LdNTP2μL、内部折增上游引物和下游引物（40pmol/L)各1.0μuL、Taq酶1.25U、外部扩增反应产物（作为模板）1uL，加水到50L。设立外侧扩增反应中阳性对照、阴性对照的扩增产物为相应的阳性对照、阴性对照，双蒸水为模板作为空白对照。内侧扩增反应条件：94℃30s59℃30s、72℃45s.30个循环最后72℃延伸5min，4℃保存。
7.5.4电泳
使用1%琼脂糖凝胶进行电泳，溴化乙锭终浓度为0.5μg/mL~1μg/mL，100V电泳约30min。采用凝胶成像分析仪进行扩增产物的分析。7.5.5结果
普通PCR
阳性对照扩增片段大小1106bp，阴性对照、空白对照无扩增产物。样品扩增片段大小与阳性对照一致即为阳性，若无扩增片段或扩增片段大小与阳性对照不符即为阴性。阳性片断应测序并与参考序列（参见附录D)进行比对
7.5.5.2巢式PCR
阳性对照外部扩增片段大小为969bp、内部扩增片段大小为572bp阴性对照、空白对照无扩增产物。样品两次扩增片段大小均与阳性对照一致即为阳性，若两次扩增片段大小均无扩增产物或与阳性对照不一致，即为阴性。阳性片断应测序并与参考序列（参见附录D)进行比对。A
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附录A
（资料性附录）
蜜蜂美洲幼虫腐臭病
SN/T1681—2011
蜜蜂美洲幼虫腐臭病（Americanfoulbroodofhoneybees）是由幼虫芽孢杆菌（幼虫类芽孢杆菌幼虫亚种，Paenibacilluslarvaesubsp.larvae)引起的蜜蜂幼虫和的一种细菌性、急性、毁灭性传染病。特征为病蜂的蜂盖子脾下陷、穿孔、封盖幼虫和大幼虫死亡等。本病最初发生于英国，后传到欧美各国，现全世界均有发生。世界动物卫生组织(OIE)把此病列为检疫对象。蜜蜂美洲幼虫腐臭病的病原为幼虫芽孢杆菌，其营养细胞没有感染力，只有芽孢才能诱发疾病。一个感染的幼虫体内可产生10亿多个芽孢。其芽孢能抵抗热、消毒剂和干燥，90℃、100℃水中分别能活3h和13h，0.1%升汞、福尔马林溶液中分别能活5d和6h，在自然界中可生存35年以上。悬浮在蜂蜜中的芽孢阳光照射下能存活4周～6周受幼虫芽孢杆菌污染的饲料、巢脾和花粉均可传播此病，内勤蜂在清理巢房和清除患病幼虫户体时，把病菌带进蜜、粉房，通过饲喂将幼虫芽孢杆菌传给健康幼虫。用带菌的蜂蜜喂蜂或随意调换巢脾可促使此病在蜂群间传播。蜂场上的盗蜂及迷巢蜂也可传播本病。蜡、人和小蜂螨等传播美洲幼虫腐烂病方面起着很大的作用
本病多在夏秋季发生流行，潜伏期为7d左右·通常感染孵化24h左右的幼虫，其易感性随虫龄增长而下降，孵化53h后的幼虫就不再感染此病了。该病的发生与蜜蜂的品种有一定关系，东方蜜蜂比西方蜜蜂对本病的抵抗力要强。蜂王的幼虫比同种蜜蜂的工蜂幼虫和雄蜂幼虫更容易被幼虫芽孢杆菌感染。
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SN/T 1681—2011
B.1胡萝卜酵母琼脂培养基
附录B
（规范性附录）
培养基的制备
胰蛋白陈10g，无水磷酸氢二钾（K，HPO.)0.5g，琼脂3g，胡萝卜浸出液200mL（将100g洗净的胡萝卜磨碎，加人250mL水，静置30min，过滤而成），酵母浸膏3g，蒸馏水1000mL混匀，调pH值至6.8。在0.105MPa的压力下灭菌20min。B.2
马铃薯培养基
将去皮马铃薯200g切成片，加水1000mL，煮沸30min～40min，过滤，加葡萄糖20g，琼脂20g，调pH值至7.0.在0.105MPa的压力下灭菌15min。B.3
酵母浸膏培养基
酵母浸膏1g，葡萄糖1g，无水磷酸氢二钾（K,HPO,)1.36g，琼脂2g，蒸馏水100mL，调pH值至6.6，在0.068MPa的压力下灭菌20min。6
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C.1过氧化氢酶反应
附录C
（规范性附录）
生化鉴定操作规范
SN/T 1681—2011
