SN/T 2853-2011 闭合孢子虫病检疫技术规范 SN/T2853-2011 标准压缩包解压密码：www.bzxz.net

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T2853—2011
闭合孢子虫病检疫技术规范
Quarantineprotocolformikrocytosmackini2011-05-31发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2011-12-01实施
中华人民共和国出人境检验检疫行业标
闭合孢子虫病检疫技术规范
SN/T2853—2011
中国标准出版社出版
北京复兴门外三里河北街16号
邮政编码：100045
网址spc.net.cn
电话：6852394668517548
中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷开本880×12301/16
2011年11月第一版
印张1.75
字数49千字
2011年11月第一次印刷
印数1—1600
书号：155066：2-22671
定价27.00元
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本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。SN/T2853—2011
本标准是参考采用OIE的《水生动物疾病诊断手册》（2006版）中2.2.5章《闭合孢子虫感染》（infectionwithmikrocytosmackini)，对涉及组织学、透射电镜及原位杂交检测的部分内容进行了补充和完善。
本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国厦门出入境检验检疫局、中华人民共和国深圳出人境检验检疫局和中华人民共和国山东出人境检验检疫局。本标准主要起草人：孔繁德、徐淑菲、刘、陈信忠、龚艳清、王景明、周斌华、徐彪。1
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1范围
闭合孢子虫病检疫技术规范
SN/T2853—2011
本标准规定了用于检测牡蛎闭合孢子虫病的临床诊断方法、组织印迹法、组织切片法、透射电镜法、PCR方法和核酸原位杂交等方法
本标准适用于牡蛎闭合孢子虫病的流行病学调查、监测、诊断和出入境检验检疫。2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3材料和设备
3.1试剂和材料
除另有规定外，下列所用生化试剂均为分析纯。试剂配制方法见附录A。实验用水符合GB/T6682要求。
3.1.1组织切片制备和染色试剂：姬姆萨（Giemsa）染液、苏木精-伊红染色液、伊红染液、俾斯麦棕Y、返蓝液：BCIP/NBT；Davidsons液、甲醛、戊二醛、涂有氨基烷基硅烷的载玻片、盖玻片、石蜡、Epsor812、DNP-30、DDSA（十二烷基琥珀酸酐）、MNA（六甲酸酐）。3.1.2DNA提取试剂：蛋白酶K、酚-三氯甲烷抽提法所需要的相关试剂或其他DNA抽提试剂盒3.1.3PCR试剂：10XPCR缓冲液（不含镁离子）、25mmol/L氯化镁、10mmol/LdNTPs、5U/μLHotstartTaq聚合酶、DNAMakerDL2000、6X电泳上样缓冲液等，均为商品化试剂盒中成分。琼脂糖5X电泳缓冲液（TBE）。
