SN/T 2856-2011
基本信息
标准号： SN/T 2856-2011
中文名称：非洲马瘟检疫技术规范
标准类别：商检行业标准(SN)
标准状态：现行
出版语种：简体中文
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标准分类号
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出版信息
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标准简介
SN/T 2856-2011 非洲马瘟检疫技术规范
SN/T2856-2011
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标准内容
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T2856—2011
非洲马瘟检疫技术规范
QuarantineprotocolforAfricanhorsesickness2011-05-31发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2011-12-01实施
本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草SN/T2856—2011
本标准参考了国际动物卫生组织《陆生动物诊断试验与疫苗手册》（2008版)中2.5.1章非洲马瘟诊断技术”。
本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国山东出入境检验检疫局、中华人民共和国深圳出入境检验检疫局、中华人民共和国云南出人境检验检疫局、中华人民共和国北京出入境检验检疫局。本标准主要起草人：邓明俊、肖西志、朱来华、凌宗帅、郑小龙、孙敏、梁成珠、花群义、周晓黎、高志强。
TYKAONTKACa
1范围
非洲马瘟检疫技术规范
SN/T2856—2011
本标准规定了非洲马的临床诊断要点、非洲马实验室病毒分离技术、反转录聚合酶链式反应技术（RT-PCR）、实时荧光RT-PCR检测技术、RT-PCR分型鉴定技术、血清中和试验（SNT）、酶联免疫吸附试验（ELISA）等实验室操作的技术要求。本标准适用于进出口马、驴、骤等马属动物非洲马瘟的检疫、诊断和血清学调查，2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用手本文件GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB16548病害动物和病害动物产品生物安全处理规程GB/T18088出人境动物检疫采样
GB19489实验室生物安全通用要求3临床诊断
3.1发病症状
首先使个体或群体马保持安静，观察其精神状态、呼吸状况、站立姿势注意观察头部、颜面及体表是否出现特征性水肿。其次，观察马匹运动状况，是否有行动迟缓、行为异常等现象。在临床诊断观察中应重点注意以下几点：
a）马匹表现出严重的呼吸道症状，呼吸频率达60次/min甚至75次/min，出现不同程度的呼吸困难，在数小时内突然死亡；
b）马匹站立时前腿分开、头向前伸、鼻孔扩大，呈现出痉挛性咳嗽，同时从鼻孔向外流出泡沫样液体；
马匹呈现急性发热或弛张型发热，持续1d～2d或5d～8d，最高体温可达40℃～41℃；c）
出现特征性水肿，主要表现在颜部、眶上窝和眼脸、嘴唇、面颊、舌部、下颌骨间，有的皮下水肿d
可扩展到颈部至胸部；
结膜和舌腹侧以及皮下有出血点；e)
f）厌食和精神抑郁，有的烦躁不安，表现出类似疝痛症状。非洲马瘟相关资料参见附录A
3.2病理变化
病理剖检应注意观察以下要点：a）项韧带水肿；
b）畜体肌肉间隙水肿并呈胶冻样；多处组织淤血并形成大量淤斑；c）
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肺部组织水肿（近一半感染动物出现这一特征）：e)
皮下组织呈现黄色胶冻样水肿；f
心包积水、体内大量腹水；
盲肠和结肠浆膜表面有很多点状出血。4
实验室诊断
4.1病毒分离鉴定
注：非洲马瘟病毒分操作过程应该在具有三级生物安全的实验室内完成。4.1.1
试剂与材料
Vero细胞或BHK-21细胞
RPMI1640培养基或其他等效培养基。胎牛血清。
青霉素、链霉素。
肝素。
各种常规试剂及细胞培养相关耗材。设备
4.1.2.1走
超净工作台或生物安全柜。
高速冷冻离心机。
倒置光学显微镜。
二氧化碳细胞培养箱。
高压灭菌锅。
样品菜集
血液样品
颈静脉无菌采集动物的肝素抗凝血，置一20℃保存备用。4.1.3.2
组织样品
无菌采集动物的脾、肺、淋巴结等组织，保温盒加冰冷藏保存，迅速送往指定的实验室。若需长期保存，置一70℃。
4.1.4组织样品的前处理
取采集的组织2g~4g，以pH7.2的PBS液将其研磨成10%的悬液。悬液中加入青霉素（终浓度为100IU/mL）、链霉素（终浓度为100μg/mL），1000r/min离心10min，收取上清液一5℃～-30℃保存备用。
4.1.5病毒增殖
4.1.5.1血样
培养状态良好的Vero细胞或BHK-21细胞。无菌抗凝血样勿需稀释可直接用于接种细胞：取适量血样样品接种单层细胞，37℃吸附60min。充分洗涤后加维持液，置37℃5%二氧化碳培养箱培养。血液样品也可先用pH7.2的PBS液或细胞培养液洗涤两次，然后反复冻融（充分裂解，以排除血2
-TY KANY KAca