挑取培养的菌落转移到载玻片上，滴加3%的过氧化氢一滴，产生泡沫者为阳性，否则为阴性。幼虫芽孢杆菌呈阴性反应。
2硝酸盐还原酶反应
细菌接种到含有硝酸钾（1mg/L～2mg/L）的心、脑浸出物琼脂培养基上。细菌开始生长后.滴加一滴对氨基-α-萘基苯磺酸，如果硝酸盐被还原为弧硝酸盐，培养血呈现红色，为阳性反应。幼虫芽抱杆菌呈阴性反应。
C.3酪蛋白水解反应
溶液A（10g脱脂牛奶，90mL蒸馏水）和溶液B（3g琼脂糖，97mL蒸馏水），两种溶液先分别灭菌（121℃,20min），然后在不同的容器内加热至45℃使之充分混匀倒人接种有24h培养物的培养血中，培养7d。在菌落生长区下面和周围的培养基出现澄清现象者为阳性反应。幼虫芽孢杆菌呈阳性反应。
C.4淀粉水解反应
在肉汁陈中加0.2%可溶性淀粉，灭菌倒平板备用。取新鲜斜面培养物点种于上述平板，37℃培养2d～5d,形成明显菌落后，在平板上滴加卢哥氏碘液（与革兰氏染液中的碘液相同）至平板警蓝黑色菌落周围如有不变色透明圈，表明淀粉水解阳性，仍是蓝黑色者为阴性。幼虫芽孢杆菌不分解淀粉。C.5柠檬酸盐反应
氯化钠1g、硫酸镁0.2g、磷酸二氢铵0.5g、柠檬酸钠2g、蒸馏水1000mL、0.04%酚红液20mL、琼脂12g，混匀灭菌倒斜面试管备用。在斜面上划线接种，37℃培养3d～7d。培养基为碱性（指示剂蓝色或桃红色）者为阳性，否则为阴性。幼虫芽孢杆菌不利用柠檬酸盐。碳水化合物的产酸反应
氯化钾0.2g、硫酸镁0.2g、磷酸氢二铵1g、酵母膏0.2g、蒸馏水1000mL、0.04%溴甲酚紫15mL、糖或醇类10g、琼脂12g.混匀调pH至7.0~7.2.分装试管，灭菌备用。幼虫芽孢杆菌在需氧条件下分解葡萄糖和海藻糖并产酸，但不能使阿拉伯糖和木糖产酸TKANYKAa
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白明胶液化反应
将细菌培养物接种到装有纯白明胶的试管中，28℃培养4周，其间每隔3d～4d检查一次白明胶的变化。每次检测前，将培养物放置20℃，4h，以使未变化的白明胶同化。幼虫芽孢杆菌可使白明胶液化。
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附录D
（资料性附录）
扩增产物参考序列
SN/T1681—2011
AAGTCGAGCGGACCTTGTGTTTCTTCGGGAGACGCCAGGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTAGGCAACCTGCCTGTAAGACCGGGATAACTTGCGGAAACGTGAGCTAATACCGGATAGCTGGTTTCTTCGCATGAAGAAGTCATGAAAGACGGGGCAACCTGTCACTTACAGATGGGCCTGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTAGGGTAACGGCTTACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGAACGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGCCAAGGAAGAACGGCCAGGGGAGTAACTGCCCCTGGAGTGACGGTACTTGAGAAGAAAGCCCCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGCGGTCTTTTAAGTCTGGTGTTTAAGCCCGGGGCTCAACCCCGGTTCGCACTGGAAACTGGGAGACTTGAGTGTAGGAGAGGAAAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTTTCTGGCCTATAACTGACGCTGAGGCGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAATGCTAGGTGTTAGGGGTTTCGATACCCTTGGTGCCGAAGTTAACACAGTAAGCATTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGACCCGCACAAGCAGTGGAGTATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGCCTTGACATCCCTCTGACCGGTTTTGAGATAGACCTTTTCCTTCGGGGACAGAGGAGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCACGCAGAGGTGGGCACTCTAAGA9
SN/T 1681-2011
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准
蜜蜂美洲幼虫腐臭病检疫技术规范SN/T1681-2011
中国标准出版社出版
北京复兴门外三里河北街16号
邮政编码：100045
网址spc.net.cn
电话：6852394668517548
中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷*
开本880×12301/16
印张1字数19千字
2011年11月第一版bzxZ.net
：2011年11月第一次印刷
印数1—1600
书号：155066·2-22640定价18.00元11189/
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蜜蜂美洲幼虫腐臭病检疫技术规范Quarantineprotocolfor American foulbrood of honeybees2011-05-31发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2011-12-01实施
本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。本标准代替了SN/T1681—2005《蜜蜂美洲幼虫腐臭病诊断方法》。本标准与SN/T1681—2005相比，主要技术变化如下：修改了标准的名称；
-增加了“现场检验检疫”、“生理特征鉴定”及PCR检测”内容；修改了原标准的“采样方法”、“直接检查法”及“分离培养与鉴定”SN/T 1681—2011
本标准修改采用国际兽疫局（OIE）《陆生动物疾病诊断试验和疫苗标准手册》（2008版）中2.2.2章，主要修改如下：
原文中\introduction\等内容经修改简缩后作为本标准附录A；原文格式及内容顺序排版上做了调整。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国湖北出入境检验检疫局。本标准主要起草人：郭明星、曾宪东、冯汉利、陈建军、赵晖、颜志立、朱堂明、王振华。本标准所代替标准的历次版本发布情况为：SN/T1681-2005。
TIKANYKACA
1范围
蜜蜂美洲幼虫腐臭病检疫技术规范SN/T1681—2011
本标准规定了蜜蜂美洲幼虫腐臭病的现场检验检疫、采样、实验室诊断等检疫技术规范。本标准适用于进出境蜜蜂美洲幼虫腐臭病的检疫及本病的流行病学调查、诊断和监测规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T18088出人境动物检疫采样
3试剂和材料
3.1幼虫芽孢杆菌（Paenibacilluslarvaesubsp.larvae）标准菌株由OIE参考实验室或国家质量监督检验检疫总局指定的实验室提供。3.2引物
3.2.1PCR引物
E游I物:5'-CTTGTGTTTCTTTCGGGAGACGCC-3下游引物：5-TCTTAGAGTGCCCACCTCTGCG-3”扩增片段大小：1106bp。
3.2.2巢式PCR引物
3.2.2.1巢式PCR外侧引物
上游引物：5'-TCGAGCGGACCTTGTGTT-3下游引物:5-CTA TCTCAAAACCGGTCAGAG-3”扩增片段大小：969bp。
