SN/T 2863-2011
基本信息
标准号： SN/T 2863-2011
中文名称：马脑脊髓炎(东部型和西部型)检疫技术规范
标准类别：商检行业标准(SN)
标准状态：现行
出版语种：简体中文
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标准简介
SN/T 2863-2011 马脑脊髓炎(东部型和西部型)检疫技术规范
SN/T2863-2011
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标准内容
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T2863—2011
马脑脊髓炎（东部型和西部型）检疫技术规范
Quarantineprotocolforequineencephalitis(easternandwestern)2011-05-31发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2011-12-01实施
本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。SN/T2863—2011
本标准修改采用了世界动物卫生组织（OIE）的《陆生动物手册（2009版）第2.5.5章“马脑脊髓炎（东部型和西部型)”。除编辑性修改外，主要技术变化如下：细化了免疫荧光试验方法；
细化了逆转录聚合酶链式反应检测方法；一增加了血凝试验内容；
一修改了IgM捕获ELISA的底物作用时间为30min~35min；删除了补体结合试验
本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国重庆出入境检验检疫局、重庆市进出口食品安全工程技术研究中心、中华人民共和国山东出入境检验检疫局。本标准主要起草人：王昱、李应国、肖进文、梁成珠、聂福平、刘生峰、王国民、李贤良、周启明1
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1范围
马脑脊髓炎（东部型和西部型）检疫技术规范
SN/T2863—2011
本标准规定了东部型马脑脊髓炎和西部型马脑脊髓炎的病毒分离、免疫荧光试验、RT-PCR试验、血凝抑制试验、IgM捕获ELISA和蚀斑减数中和试验的技术要求，本标准适用于进出境动物的东部型马脑脊髓炎和西部型马脑脊髓炎的检疫规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注明日期的引用文件，其最新版本（包括所用的修改单）适用于本文件GB/T18088出入境动物检疫采样
3缩略语
下列缩略语适用于本文件。
3.1EEE(easternequineencephalitis）：东部型马脑脊髓炎3.2WEE（westernequineencephalitis）：西部型马脑脊髓炎3.3VEE（venezuelanequineencephalitis）：委内瑞拉马脑脊髓炎3.4WN（westnilefever）：西尼罗河热3.5RK-13细胞系（rabbitkidney-13cellline）：兔肾细胞系3.6Vero细胞系（africangreenmonkeykidneycellline）：非洲绿猴肾细胞系3.7RT-PCR（reversetranscription-polymerasechainreaction）：逆转录聚合酶链式反应4
生物安全要求
本标准的病毒分离、免疫荧光试验和蚀斑减数中和试验，均需在生物安全Ⅲ级以上的实验室进行。实验人员需提前进行EEE疫苗免疫，蚀斑减数中和抗体滴度在1：40以上。5样品采集
5.1试剂和材料
采血针、离心管、样品瓶、手术镊子、开颅钳、断骨刀、手术剪刀、样品缓冲液（配制见A，1.3）。5.2采样数量和类型
采样的数量按照GB/T18088的要求执行。样品类型包括：血清、脑脊液、组织L脑和（或）脊髓]。1
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5.3采集方法
5.3.1血清样品
采集全血10mL～15mL，提取血清3mL以上，立即低温运送到实验室。5.3.2脑脊液样品
无菌采集脑脊液1mL以上，立即低温运送到实验室5.3.3组织样品
无菌采取动物脑、脊髓，存放于无菌样品瓶，低温48h内运送到实验室。如果48h内无法运送到实验室，则需干冰冷冻运送。
病原分离鉴定
6.1病毒分离
6.1.1设备和器材
低温冰箱、超低温冰箱、二氧化碳培养箱、冷冻离心机（≥3000g）、生物安全柜（ClassⅡ以上）、倒置光学显微镜、细胞瓶、注射器、移液器（1.0mL~10mL）及配套枪头。6.1.2试剂和材料
6.1.2.1RK-13和(或)Vero细胞
6.1.2.2MEM培养基。
6.1.2.33日龄～5日龄乳鼠。
6日龄～8日龄SPF鸡胚。
5胎牛血清（无BVDV抗体及其他牛病抗体）。6.1.2.6
样品缓冲液，配制见A.1.3。
细胞生长液和维持液.配制见A.2.1。6.1.2.8
ATV缓冲液，配制见A.2.2。
6.1.3操作方法
样品制备
组织样品低温均质后，加人样品缓冲液制成10%悬液，1500g，4℃离心20min。取上清液过滤除菌，置冰盒备用。血清、脑脊液直接使用。6.1.3.2细胞分离试验
用适量ATV缓冲液，将培养的RK-13细胞和（或）Vero细胞传代。待细胞长至80%～100%，每瓶细胞按10%体积加入样品悬液.37℃感作1h～2h后加人细胞维持液，37℃培养6d～8d，逐日观察细胞病变。每份样品接种RK-13和（或）Vero细胞各2瓶.同时设定正常培养细胞对照。若第一代培养中无细胞病变.则将细胞反复冻融3次，合并两瓶细胞培养物上清液，取适量上清液感染新的单层细胞；将出现70%90%细胞病变的细胞培养物反复冻融后，取上清液进行RT-PCR和(或)免疫荧光试验鉴定2
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6.1.3.3鸡胚分离