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液中可能含有的抗体对游离病毒的中和，同时促进病毒从红细胞中大量释放）。用含抗生素的PBS液对裂解的血样做1：10稀释，接种单层细胞进行病毒增殖。24h后逐日观察细胞病变（CPE），连续观察8 d。
4.1.5.2组织样品
培养状态良好的Vero细胞或BHK-21细胞。取适量预先处理好的组织悬液，无菌接种到生长良好的细胞单层，37℃吸附60min后加细胞维持液，置37℃含5%二氧化碳培养箱，24h后逐日观察CPE情况，连续观察10d。10d后无细胞病变的样品继续盲传2代，仍无CPE的则判为AHSV阴性。阳性病料一般会在接种后2d～8d内出现CPE，待80%细胞出现CPE时，收取细胞毒。将感染细胞反复冻融3次，3000r/min离心20min，小心收取上清液，等量分装后保存（一5℃~一30℃），待进一步鉴定。
4.1.5.3乳鼠接种
选择10只1d～3d龄健康乳鼠，每只乳鼠脑内接种20μL组织悬液。阳性病料一般在接种3d~～15d后，乳鼠可表现出神经症状。取发病鼠脑，匀浆处理，脑内接种8只乳鼠。第二次传代后乳鼠会在2d～5d内发病，感染率为100%。收集发病鼠脑，匀浆后以1000r/min离心10min，取上清液等量分装后保存（一5℃～一30℃），待进一步鉴定。4.1.6病毒分离鉴定
分离的细胞毒或乳鼠脑毒可采用ELISA病原检测、反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）、荧光PCR检测技术等进行非洲马瘟病毒及病毒血清型鉴定4.2酶联免疫吸附试验（ELISA）注：该方法为双抗夹心ELISA抗原检测，可对疫区或周边地区非洲马瘟的传播媒介（昆虫）以及非洲马瘟病毒的宿主（马属动物)进行流行病学的病原调查，特别适用于非洲马瘟疾病的早期诊断。4.2.1试剂与材料
4.2.1.10.05mol/LpH9.6碳酸钠/碳酸氢钠缓冲液（包被液）。4.2.1.2
酶标抗体（兔抗豚鼠lgG-辣根过氧化物酶结合物）。4.2.1.3标准阳性抗原（指定单位提供）。4.2.1.4
标准阴性对照（指定单位提供）。捕获抗体（指定单位提供）。
豚鼠抗血清（指定单位提供）。4.2. 1.6
4.2.1.70.01mol/LpH7.4的PBS液。4.2.1.8吐温-20。
脱脂奶粉。
4.2. 1. 10
1 mol/L硫酸。
96孔酶标板。
4.2. 1. 11
4.2.2设备
4.2.2.1酉
酶标仪。
4.2.2.2洗板机。
恒温振荡培养箱。
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4.2.2.4各种规格微量移液器
4.2.2.5各种ELISA试验用相关耗材。4.2.3操作步骤
4.2.3.1固相包被
将预先滴定好的免抗血清（捕获抗体）用包被液稀释到工作浓度，每孔50μL包被96孔板，置湿盒内室温过夜孵育。
4.2.3.2洗板
以pH7.4的0.05%PBST洗板5次，最后一次要充分吸去孔内剩余液体（以下洗板方法同此）。4.2.3.3封闭
以含有5%（质量浓度）脱脂奶粉的PBST（封闭液）对包被板进行封闭，每孔加100μL.置37℃温箱内，振荡孵育1h（150r/min）。4.2.3.4加检测样品
洗板后，在预先设置好的板孔分别加100μL稀释度为1：128待测样品。试验同时设立重复孔的阳性抗原和阴性抗原对照。然后放置37℃温箱，振荡孵育1h。4.2.3.5加豚鼠抗血清
洗板后，以0.05%PBST将预先滴定好的豚鼠抗血清稀释到工作浓度，每孔加50μL，置37℃，振荡孵育1h（150r/min）。
4.2.3.6加酶标抗体
洗板后，以PBST将预先滴定好的酶标抗体稀释到工作浓度，每孔50μL。置37℃振荡孵育1h，4.2.3.7显色反应
充分洗板后，每孔加50uL新鲜制备的含有0.05%H，O2（30%体积分数）的OPD底物溶液（浓度为0.4mg/mL），置避光处15min。按加底物的顺序每孔加50μL终止液，10min内读板。4.2.3.8读板
以492nm波长测定吸光值，记录结果。4.2.4结果判定
如果检测样品的吸光值低于0.1.判为AHSV阴性。如果检测样品的吸光值高于0.15，判为AHSV阳性。如果检测样品的吸光值介于0.1和0.15之间则判为可疑。可疑样品需重复检测，重复仍然可疑，判定为AHSV阳性。
4.3反转录聚合酶链式反应检测技术（RT-PCR）4.3.1试剂与材料
4.3.1.1One-stepRT-PCRkit(Qiagen公司）：包含RT和PCR酶，dNTP混合液、PCR缓冲液，氯化TYKAONTKACa
镁等PCR反应核心试剂。也可选用等效的其他商业化试剂盒。4.3.1.2RNA酶抑制剂。
4.3.1.3TAE电泳液。
4.3.1.4DEPC（焦碳酸二乙酯）。4.3.1.5琼脂糖。
4.3.1.6EB染色液。
4.3.1.7DNA低相对分子质量Marker。4.3.1.8各种分子生物学试验常用分析纯试剂。4.3.1.9引物
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上游引物primer1(20pmol/μL)：5-GGCTCCAACACTCACAAGATGT-3下游引物primer2(20pmol/μL)：5-GGCGGATTAATAGGCTGCATA-34.3.2设备
高速冷冻离心机。
4.3.2.2各种规格移液器。
4.3.2.3普通PCR仪。
凝胶成像系统。
电泳仪。
4.3.3病毒dsRNA提取
对采集的抗凝血、病料组织匀浆液、病毒细胞培养物等待检测样品，可使用商业化的RNA提取试剂盒（如：选用Roche公司的HighPureviralNucleicAcidKit），按照试剂盒使用说明书的步骤提取非洲马瘟病毒dsRNA。