3.2.2.2巢式PCR内侧引物
上游引物：5'-CTTCGCATGAAGTCATG-3”下游引物：5'-TCAGTTATAGGCCAGAAAGC-3*扩增片段大小：572bp。
3.3Taq酶。
3.4dNTPs：含dCTP、dGTP、dATP、dTTP各10mmol/L。DNAMarker。
漠化乙锭。
3.7异丙醇。
10mmol/LTris·HCl-1mmol/LEDTA溶液(pH8.0)。3.8
3.9胡萝下酵母琼脂培养基。
马铃薯培养基。
3.11酵母浸膏培养基。
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4器材和设备
4.1PCR扩增仪。
4.2电泳仪及电泳槽。
4.3凝胶成像分析仪。
4.4恒温培养箱。
4.5高速冷冻离心机。
4.6普通光学显微镜。
5现场检验检疫
临床变化特征结合病原鉴定是诊断蜜蜂美洲幼虫腐臭病的依据（参见附录A）。开箱，提蜂脾查看，出现下列病理变化特征之一者，可做出初步诊断。颜色变化：房盖潮湿、下陷、颜色发暗显油光。通常，患病幼虫身体变软，虫体在患病1周内体色为白色至棕黄色，2周后为深棕色，3周后为棕黑色。死亡幼虫的头部朝向房盖，虫体顺着背部下塌，虫体由正常呈“C”型变为呈竖立姿势。惠病幼虫残体1个月后十调，形成硬黑色的鳞片，紧贴巢房下侧，在310nm～400nm紫外光照射下可发出荧光。巢房变化：出现“插花子脾”现象，即后期房盖穿孔，巢脾上出现空巢房与卵房、幼虫房、封盖房相间排列的现象。
丝状、粘性物：用一根火柴杆插人虫体可拉出长10cm～15cm、褐色、胶体状、有鱼臭味的细丝。蛹舌现象：蛹期发生死亡的蛹在房顶部有蛹头突出的现象是美洲幼虫腐臭病典型的症状之一。6采样
按GB/T18088要求，采集蜂巢的病变区域或疑似受感染的蜜蜂幼虫作为首选样品，亦可用蜂房（不小于20cm2）或取临近蜂巢的蜜蜂食物（30g~50g）作为样品。7
实验室诊断
7.1病原形态学鉴定
取幼虫5条10条，置研钵中，加少量无菌水，制成悬液，取悬液涂片、风干、固定，加2滴5%孔雀绿加热至沸腾，待明水蒸于，用蒸馏水洗涤；再加0.5%番红染色30S，水洗、吸干，镜检，若发现游离状态呈绿色的芽孢即可判定
7.2病原分离培养
待检样品用无菌生理盐水1：5～1：10稀释，接种到胡萝下酵母琼脂培养基（见B.1)或马铃薯培养基（见B.2)或酵母浸膏培养基（见B.3）上，35℃～37℃培养24h，幼虫芽孢杆菌能形成浅乳白色、半透明、有光泽、微隆起的菌落。7.3生化特征鉴定
幼虫芽孢杆菌的生化特征鉴定包括过氧化氢酶反应（见C.1）、硝酸盐还原酶反应（见C.2）、酪蛋白水解反应（见C.3）、淀粉水解反应（见C.4）、柠檬酸盐反应（见C.5）、碳水化合物产酸反应（见C.6）、白2
TKANYKAa
SN/T1681—2011
明胶液化反应（见C.7）等试验。生化特征如下：幼虫芽孢杆菌过氧化氢酶实验呈阴性反应，硝酸盐还原酶实验呈阴性反应，产吲哚和二羟基丙酮试验阳性，分解酪氨酸试验阴性，酪蛋白水解反应阳性，淀粉水解反应阴性，脲素水解反应阳性，柠檬酸盐反应阴性，发酵试验（D-葡萄糖十，L-阿拉伯糖一，甘露醇一，D-术糖一，甘油十，棉籽糖一）.能迟缓性液化白明胶，不产生靛基质，G+C为42%～43%。7.4生理特征鉴定
7.4.1改良悬滴技术
取可疑幼虫残留物样品水悬浮液一滴于盖玻片上，烘干固定，用石灰酸品红染色30s，用蒸馏水滴覆盖盖玻片，再将盖玻片倒置在涂有薄层镜油的载玻片上，用吸水纸轻轻吸干载玻片溢出的水分，在高倍显微镜下观察镜油中形成袋状水滴的区域，幼虫芽孢杆菌的芽孢在显微镜视野下呈布郎运动，其他芽孢杆菌的芽孢则静止不动。改良悬滴技术可以区别幼虫芽孢杆菌的芽孢与其他芽孢杆菌的芽孢，敏感性较低，不作为确诊的依据。
7.4.2Holst牛乳试验
取患病干虫户（或可疑样品鳞片、患病幼虫涂抹物）悬浮于加有1%脱脂牛奶溶液的小试管中，37℃孵育，若有幼虫芽孢杆菌及其芽孢存在，此时牛乳发生凝固，接着在10min～20min内变清7.5PCR检测