3.1.4有机试剂：甲醇、无水乙醇、丙酮、甘油、异丙醇、二甲苯、氧化丙烯、封片树胶和液氮。3.1.5无机试剂：氯化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、叠氮钠、醋酸铀、柠檬酸铅和海水。3.1.6引物及探针：包括一对PCR引物和地高辛标记的核酸探针，均根据SSUrDNA的基因序列（GenBank：AF477623：该虫大小为1457bp片段的序列）设计。上游引物：52-AGATGGTTAATGAGCCTCC-3*（19bP.位置318~336）下游引物：5-GCGAGGTGCCACAAGGC-3（17bp，位置847～863）该对引物扩增产物大小为546bp。探针：3端用地高辛标记的探针序列，序列为5-AGCCCACAGCCTTCAC-3*-地高辛（16bp位置1287~1302)。
3.1.7阴性和阳性对照：由国家质量监督检验检疫总局指定实验室提供。3.2设备
3.2.1切片机。
3.2.2组织匀浆研磨器。
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3.2.3PCR仪。
3.2.4扫描电子显微镜。
5制冰机。
生物安全柜。bzxz.net
核酸蛋白测定仪。
高压灭菌锅。
电泳仪、电泳槽。
3.2.10旋涡振荡器。
高速离心机、超速离心机。
凝胶成像仪或紫外透射仪。
3.2.13石蜡包埋模具和电镜包埋模具。3.2.14滤器和滤膜（孔径为0.22μm）。4诊断方法
4.1临床诊断方法
4.1.1临床症状
闭合孢子虫病资料参见附录B。春季发生死亡或口张开的牡蛎，在软组织中（如：外壳、体壁、内收肌、唇状触须或套膜表面）可观察到含有直径达5mm的黄绿色小脓疱、溃疡或脓肿（参见附录C和附录D），显微镜观察可见细胞间有红细胞浸润；外壳上经常有褐色伤疤，与覆盖在外壳表面的脓肿或溃疡面相连；在受到损害的组织中心可能会有组织坏死现象，主要为空泡性结缔组织细胞内病灶性感染，常导致血细胞渗透和组织坏死；由粒状血细胞和透明白细胞组成的脓肿可能含有小细胞，直径1um~3μm；除非患有脓疱，不然感染牡蛎通常直到死亡仍然表现良好，有些不表现任何临床特征。4.1.2结果判定
上述所有这些变化并不是闭合抱子虫病的特异症状，而且部分感染闭合抱子虫病的牡蛎无临床症状，需进一步通过实验室诊断确诊。4.2采样
4.2.1采样点的选择
应根据实际情况，一个区域的一个种群至少选取3个采样点，大范围的几块不连续地区养殖易感品种，应增加采样点。
4.2.2采样技术要求
4.2.2.1有临床症状的牡蛎
挑选濒死的或可疑的活个体。采样时牡蛎应当是活的，牡蛎应当在活体或杀死后分别包装放在密封冰藏的容器中送到实验室。所采集的牡蛎应严格避免冰冻。主要采集牡蛎的软组织，包括外壳、内收肌、唇状触须或套膜表面，尤其含有脓疱的部位。4.2.2.2以监测为目的的采样
监测时间应选在一年中最能观察到临床症状并能观察到该虫的温度和季节。样品应包括该地所有2
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的易感品种。每次采样的牡蛎数量要以感染率等于或大于2%时检出的概率进行抽样。最常见的情况是应采集150个以上牡蛎。对无临床症状的牡蛎，取其内收肌或套膜表面等。4.2.2.3样品保存及运送
采集的样品应在24h内送人实验室，且要附有标签，清楚标明采样时间、地点、来源和养殖历史。4.3组织印迹法
4.3.1组织样品的选择
主要采集带脓疱的感染晚期的活牡蛎。4.3.2制片
用手术刀将脓疱组织切成两半，将切面溢出的液体用吸水纸吸干，然后在干净的载玻片表面轻压做触片，在载玻片上形成薄层膜，自然干燥，丙酮固定印迹5min~10min，用姬姆萨染色（见A.1），染色5min10min，流水冲洗，晾干，用1000倍油镜观察。该方法特异性很低，因为该虫与组织印迹的微细胞很相像。只是出现脓疱时用此法检测的敏感性比传统组织学方法好。4.3.3结果判定
在宿主细胞外经常可观察到微细胞，由于扭曲变形，其直径大约4um，而存在其中的闭合孢子虫直径为2μm～3μm，通常有蓝色的细胞质（嗜碱性的）和一个小的红色的细胞核的判为阳性。4.4组织切片法