采用相同的方法对非洲马瘟病毒阳性病料组织，非洲马瘟病毒阴性组织样品提取核酸，分别作为RT-PCR反应的阴、阳性对照模板。4.3.4操作步骤
注：以下操作按照one-stepRT-PCRkit提供说明书的要求完成。4.3.4.1dsRNA变性
对每一检测样品准备如下反应混合液（10μL）：上游引物（0.5uL）；下游引物（0.5μL）；无核酸酶的灭菌水（7μL）；RNA模板（2μL）。将反应管放置在热循环仪上，95℃5min，稍做离心后迅速将管放置在冰上。
4.3.4.2准备RT-PCR反应液
取一洁净1.5mL离心管，根据检测样品的数量（含对照品）准备RT-PCR的反应液，其中每15μL的PCR混合液中包含：无核酸酶的灭菌水（3.25μL）；5×PCR缓冲液（5μL）；10mmol/LdNTP混合液（0.5μL)；5XQ液5μL；RNA抑制剂（0.25μL，20U/μL)，酶混合液（1μL）。取15μLRT-PCR反应混合液与4.3.4.1预变性处理的10μL预变性RNA模板溶液混合。每次RT-PCR检测反应，都应设置阳性对照（2μLAHSVRNA作模板）和阴性对照（2μL灭菌水代替RNA模板）。
4.3.4.3RT-PCR反应
将反应管置PCR仪，依次设置如下热循环参数后运行PCR程序。5
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55℃30min；95℃15min；94℃30s，58℃30s.72℃30s，40个循环；72℃延伸7min。4.3.4.4电泳
PCR运行结束后.取出PCR反应管·在内加2.5μL10X载样缓冲液后，将样品置于以TAE配制的3%的琼脂糖凝胶中，在含有EB(终浓度为0.5μg/mL)的TAE电泳液中电泳。DNAMarker与检测样品一并电泳。
电泳条件：150V~200V的恒定电压下，电泳30min。4.3.5结果判定
电泳结束后，在紫外光下观察电泳结果。对照标准DNAMarker，若检测样品PCR产物中出现与阳性对照大小一致的条带（102bp），那么该样品判定为非洲马瘟病毒阳性。若检测样品在凝胶中未出现与阳性对照大小一致的条带，那么该检测样品判定为非洲马瘟病毒阴性。阴性对照无PCR产物，4.4实时荧光RT-PCR检测技术（Realtime-RTPCR）4.4.1主要试剂与材料
QuantiTectprobeRT-PCRkit（Qiagen公司）：包含RT和PCR酶，dNTP混合液、含氯化镁4.4.1.1
的PCR缓冲液（mastermix）等PCR反应核心试剂。也可选用等效的其他商业化的realtimeRT-PCR试剂盒。
4.4.1.2RNA酶抑制剂。
4.4.1.3DEPC(焦碳酸二乙酯）灭菌水。4.4.1.4引物和探针。
上游引物primer1(20pmol/μL):5-GGCTCCAACACTCACAAGATG-T-3下游引物primer2(20pmol/μL)：5'-GGCGGATTAATAGGCTGCATA-3TaqMan-MGB探针(10pmol/uL):52-FAM-TGGCACGCCTTACGCGC-NFQ-MGB-34.4.1.5各种分子生物学试验常用分析纯试剂。4.4.2主要设备
高速冷冻离心机、荧光PCR仪
4.4.2.2各种规格移液器。
4.4.3病毒dsRNA提取
病毒核酸的提取方法同4.3.3。
4.4.4操作步骤
4.4.4.1dsRNA变性
对每一检测样品预先准备如下混合液（10μuL）：上游引物（0.75μL，20pmol/μL）；下游引物（0.75μL，20pmol/μL）；无核酸酶的灭菌水（6.5μL）；RNA模板（2μL）。将反应管放置在热循环仪上，95℃5min，稍做离心后迅速将管放置在冰上备用。4.4.4.2准备RT-PCR反应液
取一个1.5mL离心管，根据检测样品的数量（包含对照品）准备RT-PCR的反应液，其中每15μL6
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的PCR反应液中包含：无核酸酶的灭菌水（1.375μL）；TagMan-MGB探针（0.625μL，10pmol/μL）；2XPCR预混液（mastermix，12.5μL）；RNA抑制剂（0.25μL，20U/μL），RT酶混合液（0.25μL）。取15μLRT-PCR反应混合液与4.4.4.1预变性处理的10μLRNA模板溶液在光学PCR反应管内混合均勾后上机。每次进行RT-PCR反应，都应设置阳性对照（2μLAHSVRNA作模板）和阴性对照（2μL灭菌水代替RNA模板）。4.4.4.3RT-PCR反应
将反应管置荧光PCR仪，设置如下热循环温度参数后运行程序。55℃30min；95℃15min；94℃15s，60℃1min，45个循环。4.4.5结果判定
阴性对照、空白对照、及未感染AHSV的检测样品，Ct值大于45；感染AHSV的阳性检测样品和阳性对照品Ct值小于45，其中强阳性样品的Ct可小于30。4.5RT-PCR分型鉴定技术
注：该技术主要对非洲马瘟病毒的9个血清型进行PCR分型鉴定4.5.1试剂与材料
4.5.1.1TaqDNA聚合酶、AMV反转录酶、dNTP。DEPC（焦碳酸二乙酯）。
4.5.1.3琼脂糖。
EB染色液。
DNA标准低相对分子质量Marker。4.5.1.5
各种分子生物学试验常用分析纯试剂。4.5.2设备
高速冷冻离心机。Www.bzxZ.net
各种规格移液器。
普通PCR仪。
凝胶成像系统。
电泳仪。
操作步骤
病毒dsRNA提取
病毒dsRNA的提取方法同4.3.3。4.5.3.2
引物的准备