7.5.1核酸抽提
幼虫芽孢杆菌培养物的核酸抽提取可疑菌落悬浮于50uL蒸馏水中，95℃，水浴15min，5000g离心5min，其上清液作为核酸模板。
7.5.1.2可疑病理物的核酸抽提
将两只可疑患病幼虫于1mL无菌蒸馏水中勾质后，取该勾质液100μL加人到900uL无菌蒸馏水中混匀，再取100μL混悬液95℃，水浴15min，5000g.离心5min，取上清液作为模板7.5.1.3芽孢的核酸抽提
芽孢悬浮液4℃，6000g离心30min，弃上清液。沉淀物最大功率超声波处理5min，然后加人30μL10mmol/LTris·HCl-1mmol/LEDTA溶液（pH8.0）。蜂蜜中的芽孢，用无菌蒸馏水透析后进行上述处理。也可将芽孢培养后再提取DNA，即：将可疑样品接种营养肉汤，37℃培养2h～24h，14500g，离心5min，沉淀用无菌蒸馏水清洗两次，再用200μL的无菌蒸馏水悬浮。按照7.5.1.1煮沸法提取DNA。
7.5.2普通PCR
7.5.2.1反应体系
反应体系成分：10×PCR缓冲液5μL、25mmoL/L氯化镁5μL、25mmoL/LdNTP2μL、上游引物和下游引物（40pmol)各1.0μL、Taq酶2.5U、DNA10μL，加水到50μL。设立标准菌株悬液按7.5.1.1抽提的核酸为模板作为阳性对照、健康虫体按7.5.1.2抽提的核酸为模板作为阴性对照、双蒸水为模板作为空白对照。
TTKANYKAa
SN/T 1681—2011
7.5.2.2反应条件
95℃预变性10min，然后93℃60s、55℃30s、72℃60s，30个循环，最后72℃延伸5min，4℃保存。
7.5.3巢式PCR
7.5.3.1外侧扩增反应体系及反应条件反应体系成分：10×PCR缓冲液5μL、25mmoL/L氯化镁5μL、25mmoL/LdNTP2μL、外部折增上游引物和下游引物（40pmol/L)各1.0μL、Taq酶1.25U、芽孢提取的DNA模板10μL，加水到50μL。设立标准菌株悬液按7.5.1.1抽提的核酸为模板作为阳性对照、健康虫体按7.5.1.2抽提的核酸为模板作为阴性对照、双蒸水为模板作为空白对照。外侧扩增反应条件：94℃30s、69℃59℃（每个循环退火温度降低0.5℃的TouchdownPCR)30s、72℃45s，20个循环，然后94℃30s、59℃30s、72℃45s.20个循环，最后72℃延伸5min，4℃保存。7.5.3.2内侧扩增反应体系及反应条件反应体系成分：10×PCR缓冲液5μL、25mmoL/L氯化镁5μL、25mmoL/LdNTP2μL、内部折增上游引物和下游引物（40pmol/L)各1.0μuL、Taq酶1.25U、外部扩增反应产物（作为模板）1uL，加水到50L。设立外侧扩增反应中阳性对照、阴性对照的扩增产物为相应的阳性对照、阴性对照，双蒸水为模板作为空白对照。内侧扩增反应条件：94℃30s59℃30s、72℃45s.30个循环最后72℃延伸5min，4℃保存。
7.5.4电泳
使用1%琼脂糖凝胶进行电泳，溴化乙锭终浓度为0.5μg/mL~1μg/mL，100V电泳约30min。采用凝胶成像分析仪进行扩增产物的分析。7.5.5结果
普通PCR
阳性对照扩增片段大小1106bp，阴性对照、空白对照无扩增产物。样品扩增片段大小与阳性对照一致即为阳性，若无扩增片段或扩增片段大小与阳性对照不符即为阴性。阳性片断应测序并与参考序列（参见附录D)进行比对
7.5.5.2巢式PCR
阳性对照外部扩增片段大小为969bp、内部扩增片段大小为572bp阴性对照、空白对照无扩增产物。样品两次扩增片段大小均与阳性对照一致即为阳性，若两次扩增片段大小均无扩增产物或与阳性对照不一致，即为阴性。阳性片断应测序并与参考序列（参见附录D)进行比对。A
TKANYKAa
附录A
（资料性附录）
蜜蜂美洲幼虫腐臭病
SN/T1681—2011