4.4.1取样要求和组织切片制作流程采集濒死或刚死不久的牡蛎。制备组织块包括样品的固定、脱水、浸蜡、包埋、切片、染色和封片等一系列步骤。
4.4.2固定组织块
将新鲜组织按照常规制作组织切片的方法制作。即将新鲜的脓疱或内收肌组织等切成1mm左右的小块，对较大的样品，采用Davidsons液（见A.5）或10%甲醛（见A.6）固定24h。而对较小的样品，可用3%戊二醛（见A.7）固定，并且它们可兼做电镜样品。也可用海水配制固定液。为了保证有好的固定效果，固定液和组织块的体积比应为10：1。此时应避免固定时间过长（超过24h）。4.4.3样品脱水、浸蜡和石蜡包埋取出固定好的组织块，修整组织块，更换固定液重新固定12h，自来水冲洗，然后按照箭头所指顺序进行脱水、浸蜡和包埋。70%乙醇1h-→85%乙醇1h-→95%乙醇45min→95%乙醇45min-→无水乙醇30min→无水乙醇30min→无水乙醇二甲苯（50：50）30min→二甲苯5min～20min→二甲苯5min~20min→石蜡1h～1.5h-→石蜡1h~1.5h→包埋。4.4.4制备切片
当包埋了组织块的石蜡冷却固化形成蜡块后，用切片机将其切成2μm～3μm厚的薄片。把切片贴在已经硅化的载玻片上，除去水分并于60℃干燥过夜。在此温度下能去掉剩余的潮气使切片牢固附在载玻片上。
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4.4.5染色和封片
在染色之前，先将切片在二甲苯或其他毒性相对较小的透明液中浸泡10min以除掉石蜡。重复浸泡一次后再用无水乙醇浸泡两次，每次10min，然后再在95%乙醇、85%乙醇和70%乙醇中依次浸泡2min以除去二甲苯，最后在蒸馏水中浸泡3min重新水化。在进行染色时·按照箭头所指顺序进行，苏木精（见A.2）染色5min~20min→自来水洗3min→1%盐酸酒精（见A.9）8s~15s-→自来水洗3min→返蓝液（见A.10）2min~5min-→自来水5min→蒸馏水5min→85%乙醇2min85%乙醇2min→0.5%伊红染液（见A.3）lmin~2min→95%乙醇2min-95%乙醇2min-无水乙醇2min-→无水乙醇2min-→二甲苯2min→二甲苯2min-→封片。苏木精-伊红染色后，用1000倍油镜观察。细胞核和嗜碱性结构染成蓝色或深紫色，内质网染成蓝色，细胞质染成灰色。而伊红把其他结构染成粉红色。虽然这种染色只使细胞结构出现很少儿种不同的颜色，但足以检测组织和细胞结构中的任何不正常变化。其他染色技术也可以用来检测某些特殊的结构或者所特指的特性（如：用三色染色法给结缔组织和细胞质颗粒染色）（参见附录D）。4.4.6结果判定
在空泡性结缔组织细胞和肌细胞的细胞质里，通常是在与红细胞渗透较为严重的宿主细胞内，若找到直径大约2μm～3um的球形微细胞，则判为阳性。对于易感宿主，假如有该虫感染的证据，就能诊断为阳性若为非易感宿主，则可通过SSUrDNA的基因序列的测定，与该虫大小为1457bp片段的序列（GenBank：AF477623)进行比对，就能诊断是否为阳性。4.5透射电镜法
4.5.1样品的采集和固定
要求采集活的或刚死不久的牡蛎组织并尽快固定。4.5.2固定组织块
把样品用0.1mol/L磷酸盐缓冲液（pH7.4）（见A.14）洗净，切成厚度不超过1mm的小组织块。用3%戊二醛来固定样品2h（固定时间过长会导致膜状结构变形），然后样品用0.1mol/L磷酸盐缓冲液（pH7.4）洗3次，再用1%的钱酸（见A.15）固定2h，最后用0.1mol/L磷酸盐缓冲液（pH7.4）洗2次。如果样品事先已用Carsons液（见A.8）固定并保存在Carsons液中，则应先用o.1mol/L磷酸盐缓冲液（pH7.4）洗儿次再用3%戊二醛固定4.5.3脱水和包埋样品