按表1提供的引物序列分别合成非洲马瘟病毒9.个血清型的引物，用DEPC水将其配制成5pmoL/μL的工作浓度。
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血清型
AHSV-1
AHSV-2
AHSV-3
AHSV-4
AHSV-5
AHSV-6
AHSV-7
AHSV-8
AHSV-9
不同AHSV血清型的引物序列
上游引物（Forwardprimer）
F, :5-GTTTAATTCACCATGGCGTC-3F2:5-AATTGTGATGTTATTGTTAC-3
F :5-GTTTAATTCACCATGGCGTC-3
F.:5-GTTTAATTCACCATGGCGTC-3
F:5-AATTGTGATGTTATTGTTAC-3
F:5-GTTTAATTCACCATGGCGTC-3
F:5-GTTTAATTCACCATGGCGTC-3
F::5-TGCTCGACATATATGTATCA-3
F,:5-GTTTAATTCACCATGGCGTC-3
RT-PCR反应
下游引物（Reverseprimer）
R :5-TGTTTGGCGATACATCGTA-3
R2:5-AATTTGGCAATACATGGTT-3
R:5-AATCTGTTCATAAATCATTC-3
R.:5-ATATTTTCCTCATTTCG-3
R.:5-CAATATTTTGCTTAGCTC-3
R:5-GGATTTTTCCAATACTT-3
R,：5-GATCTTTATTTTTTGTAGTT-3R::5-ATTTCGTAACGTAATTCAGA-3
R,:5-CGTTTGTTTGTACATAAAA-3
非洲马瘟病毒不同血清型分型鉴定的RT-PCR反应参数见表2。分别根据表2中不同血清型对应的引物及RT-PCR条件进行操作。表2
血清型
AHSV-1
AHSV-2
AHSV-3
AHSV-4
AHSV-5
AHSV-6
AHSV-7
AHSV-8
AHSV-9
引物对
反转录
各引物对优化的PCR扩增条件
℃min
终末延伸
产物大小
以AHSV-1为例.取5μLdsRNA置20μL反转录体系反（具体组分见表3)转录制备cDNA模板。将反应管置42℃，45min后迅速取出反应管置冰浴备用。表3
5×反转录酶浓缩缓冲液
dNTP混合液
RT及PCR各组分
10×Tag酶浓缩缓冲液
25mmol/L的氯化镁
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下游引物R1
RNA酶抑制剂(20U）
逆转录酶AMV(5U)
灭菌水
20 μL
表3（续）
上、下游引物
TaqDNA聚合酶（5U)
cDNA模板
灭菌水
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各1μ
取5uLcDNA模板于5OμLPCR反应体系（具体组分见表3）。将反应管置PCR仪.设置如下参数：95℃5min；95℃1min，50℃1min，70℃，2min，40个循环；70℃，8min延伸。试验同时设立阴性对照、阳性对照和空白对照。4.5.4结果判定
将以上分型的RT-PCR扩增产物在2.0%琼脂糖凝胶中电泳（含EB染液），紫外灯下观察扩增产物。在阴阳性对照、空白对照成立的前提下，结合表2中各血清型引物对应扩增产物的大小及有无，可分别判定非洲马瘟病毒的血清型。4.6竞争ELISA抗体检测（CompetitiveELSIA，C-ELISA）注：该技术为群特异性的竞争ELISA，主要用于非洲马瘟的血清学调查，可广泛适用于非洲马瘟病毒各种血清型的检测，特别适用于骤、驴等临床症状轻微或不表现临床症状的血清学检测。对非洲马瘟的传播（速度）、疫病的分布、疫苗的评价具有一定的实际意义。该方法既可用于非洲马瘟阳性血清样品的初筛，也可用于阳性血清样品抗体滴度的测定。
4.6.1试剂与材料
0.01mol/LpH7.4的PBS液。
4.6.1.20.05mol/LpH9.6碳酸盐/重碳酸盐缓冲液。4.6.1.3吐温-20、脱脂奶粉。
OPD底物溶液（现用现配）。
终止液（1mol/L硫酸）。
标准AHSV-9病毒抗原（指定单位提供）。阳性对照血清、阴性对照血清、豚鼠抗AHSV-9血清（指定单位提供）。酶标抗体（免抗豚鼠IgG-辣根过氧化物酶结合物）。各种常规ELISA试验用试剂（配制见附录B)。4.6.2
酶标仪、洗板机。
振荡恒温培养箱。
各种规格微量移液器、96孔酶标板。9
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4.6.3操作步骤
固相包被
取一新的96孔板，将AHSV抗原解冻后按预先标定或标签上标明的滴度用包被液稀释到工作浓度（OD42值约为1.0～1.2），充分混勾。每孔加50uL包被在96孔酶标板，置湿盒4℃过夜孵育。4.6.3.2洗板
以pH7.4的PBST液洗板5次，并充分除去孔内剩余液体（以下洗板方法同此）4.6.3.3
封闭及上样
初筛试验封闭及加样程序
如表4所示，在检测孔分别加40L封闭液和10μL待检血清样品；阴性对照孔分别加40μL封闭液和10μL阴性血清样品；豚鼠抗血清对照孔加50μL封闭液；空白对照孔加100μL封闭液；阳性血清对照孔A～G各加50μL封闭液，H孔加80μL。随后在H孔加20μL阳性血清样品，混匀后吸取50uL到G孔，依次倍比稀释到A孔，弃去50L。这样阳性对照从H～A的稀释度依次为1：5～1：640.检测样品和阴性对照品的稀释度均为1：5。表4血清样品C-ELISA初筛试验
阳性对照
阴性对照
空白对照
豚鼠抗血
清对照
注：检测血清稀释度为1：5.斜体数字代表样品编号9