蜜蜂美洲幼虫腐臭病（Americanfoulbroodofhoneybees）是由幼虫芽孢杆菌（幼虫类芽孢杆菌幼虫亚种，Paenibacilluslarvaesubsp.larvae)引起的蜜蜂幼虫和的一种细菌性、急性、毁灭性传染病。特征为病蜂的蜂盖子脾下陷、穿孔、封盖幼虫和大幼虫死亡等。本病最初发生于英国，后传到欧美各国，现全世界均有发生。世界动物卫生组织(OIE)把此病列为检疫对象。蜜蜂美洲幼虫腐臭病的病原为幼虫芽孢杆菌，其营养细胞没有感染力，只有芽孢才能诱发疾病。一个感染的幼虫体内可产生10亿多个芽孢。其芽孢能抵抗热、消毒剂和干燥，90℃、100℃水中分别能活3h和13h，0.1%升汞、福尔马林溶液中分别能活5d和6h，在自然界中可生存35年以上。悬浮在蜂蜜中的芽孢阳光照射下能存活4周～6周受幼虫芽孢杆菌污染的饲料、巢脾和花粉均可传播此病，内勤蜂在清理巢房和清除患病幼虫户体时，把病菌带进蜜、粉房，通过饲喂将幼虫芽孢杆菌传给健康幼虫。用带菌的蜂蜜喂蜂或随意调换巢脾可促使此病在蜂群间传播。蜂场上的盗蜂及迷巢蜂也可传播本病。蜡、人和小蜂螨等传播美洲幼虫腐烂病方面起着很大的作用
本病多在夏秋季发生流行，潜伏期为7d左右·通常感染孵化24h左右的幼虫，其易感性随虫龄增长而下降，孵化53h后的幼虫就不再感染此病了。该病的发生与蜜蜂的品种有一定关系，东方蜜蜂比西方蜜蜂对本病的抵抗力要强。蜂王的幼虫比同种蜜蜂的工蜂幼虫和雄蜂幼虫更容易被幼虫芽孢杆菌感染。
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B.1胡萝卜酵母琼脂培养基
附录B
（规范性附录）
培养基的制备
胰蛋白陈10g，无水磷酸氢二钾（K，HPO.)0.5g，琼脂3g，胡萝卜浸出液200mL（将100g洗净的胡萝卜磨碎，加人250mL水，静置30min，过滤而成），酵母浸膏3g，蒸馏水1000mL混匀，调pH值至6.8。在0.105MPa的压力下灭菌20min。B.2
马铃薯培养基
将去皮马铃薯200g切成片，加水1000mL，煮沸30min～40min，过滤，加葡萄糖20g，琼脂20g，调pH值至7.0.在0.105MPa的压力下灭菌15min。B.3
酵母浸膏培养基
酵母浸膏1g，葡萄糖1g，无水磷酸氢二钾（K,HPO,)1.36g，琼脂2g，蒸馏水100mL，调pH值至6.6，在0.068MPa的压力下灭菌20min。6
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C.1过氧化氢酶反应
附录C
（规范性附录）
生化鉴定操作规范
SN/T 1681—2011
挑取培养的菌落转移到载玻片上，滴加3%的过氧化氢一滴，产生泡沫者为阳性，否则为阴性。幼虫芽孢杆菌呈阴性反应。
2硝酸盐还原酶反应
细菌接种到含有硝酸钾（1mg/L～2mg/L）的心、脑浸出物琼脂培养基上。细菌开始生长后.滴加一滴对氨基-α-萘基苯磺酸，如果硝酸盐被还原为弧硝酸盐，培养血呈现红色，为阳性反应。幼虫芽抱杆菌呈阴性反应。
C.3酪蛋白水解反应
溶液A（10g脱脂牛奶，90mL蒸馏水）和溶液B（3g琼脂糖，97mL蒸馏水），两种溶液先分别灭菌（121℃,20min），然后在不同的容器内加热至45℃使之充分混匀倒人接种有24h培养物的培养血中，培养7d。在菌落生长区下面和周围的培养基出现澄清现象者为阳性反应。幼虫芽孢杆菌呈阳性反应。
C.4淀粉水解反应
在肉汁陈中加0.2%可溶性淀粉，灭菌倒平板备用。取新鲜斜面培养物点种于上述平板，37℃培养2d～5d,形成明显菌落后，在平板上滴加卢哥氏碘液（与革兰氏染液中的碘液相同）至平板警蓝黑色菌落周围如有不变色透明圈，表明淀粉水解阳性，仍是蓝黑色者为阴性。幼虫芽孢杆菌不分解淀粉。C.5柠檬酸盐反应
氯化钠1g、硫酸镁0.2g、磷酸二氢铵0.5g、柠檬酸钠2g、蒸馏水1000mL、0.04%酚红液20mL、琼脂12g，混匀灭菌倒斜面试管备用。在斜面上划线接种，37℃培养3d～7d。培养基为碱性（指示剂蓝色或桃红色）者为阳性，否则为阴性。幼虫芽孢杆菌不利用柠檬酸盐。碳水化合物的产酸反应
氯化钾0.2g、硫酸镁0.2g、磷酸氢二铵1g、酵母膏0.2g、蒸馏水1000mL、0.04%溴甲酚紫15mL、糖或醇类10g、琼脂12g.混匀调pH至7.0~7.2.分装试管，灭菌备用。幼虫芽孢杆菌在需氧条件下分解葡萄糖和海藻糖并产酸，但不能使阿拉伯糖和木糖产酸TKANYKAa