样品在一系列的乙醇中浸泡脱水：70%乙醇1次10min，95%乙醇2次，每次15min，无水乙醇40min（中间换液3次）。然后在氧化丙烯中浸泡2次，每次10min，以达到完全脱水，以便随后用Epor812（是一种树脂）（见A.12)或其他树脂浸透。样品被逐步浸透。首先是在氧化丙烯-Epon812包埋剂（50/50）（见A.13）的混合物中，35℃浸泡45min，再放入Epon812包埋剂中，45℃浸泡2h。浸泡的时间越长，组织块被浸透得越好。将上述处理好的样品放人盛满新鲜Epon812包埋剂的包埋模具中进行包埋，方向应为保持所需组织的全层结构为准。在每个模板上写好标记，然后放在60℃（是Epon812包埋剂的聚合温度）作用48h4.5.4切片和复染
先用切片把树脂块切成适当大小，然后用超薄切片机切片。先切一些0.5um～1μm的半薄片放4
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在涂有蛋白甘油加水的载玻片上，然后于37℃烘箱内烘干待染（若急用，可于酒精灯上加热烘干）。用光镜检查以控制样品的质量，并通过它们找到切片上值得注意的区域。将1%甲苯胺蓝染液（见A.4）滴在切片上，约3min～5min左右（若室温较低，可在酒精灯上加热数秒钟，但不能沸腾），然后用蒸留水冲洗切片上多余的染液，滤纸吸干水分，自然干燥后加一滴合成树脂用盖玻片封片，在光镜下观察。可见组织细胞被染成蓝色，结构清晰，树脂无着色且染色适度。将制作好的80nm～100nm厚的超薄切片放到铜网格上，滴加醋酸铀（见A.16）染色30min，用蒸馏水清洗三次，然后滤纸吸干后滴加柠檬酸铅（见A.17）染色30min，用蒸馏水清洗三次.然后滤纸吸干后，自然干燥即可电镜观察。4.5.5结果判定
阳性结果可以在空泡性结缔组织细胞、肌细胞和红细胞里看到寄生虫存在，有三种形态。G/G细胞有一个围绕卵圆形核的中心环，还有不到7个不活跃的核膜包围的高尔基体池，少量小泡和溶酶体样物体。这些均发生在空泡性结缔组织细胞、红细胞、内收肌和心肌细胞以及细胞外的环境中。小泡细胞含有许多小的包裹和未包裹的小泡，缺乏核膜样的高尔基体，核膜有时膨胀成一个小泡池，它们通常在内收肌、心肌细胞内，与宿主细胞内的线粒体紧密相连。内涵体细胞有一个膨胀的核膜，内质网，质膜和内涵体均在细胞质出现。不像别的微细胞，闭合抱子虫没有线粒体及其装备、也很少细胞质的细胞器官，只是在核子中心有核仁。不管哪种形式的闭合孢子虫，均很少细胞器官，可能是由于长期处于寄生状态，依赖宿主细胞器官，因此减少了寄生虫细胞器官的需要（参见附录E）。4.6聚合酶链式反应（PCR）
4.6.1采样和DNA的提取
4.6.1.1采样
要求采集活的或刚死不久的牡蛎。采集的样品保存在95%乙醇中，直到进行DNA提取。主要取其软组织（如：外壳、内收肌、唇状触须或套膜表）等进行DNA提取，可采用商品化的DNA提取试剂盒进行提取。
4.6.1.2样品DNA的抽提
将新鲜牡蛎的软组织25mg置于冰冷的生理盐水中反复冲洗，滤纸吸干表面水分后置于组织勾浆研磨器中并加入冷的生理盐水，进行手工匀浆研磨。注意整个过程在冰上完成；然后将匀浆液倒入2mL塑料离心管中，加20μL蛋白酶K（见A.19），再加SDS（见A.20)至终浓度为1%，上下颠倒混匀；混合液置于55℃水浴，水浴2.5h；接着向勾浆液中按1：1比例加酚/三氯甲烷/异戊醇混合液（25：24：1)（见A.21），轻轻振荡混匀5min，12000g离心5min；吸上层水相800μL于一灭菌塑料离心管中，再加人等体积酚/三氯甲烷/异戊醇混合液，轻轻振荡混勾5min，12000g离心5min；吸上层水相500μL于一塑料离心管中，加人两倍体积的无水乙醇，一20℃放置2h或液氮中放置5min；12000g离心5min，沉淀DNA，吸弃上清液；于沉淀中加人75%乙醇溶液500μL，轻轻混匀后12000g离心5min，吸弃上清液，室温挥干；向DNA沉淀中加200μLTE缓冲液（见A.25），一20℃保存备用。或者采用等效的DNA提取试剂盒·按照说明书进行操作。4.6.2反应体系