将豚鼠抗血清按照预先标定或试剂标签上标明的滴度以PBST稀释到工作浓度，除空白对照外，其余各孔分别加人50μL豚鼠抗血清。封板后置37℃温箱振荡孵育1h。4.6.3.5阳性血清抗体滴度测定的封闭及加样程序如表5所示，阴性对照孔分别加40μL封闭液和10μL阴性血清样品；豚鼠抗血清对照孔加50μL封闭液；空白对照孔加100μL封闭液；阳性血清对照孔和检测血清孔A～G各加50μL封闭液，H孔加80μL封闭液。随后在检测孔和阳性对照的H孔各加20μL相应的检测血清和阳性对照血清，混勾后吸取50μL到G孔，依次倍比稀释到A孔，弃去50μL。这样阳性对照和检测血清从H～A的稀释度依次为1：5～1：640.阴性对照品的稀释度均为1：5。10
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本标准参考了国际动物卫生组织《陆生动物诊断试验与疫苗手册》（2008版)中2.5.1章非洲马瘟诊断技术”。
本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国山东出入境检验检疫局、中华人民共和国深圳出入境检验检疫局、中华人民共和国云南出人境检验检疫局、中华人民共和国北京出入境检验检疫局。本标准主要起草人：邓明俊、肖西志、朱来华、凌宗帅、郑小龙、孙敏、梁成珠、花群义、周晓黎、高志强。
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1范围
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本标准规定了非洲马的临床诊断要点、非洲马实验室病毒分离技术、反转录聚合酶链式反应技术（RT-PCR）、实时荧光RT-PCR检测技术、RT-PCR分型鉴定技术、血清中和试验（SNT）、酶联免疫吸附试验（ELISA）等实验室操作的技术要求。本标准适用于进出口马、驴、骤等马属动物非洲马瘟的检疫、诊断和血清学调查，2规范性引用文件
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3.1发病症状
首先使个体或群体马保持安静，观察其精神状态、呼吸状况、站立姿势注意观察头部、颜面及体表是否出现特征性水肿。其次，观察马匹运动状况，是否有行动迟缓、行为异常等现象。在临床诊断观察中应重点注意以下几点：
a）马匹表现出严重的呼吸道症状，呼吸频率达60次/min甚至75次/min，出现不同程度的呼吸困难，在数小时内突然死亡；
b）马匹站立时前腿分开、头向前伸、鼻孔扩大，呈现出痉挛性咳嗽，同时从鼻孔向外流出泡沫样液体；
马匹呈现急性发热或弛张型发热，持续1d～2d或5d～8d，最高体温可达40℃～41℃；c）
出现特征性水肿，主要表现在颜部、眶上窝和眼脸、嘴唇、面颊、舌部、下颌骨间，有的皮下水肿d
可扩展到颈部至胸部；
结膜和舌腹侧以及皮下有出血点；e)
f）厌食和精神抑郁，有的烦躁不安，表现出类似疝痛症状。非洲马瘟相关资料参见附录A
3.2病理变化
病理剖检应注意观察以下要点：a）项韧带水肿；
b）畜体肌肉间隙水肿并呈胶冻样；多处组织淤血并形成大量淤斑；c）
TTKANTKACa
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肺部组织水肿（近一半感染动物出现这一特征）：e)
皮下组织呈现黄色胶冻样水肿；f
心包积水、体内大量腹水；
盲肠和结肠浆膜表面有很多点状出血。4
实验室诊断
4.1病毒分离鉴定
注：非洲马瘟病毒分操作过程应该在具有三级生物安全的实验室内完成。4.1.1
试剂与材料
Vero细胞或BHK-21细胞
RPMI1640培养基或其他等效培养基。胎牛血清。
青霉素、链霉素。
肝素。
各种常规试剂及细胞培养相关耗材。设备
4.1.2.1走
超净工作台或生物安全柜。
高速冷冻离心机。
倒置光学显微镜。
二氧化碳细胞培养箱。
高压灭菌锅。
样品菜集
血液样品
颈静脉无菌采集动物的肝素抗凝血，置一20℃保存备用。4.1.3.2
组织样品
无菌采集动物的脾、肺、淋巴结等组织，保温盒加冰冷藏保存，迅速送往指定的实验室。若需长期保存，置一70℃。
4.1.4组织样品的前处理
取采集的组织2g~4g，以pH7.2的PBS液将其研磨成10%的悬液。悬液中加入青霉素（终浓度为100IU/mL）、链霉素（终浓度为100μg/mL），1000r/min离心10min，收取上清液一5℃～-30℃保存备用。
4.1.5病毒增殖
4.1.5.1血样
培养状态良好的Vero细胞或BHK-21细胞。无菌抗凝血样勿需稀释可直接用于接种细胞：取适量血样样品接种单层细胞，37℃吸附60min。充分洗涤后加维持液，置37℃5%二氧化碳培养箱培养。血液样品也可先用pH7.2的PBS液或细胞培养液洗涤两次，然后反复冻融（充分裂解，以排除血2
-TY KANY KAca
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液中可能含有的抗体对游离病毒的中和，同时促进病毒从红细胞中大量释放）。用含抗生素的PBS液对裂解的血样做1：10稀释，接种单层细胞进行病毒增殖。24h后逐日观察细胞病变（CPE），连续观察8 d。
4.1.5.2组织样品
培养状态良好的Vero细胞或BHK-21细胞。取适量预先处理好的组织悬液，无菌接种到生长良好的细胞单层，37℃吸附60min后加细胞维持液，置37℃含5%二氧化碳培养箱，24h后逐日观察CPE情况，连续观察10d。10d后无细胞病变的样品继续盲传2代，仍无CPE的则判为AHSV阴性。阳性病料一般会在接种后2d～8d内出现CPE，待80%细胞出现CPE时，收取细胞毒。将感染细胞反复冻融3次，3000r/min离心20min，小心收取上清液，等量分装后保存（一5℃~一30℃），待进一步鉴定。