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白明胶液化反应
将细菌培养物接种到装有纯白明胶的试管中，28℃培养4周，其间每隔3d～4d检查一次白明胶的变化。每次检测前，将培养物放置20℃，4h，以使未变化的白明胶同化。幼虫芽孢杆菌可使白明胶液化。
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附录D
（资料性附录）
扩增产物参考序列
SN/T1681—2011
AAGTCGAGCGGACCTTGTGTTTCTTCGGGAGACGCCAGGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTAGGCAACCTGCCTGTAAGACCGGGATAACTTGCGGAAACGTGAGCTAATACCGGATAGCTGGTTTCTTCGCATGAAGAAGTCATGAAAGACGGGGCAACCTGTCACTTACAGATGGGCCTGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTAGGGTAACGGCTTACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGAACGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGCCAAGGAAGAACGGCCAGGGGAGTAACTGCCCCTGGAGTGACGGTACTTGAGAAGAAAGCCCCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGCGGTCTTTTAAGTCTGGTGTTTAAGCCCGGGGCTCAACCCCGGTTCGCACTGGAAACTGGGAGACTTGAGTGTAGGAGAGGAAAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTTTCTGGCCTATAACTGACGCTGAGGCGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAATGCTAGGTGTTAGGGGTTTCGATACCCTTGGTGCCGAAGTTAACACAGTAAGCATTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGACCCGCACAAGCAGTGGAGTATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGCCTTGACATCCCTCTGACCGGTTTTGAGATAGACCTTTTCCTTCGGGGACAGAGGAGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCACGCAGAGGTGGGCACTCTAAGA9
SN/T 1681-2011
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准
蜜蜂美洲幼虫腐臭病检疫技术规范SN/T1681-2011
中国标准出版社出版
北京复兴门外三里河北街16号
邮政编码：100045
网址spc.net.cn
电话：6852394668517548
中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷*
开本880×12301/16
印张1字数19千字
2011年11月第一版bzxZ.net
：2011年11月第一次印刷
印数1—1600
书号：155066·2-22640定价18.00元11189/
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