样品模板用灭菌水或Tris缓冲液（pH7.0~7.2）稀释成浓度为10ng/μL~40ng/μuL，反应体系为15μL体系。
10XPCR反应缓冲液（不含镁离子）1.50μl
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25mmol/LMgClz
10mmol/LdNTPs
1μmol/L上游引物
1μmol/L下游引物
5U/μLHotstartTaq酶
最后加样品模板
补充灭菌水至
4.6.3反应条件
预变性：94℃
扩增：按下列程序进行40个循环扩增。94℃
延伸：72℃
设立对照
在样品处理过程中应设立阳性样品对照、阴性样品对照、空白对照。4.6.4.12
4.6.4.2取含有已知闭合孢子虫的组织作为阳性对照。4.6.4.3取正常组织作为阴性对照。4.6.4.4取等体积的水代替模板作为空白对照。4.6.5琼脂糖电泳
用0.5XTBE（见A.26）电泳缓冲液配制1.5%的琼脂糖（含0.1μg/mLEB.即溴化乙锭.见A.27）均匀铺板，厚度为3mm~5mm。将平板放入水平电泳槽，使电泳缓冲液刚好淹没胶面。将5μL样品和1μL6×电泳上样缓冲液（见A.28）混匀后加人样品孔。在电泳时设立DNAMarkerDL2000作对照，5V/cm电泳约30min，当溴酚蓝到达底部时停止。4.6.6结果判定
4.6.6.1在紫外灯下观察核酸条带并判断结果。4.6.6.2电泳后观察阳性对照会出现一条546bp的DNA片段，而阴性对照和空白对照没有该核酸带。
4.6.6.3待测样品电泳后在相应546bpDNA的位置上有核酸条带者为阳性。若不属于该虫的感染范围的宿主，则可通过SSUrDNA的基因序列的测定，与该虫大小为1457bp片段的序列（GenBank；AF477623，参见附录F)进行比对，就能诊断是否为阳性。4.6.6.4无条带或条带的大小不是546bp的为阴性。4.7核酸原位杂交技术（DIG-ISH方法）4.7.1总则
按照组织切片的方法制备脓疱和内收肌等组织的石蜡切片，然后用标记的寡核苷酸探针进行杂交用地高辛标记的探针与闭合孢子虫有很强的杂交效果6
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4.7.2采样和DNA的提取
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要求最好采集活的或刚死不久的牡蛎，不过经验证即使死了很久，基至腐烂的组织也可以检测。可采集临床具有小红细胞症并且有黄绿色病变的软组织（如：外壳、内收肌、唇状触须或套膜表）等，也可以采集用嗜碱（性）的组织（如：消化腺、肠上皮细胞和性腺），也可用心脏、腮和肾脏等。若无法及时进行检测实验，则可将采集的样品保存在95%乙醇中，直到进行核酸原位杂交。若要提高检出率，样品中的闭合孢子虫能够通过过滤技术进行浓缩。DNA提取方法同4.6.1.2。4.7.3操作过程
4.7.3.1脱蜡
取一块已经硅化的载玻片，将组织切片粘附在载玻片上，加二甲苯覆盖组织切片，室温作用2min，重复三次；接着用不同浓度的异丙醇对切片进行水化，首先用100%异丙醇重复三次，然后用80%、50%和30%的异丙醇依次作用一次，每次作用均为室温30s；然后用自来水洗1min。最后用PBS缓冲液平衡1min。
4.7.3.2用蛋白酶K消化组织
取上述脱蜡的载玻片，加人200μL的蛋白酶K溶液，使得溶液覆盖和渗透载玻片上的组织切片，置于湿盒内，37℃孵育10min。倒掉载玻片上消化液，用含0.2%氨基乙酸的PBS缓冲液（见A.11)洗两遍后再加人此液室温浸泡5min，以终止消化作用。4.7.3.3加乙酰基团于载玻片