4.1.5.3乳鼠接种
选择10只1d～3d龄健康乳鼠，每只乳鼠脑内接种20μL组织悬液。阳性病料一般在接种3d~～15d后，乳鼠可表现出神经症状。取发病鼠脑，匀浆处理，脑内接种8只乳鼠。第二次传代后乳鼠会在2d～5d内发病，感染率为100%。收集发病鼠脑，匀浆后以1000r/min离心10min，取上清液等量分装后保存（一5℃～一30℃），待进一步鉴定。4.1.6病毒分离鉴定
分离的细胞毒或乳鼠脑毒可采用ELISA病原检测、反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）、荧光PCR检测技术等进行非洲马瘟病毒及病毒血清型鉴定4.2酶联免疫吸附试验（ELISA）注：该方法为双抗夹心ELISA抗原检测，可对疫区或周边地区非洲马瘟的传播媒介（昆虫）以及非洲马瘟病毒的宿主（马属动物)进行流行病学的病原调查，特别适用于非洲马瘟疾病的早期诊断。4.2.1试剂与材料
4.2.1.10.05mol/LpH9.6碳酸钠/碳酸氢钠缓冲液（包被液）。4.2.1.2
酶标抗体（兔抗豚鼠lgG-辣根过氧化物酶结合物）。4.2.1.3标准阳性抗原（指定单位提供）。4.2.1.4
标准阴性对照（指定单位提供）。捕获抗体（指定单位提供）。
豚鼠抗血清（指定单位提供）。4.2. 1.6
4.2.1.70.01mol/LpH7.4的PBS液。4.2.1.8吐温-20。
脱脂奶粉。
4.2. 1. 10
1 mol/L硫酸。
96孔酶标板。
4.2. 1. 11
4.2.2设备
4.2.2.1酉
酶标仪。
4.2.2.2洗板机。
恒温振荡培养箱。
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4.2.2.4各种规格微量移液器
4.2.2.5各种ELISA试验用相关耗材。4.2.3操作步骤
4.2.3.1固相包被
将预先滴定好的免抗血清（捕获抗体）用包被液稀释到工作浓度，每孔50μL包被96孔板，置湿盒内室温过夜孵育。
4.2.3.2洗板
以pH7.4的0.05%PBST洗板5次，最后一次要充分吸去孔内剩余液体（以下洗板方法同此）。4.2.3.3封闭
以含有5%（质量浓度）脱脂奶粉的PBST（封闭液）对包被板进行封闭，每孔加100μL.置37℃温箱内，振荡孵育1h（150r/min）。4.2.3.4加检测样品
洗板后，在预先设置好的板孔分别加100μL稀释度为1：128待测样品。试验同时设立重复孔的阳性抗原和阴性抗原对照。然后放置37℃温箱，振荡孵育1h。4.2.3.5加豚鼠抗血清
洗板后，以0.05%PBST将预先滴定好的豚鼠抗血清稀释到工作浓度，每孔加50μL，置37℃，振荡孵育1h（150r/min）。
4.2.3.6加酶标抗体
洗板后，以PBST将预先滴定好的酶标抗体稀释到工作浓度，每孔50μL。置37℃振荡孵育1h，4.2.3.7显色反应
充分洗板后，每孔加50uL新鲜制备的含有0.05%H，O2（30%体积分数）的OPD底物溶液（浓度为0.4mg/mL），置避光处15min。按加底物的顺序每孔加50μL终止液，10min内读板。4.2.3.8读板
以492nm波长测定吸光值，记录结果。4.2.4结果判定
如果检测样品的吸光值低于0.1.判为AHSV阴性。如果检测样品的吸光值高于0.15，判为AHSV阳性。如果检测样品的吸光值介于0.1和0.15之间则判为可疑。可疑样品需重复检测，重复仍然可疑，判定为AHSV阳性。
4.3反转录聚合酶链式反应检测技术（RT-PCR）4.3.1试剂与材料
4.3.1.1One-stepRT-PCRkit(Qiagen公司）：包含RT和PCR酶，dNTP混合液、PCR缓冲液，氯化TYKAONTKACa
镁等PCR反应核心试剂。也可选用等效的其他商业化试剂盒。4.3.1.2RNA酶抑制剂。
4.3.1.3TAE电泳液。
4.3.1.4DEPC（焦碳酸二乙酯）。4.3.1.5琼脂糖。
4.3.1.6EB染色液。
4.3.1.7DNA低相对分子质量Marker。4.3.1.8各种分子生物学试验常用分析纯试剂。4.3.1.9引物
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上游引物primer1(20pmol/μL)：5-GGCTCCAACACTCACAAGATGT-3下游引物primer2(20pmol/μL)：5-GGCGGATTAATAGGCTGCATA-34.3.2设备
高速冷冻离心机。
4.3.2.2各种规格移液器。
4.3.2.3普通PCR仪。
凝胶成像系统。
电泳仪。
4.3.3病毒dsRNA提取
对采集的抗凝血、病料组织匀浆液、病毒细胞培养物等待检测样品，可使用商业化的RNA提取试剂盒（如：选用Roche公司的HighPureviralNucleicAcidKit），按照试剂盒使用说明书的步骤提取非洲马瘟病毒dsRNA。
采用相同的方法对非洲马瘟病毒阳性病料组织，非洲马瘟病毒阴性组织样品提取核酸，分别作为RT-PCR反应的阴、阳性对照模板。4.3.4操作步骤
注：以下操作按照one-stepRT-PCRkit提供说明书的要求完成。4.3.4.1dsRNA变性
对每一检测样品准备如下反应混合液（10μL）：上游引物（0.5uL）；下游引物（0.5μL）；无核酸酶的灭菌水（7μL）；RNA模板（2μL）。将反应管放置在热循环仪上，95℃5min，稍做离心后迅速将管放置在冰上。
4.3.4.2准备RT-PCR反应液