先将载玻片用含5%（体积分数）乙酸酐的0.1mol/LTris-HCL（pH8.0）（见A.24）浸泡10min，然后用PBS洗10min，再用4×SSC(见A.30）洗2次，每次5min，以封闭非特异性结合部位。以上作用均在室温进行。
4.7.3.4预杂交
加20μL～30μL预杂交液（见A.36）于载玻片上的组织切片中，置于湿盒内，42℃作用1.5h～2h4.7.3.5杂交
去掉预杂交液，加入20μL～30μL含有10ng/μL地高辛标记的闭合孢子虫病核酸探针的杂交液（见A.37）于载玻片上的组织切片中，同时盖上硅化的盖玻片，于95C作用5min（自的使样品核酸变性)后将整个玻片放回湿盒内，42℃作用过夜（大约16h～18h，具体时间根据杂交信号和背景的强弱而定）。
4.7.3.6洗涤
小心翼翼地取下盖玻片，用0.5×SSC（见A.31）洗三遍，每次42℃作用2min。4.7.3.7加酶
取杂交好的载玻片，用含0.3%吐温-20的D1G1洗涤缓冲液（见A.43）冲洗后再加此液浸泡，室温作用5min；然后加200μuLD1G2封闭液（见A.44）载玻片组织切片上，置于湿盒内，室温孵育30min，以封闭非特异性结合部位：倒掉封闭液，拭十组织切片周围的载片，注意保持切片湿润，加入200L标记抗地高辛抗体-碱性磷酸酶溶液（用前用D1G2封闭液作1：1000稀释）于载玻片组织切片上，置于湿7
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盒内，室温孵育1h；用含0.3%吐温-20的D1G1洗涤缓冲液冲洗后再加此液浸泡两次，每次室温作用10min；最后加D1G3缓冲液（见A.45）浸泡洗涤，室温作用5min。4.7.3.8加底物显色和结果判定
加200μLBCIP/NBT颜色底物反应液（用D1G3缓冲液作1：50稀释）于组织切片中，置于暗湿盒内，室温孵育10min~30min（最长可达2h，定期取出切片在显微镜下检测反应强度，根据反应强度决定延长或终止反应），组织切片中闭合孢子虫虫体的反应颜色为紫蓝色，而其他宿主组织呈黄色。然后用自来水简单漂洗以终止颜色反应，再用伸斯麦棕Y溶液（见A.18）复染，室温作用10s~120s，最后同样用自来水简单漂洗直至自来水无色为正。经过复染，更清晰地显示寄生虫在宿主组织中的位置。
该方法能与闭合孢子虫强烈反应，而与牡蛎组织、其他甲壳类动物和细菌均不发生反应。地高辛标记的探针方法用手检测感染情况，其灵敏度比苏木精和曙红染色的标准组织切片方法要高很多。探针法检测观察只需较低的放大倍数（100倍～200倍）观察即可，而染色法观察则即使放大倍数达1000倍也难以辨认虫体(参见附录G)。
不同应用自的的方法评价
目前进行闭合孢子虫的监控、检测和诊断的方法，见表1。表1闭合孢子虫的监控、检测和诊断方法方法
综合症状
组织印片
组织学
电子显微镜
DNA探针-原位杂交
注：表中的诊断说明：
A表示此方法有效，诊断结果具有特异性和敏感性，推荐使用B表示此方法具有良好的特异性和敏感性，是一种标准方法初
C表示此方法已在某些情况下采用，但由于费用、准确性或其他因素，其应用受到严格限制D表示目前不推荐应用此方法。
该技术不具有种特异性，但在春季，明显是闭合孢子虫感染时，可用于宿主及区域检测6确诊标准
6.1可疑病例的定义
每年春季，在已知地理分布范围内的已知可疑物种，由脓胞组织印片、综合症状、组织学或PCR方法之一诊断的可疑病例，判定为阳性。8
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在其他宿主及已知地理分布范围之外的闭合孢子虫，由组织学、PCR或原位杂交方法诊断的可疑病例判定为阳性。
6.2确证病例的定义
经脓胞组织印片、组织学、PCR或原位杂交并结合电子显微镜的方法，确诊为闭合孢子虫阳性。但需要进行SSU区域的基因测序来最后确诊9
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