取一洁净1.5mL离心管，根据检测样品的数量（含对照品）准备RT-PCR的反应液，其中每15μL的PCR混合液中包含：无核酸酶的灭菌水（3.25μL）；5×PCR缓冲液（5μL）；10mmol/LdNTP混合液（0.5μL)；5XQ液5μL；RNA抑制剂（0.25μL，20U/μL)，酶混合液（1μL）。取15μLRT-PCR反应混合液与4.3.4.1预变性处理的10μL预变性RNA模板溶液混合。每次RT-PCR检测反应，都应设置阳性对照（2μLAHSVRNA作模板）和阴性对照（2μL灭菌水代替RNA模板）。
4.3.4.3RT-PCR反应
将反应管置PCR仪，依次设置如下热循环参数后运行PCR程序。5
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55℃30min；95℃15min；94℃30s，58℃30s.72℃30s，40个循环；72℃延伸7min。4.3.4.4电泳
PCR运行结束后.取出PCR反应管·在内加2.5μL10X载样缓冲液后，将样品置于以TAE配制的3%的琼脂糖凝胶中，在含有EB(终浓度为0.5μg/mL)的TAE电泳液中电泳。DNAMarker与检测样品一并电泳。
电泳条件：150V~200V的恒定电压下，电泳30min。4.3.5结果判定
电泳结束后，在紫外光下观察电泳结果。对照标准DNAMarker，若检测样品PCR产物中出现与阳性对照大小一致的条带（102bp），那么该样品判定为非洲马瘟病毒阳性。若检测样品在凝胶中未出现与阳性对照大小一致的条带，那么该检测样品判定为非洲马瘟病毒阴性。阴性对照无PCR产物，4.4实时荧光RT-PCR检测技术（Realtime-RTPCR）4.4.1主要试剂与材料
QuantiTectprobeRT-PCRkit（Qiagen公司）：包含RT和PCR酶，dNTP混合液、含氯化镁4.4.1.1
的PCR缓冲液（mastermix）等PCR反应核心试剂。也可选用等效的其他商业化的realtimeRT-PCR试剂盒。
4.4.1.2RNA酶抑制剂。
4.4.1.3DEPC(焦碳酸二乙酯）灭菌水。4.4.1.4引物和探针。
上游引物primer1(20pmol/μL):5-GGCTCCAACACTCACAAGATG-T-3下游引物primer2(20pmol/μL)：5'-GGCGGATTAATAGGCTGCATA-3TaqMan-MGB探针(10pmol/uL):52-FAM-TGGCACGCCTTACGCGC-NFQ-MGB-34.4.1.5各种分子生物学试验常用分析纯试剂。4.4.2主要设备
高速冷冻离心机、荧光PCR仪
4.4.2.2各种规格移液器。
4.4.3病毒dsRNA提取
病毒核酸的提取方法同4.3.3。
4.4.4操作步骤
4.4.4.1dsRNA变性
对每一检测样品预先准备如下混合液（10μuL）：上游引物（0.75μL，20pmol/μL）；下游引物（0.75μL，20pmol/μL）；无核酸酶的灭菌水（6.5μL）；RNA模板（2μL）。将反应管放置在热循环仪上，95℃5min，稍做离心后迅速将管放置在冰上备用。4.4.4.2准备RT-PCR反应液
取一个1.5mL离心管，根据检测样品的数量（包含对照品）准备RT-PCR的反应液，其中每15μL6
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的PCR反应液中包含：无核酸酶的灭菌水（1.375μL）；TagMan-MGB探针（0.625μL，10pmol/μL）；2XPCR预混液（mastermix，12.5μL）；RNA抑制剂（0.25μL，20U/μL），RT酶混合液（0.25μL）。取15μLRT-PCR反应混合液与4.4.4.1预变性处理的10μLRNA模板溶液在光学PCR反应管内混合均勾后上机。每次进行RT-PCR反应，都应设置阳性对照（2μLAHSVRNA作模板）和阴性对照（2μL灭菌水代替RNA模板）。4.4.4.3RT-PCR反应
将反应管置荧光PCR仪，设置如下热循环温度参数后运行程序。55℃30min；95℃15min；94℃15s，60℃1min，45个循环。4.4.5结果判定
阴性对照、空白对照、及未感染AHSV的检测样品，Ct值大于45；感染AHSV的阳性检测样品和阳性对照品Ct值小于45，其中强阳性样品的Ct可小于30。4.5RT-PCR分型鉴定技术
注：该技术主要对非洲马瘟病毒的9个血清型进行PCR分型鉴定4.5.1试剂与材料
4.5.1.1TaqDNA聚合酶、AMV反转录酶、dNTP。DEPC（焦碳酸二乙酯）。
4.5.1.3琼脂糖。
EB染色液。
DNA标准低相对分子质量Marker。4.5.1.5
各种分子生物学试验常用分析纯试剂。4.5.2设备
高速冷冻离心机。Www.bzxZ.net
各种规格移液器。
普通PCR仪。
凝胶成像系统。
电泳仪。
操作步骤
病毒dsRNA提取
病毒dsRNA的提取方法同4.3.3。4.5.3.2
引物的准备
按表1提供的引物序列分别合成非洲马瘟病毒9.个血清型的引物，用DEPC水将其配制成5pmoL/μL的工作浓度。
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血清型
AHSV-1
AHSV-2
AHSV-3
AHSV-4
AHSV-5
AHSV-6
AHSV-7
AHSV-8
AHSV-9
不同AHSV血清型的引物序列
上游引物（Forwardprimer）
F, :5-GTTTAATTCACCATGGCGTC-3F2:5-AATTGTGATGTTATTGTTAC-3
F :5-GTTTAATTCACCATGGCGTC-3
F.:5-GTTTAATTCACCATGGCGTC-3
F:5-AATTGTGATGTTATTGTTAC-3
F:5-GTTTAATTCACCATGGCGTC-3
F:5-GTTTAATTCACCATGGCGTC-3
F::5-TGCTCGACATATATGTATCA-3
F,:5-GTTTAATTCACCATGGCGTC-3
RT-PCR反应
下游引物（Reverseprimer）
R :5-TGTTTGGCGATACATCGTA-3
R2:5-AATTTGGCAATACATGGTT-3
R:5-AATCTGTTCATAAATCATTC-3
R.:5-ATATTTTCCTCATTTCG-3
R.:5-CAATATTTTGCTTAGCTC-3
R:5-GGATTTTTCCAATACTT-3
R,：5-GATCTTTATTTTTTGTAGTT-3R::5-ATTTCGTAACGTAATTCAGA-3
R,:5-CGTTTGTTTGTACATAAAA-3
非洲马瘟病毒不同血清型分型鉴定的RT-PCR反应参数见表2。分别根据表2中不同血清型对应的引物及RT-PCR条件进行操作。表2
血清型
AHSV-1
AHSV-2
AHSV-3
AHSV-4
AHSV-5
AHSV-6
AHSV-7
AHSV-8
AHSV-9
引物对
反转录
各引物对优化的PCR扩增条件
℃min
终末延伸
产物大小
以AHSV-1为例.取5μLdsRNA置20μL反转录体系反（具体组分见表3)转录制备cDNA模板。将反应管置42℃，45min后迅速取出反应管置冰浴备用。表3
5×反转录酶浓缩缓冲液
dNTP混合液
RT及PCR各组分
10×Tag酶浓缩缓冲液
25mmol/L的氯化镁
TYKASNTKACa
下游引物R1
RNA酶抑制剂(20U）
逆转录酶AMV(5U)
灭菌水
20 μL
表3（续）
上、下游引物
TaqDNA聚合酶（5U)
cDNA模板
灭菌水
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各1μ
取5uLcDNA模板于5OμLPCR反应体系（具体组分见表3）。将反应管置PCR仪.设置如下参数：95℃5min；95℃1min，50℃1min，70℃，2min，40个循环；70℃，8min延伸。试验同时设立阴性对照、阳性对照和空白对照。4.5.4结果判定
将以上分型的RT-PCR扩增产物在2.0%琼脂糖凝胶中电泳（含EB染液），紫外灯下观察扩增产物。在阴阳性对照、空白对照成立的前提下，结合表2中各血清型引物对应扩增产物的大小及有无，可分别判定非洲马瘟病毒的血清型。4.6竞争ELISA抗体检测（CompetitiveELSIA，C-ELISA）注：该技术为群特异性的竞争ELISA，主要用于非洲马瘟的血清学调查，可广泛适用于非洲马瘟病毒各种血清型的检测，特别适用于骤、驴等临床症状轻微或不表现临床症状的血清学检测。对非洲马瘟的传播（速度）、疫病的分布、疫苗的评价具有一定的实际意义。该方法既可用于非洲马瘟阳性血清样品的初筛，也可用于阳性血清样品抗体滴度的测定。
4.6.1试剂与材料
0.01mol/LpH7.4的PBS液。
4.6.1.20.05mol/LpH9.6碳酸盐/重碳酸盐缓冲液。4.6.1.3吐温-20、脱脂奶粉。
OPD底物溶液（现用现配）。
终止液（1mol/L硫酸）。
标准AHSV-9病毒抗原（指定单位提供）。阳性对照血清、阴性对照血清、豚鼠抗AHSV-9血清（指定单位提供）。酶标抗体（免抗豚鼠IgG-辣根过氧化物酶结合物）。各种常规ELISA试验用试剂（配制见附录B)。4.6.2
酶标仪、洗板机。
振荡恒温培养箱。
各种规格微量移液器、96孔酶标板。9
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4.6.3操作步骤
固相包被
取一新的96孔板，将AHSV抗原解冻后按预先标定或标签上标明的滴度用包被液稀释到工作浓度（OD42值约为1.0～1.2），充分混勾。每孔加50uL包被在96孔酶标板，置湿盒4℃过夜孵育。4.6.3.2洗板
以pH7.4的PBST液洗板5次，并充分除去孔内剩余液体（以下洗板方法同此）4.6.3.3
封闭及上样
初筛试验封闭及加样程序
如表4所示，在检测孔分别加40L封闭液和10μL待检血清样品；阴性对照孔分别加40μL封闭液和10μL阴性血清样品；豚鼠抗血清对照孔加50μL封闭液；空白对照孔加100μL封闭液；阳性血清对照孔A～G各加50μL封闭液，H孔加80μL。随后在H孔加20μL阳性血清样品，混匀后吸取50uL到G孔，依次倍比稀释到A孔，弃去50L。这样阳性对照从H～A的稀释度依次为1：5～1：640.检测样品和阴性对照品的稀释度均为1：5。表4血清样品C-ELISA初筛试验
阳性对照
阴性对照
空白对照
豚鼠抗血
清对照
注：检测血清稀释度为1：5.斜体数字代表样品编号9
将豚鼠抗血清按照预先标定或试剂标签上标明的滴度以PBST稀释到工作浓度，除空白对照外，其余各孔分别加人50μL豚鼠抗血清。封板后置37℃温箱振荡孵育1h。4.6.3.5阳性血清抗体滴度测定的封闭及加样程序如表5所示，阴性对照孔分别加40μL封闭液和10μL阴性血清样品；豚鼠抗血清对照孔加50μL封闭液；空白对照孔加100μL封闭液；阳性血清对照孔和检测血清孔A～G各加50μL封闭液，H孔加80μL封闭液。随后在检测孔和阳性对照的H孔各加20μL相应的检测血清和阳性对照血清，混勾后吸取50μL到G孔，依次倍比稀释到A孔，弃去50μL。这样阳性对照和检测血清从H～A的稀释度依次为1：5～1：640.阴性对照品的稀释度均为1：5。10
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