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每份样品接种2枚～4枚6日龄～8日龄SPF鸡胚卵黄囊，0.5mL/枚，孵化7d。弃24h内死亡鸡胚，收集24h后死亡鸡胚，用RT-PCR和（或）免疫荧光试验鉴定。若第一代鸡胚无死亡，再盲传一代6.1.4结果判定
6.1.4.1细胞分离试验
细胞对照无任何细胞病变，细胞生长良好，试验成立。若被检样品连传两代均无细胞病变，判定为阴性；若出现圆缩、脱落等细胞病变，进一步进行RT-PCR和（或）免疫荧光试验。6.1.4.2鸡胚分离试验
若连传两代，均无鸡胚死亡，判定为阴性；若出现鸡胚死亡，进一步进行RT-PCR和（或）免疫荧光试验6.2免疫荧光试验
6.2.1设备和器材
二氧化碳培养箱、生物安全（ClassⅡ以上）、倒置荧光显微镜、低温冰箱、超低温冰箱、Leighton试管和移液器等。
6.2.2试剂和材料
6.2.2.1丙酮。
6.2.2.2Vero细胞。
6.2.2.3MEM培养基。
6.2.2.40.5%伊文思蓝染色液
EEEV和WEEV病毒储液。
阴性血清（和一抗来源相同）。一抗[EEEV抗体和（或）WEEV抗体]。FITC标记二抗（FITC标记物种特异性抗体）。FITC标记一抗[EEEV抗体和（或）WEEV抗体]。6.2.2.10
细胞生长液和维持液，配制见A.2.16.2.2.11
ATV缓冲液，配制见A.2.2。
PBS溶液，配制见A.3.1。
封闭溶液（含封闭液1和封闭液2），配制见A.3.2。封固溶液，配制见A.3.3。
6.2.3操作方法
准备试验
6.2.3.1.1加入ATV缓冲液，将Vero细胞传代到Leighton试管，37℃，5%二氧化碳培养1d～2d。待细胞长至80%～100%，取0.1mL待鉴定的分离培养物感染Vero细胞，每个样品接种6支～7支Leighton试管，同时设立1支2支正常培养细胞对照。用MEM培养基将EEEV和WEEV病毒储液稀释到100TCIDso～1000TCIDs后感染Vero细胞，作阳性对照。加入适量细胞维持液，37℃5%二氧化碳培养，
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6.2.3.1.2逐日取出一块玻片，PBS溶液润洗一次，一70℃预冷丙酮固定5min~10min。6.2.3.1.3滴加FITC标记一抗.37℃湿盒孵育25min45min后，PBS溶液润洗一次。6.2.3.1.4用新鲜PBS溶液浸泡5min~10min，双蒸水润洗1次，空气中干燥，滴加一滴封固溶液，加盖片，用荧光显微镜（490nmol/L）进行观察。确定出最佳感染效果后，将余下的玻片固定备用。6.2.3.1.5组织冰冻切片，丙酮固定5min~10min组织涂片空气中干燥30min，丙酮固定。将固定好的片子密闭、保存于一70℃备用。6.2.3.2染色
6.2.3.2.1直接免疫荧光抗体法
每个样品同时做两张片子，分别用封闭液1和封闭液2进行封闭，37℃湿盒孵育30min，滴加FITC标记一抗，按6.2.3.1.2~6.2.3.1.4进行孵育、洗涤、干燥和观察。6.2.3.2.2间接免疫荧光抗体法
滴加一抗，37℃湿盒孵育25min～45min。PBS润洗一次后，再用新鲜PBS浸泡5min～10min，双蒸水润洗一次，置玻片架上，细胞面向上，滴加FITC标记二抗，按6.2.3.1.2～6.2.3.1.4进行孵育、洗涤、十燥和观察。用相同比例稀释的阴性血清作阴性对照。注：工作浓度未知的一抗，可以作1：10,1：20,1：40,1：80,1：160梯度稀释，作用于阳性对照进行染色6.2.4结果判定
阳性对照出现特异性荧光，正常细胞对照无任何特异性荧光，且阴性血清对照无特异性荧光，试验成立；样品呈现特异性荧光，判定为阳性；样品无特异性荧光，判定为阴性。6.3逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）6.3.1设备和器材
生物安全柜、低温冰箱、超低温冰箱、高速冷冻离心机（≥12000g）、PCR仪、凝胶电泳仪、凝胶成像仪（或UV灯）、微量移液器（0.5μL～1000μL）及配套枪头等。6.3.2试剂和材料
6.3.2.1Trizol*试剂。
6.3.2.220mg/μL糖原。
6.3.2.310XPCR缓冲液。
6.3.2.425mmol/L氯化镁。
200units/μLM-MLV逆转录酶。
6.3.2.610units/μL核糖核酸酶抑制剂。6.3.2.7
WN、EEE和WEE阳性对照。
阴性对照。
6.3.2.95units/μLAmpliTaqGoldTMDNAPolymeraseDNA聚合酶。10mmol/LdNTPmix(dATP、dTTP、dCTP和dGTP各2.5mmol/L)。6.3.2.10
乙醇、异丙醇、三氯甲烷、TAE缓冲液、双蒸水（无RNAse）、琼脂糖、DNA电泳载样缓冲液、1）该聚合酶是AppliedBiosystems公司提供的产品的商品名，是适合的市售产品的实例，给出这一信息是方便本标准的使用者，并不表示对这一产品的认可。如果其他等效产品具有相同功效，则可使用这些等效产品。4
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DNA相对分子质量标准、DNA凝胶染色剂6.3.3
操作步骤
RNA提取
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分别取组织悬液（或血浆、分离培养物）和阴、阳性对照250μL，加人750μLTrizol。振荡混匀，冰上静置5min。加入200μL三氯甲烷，旋涡振荡15s，冰上静置5min。12000g.2℃~8℃，离心15min。取500μL上层液与等体积一20℃预冷异丙醇混合，加1μL糖原，室温静置10min15min后，12000g，2℃～8℃，离心10min沉淀RNA。弃上清液，加人1mL70%乙醇，轻轻混匀，保存于一70℃。临用前，取出保存于乙醇中的样品和对照RNA，7500g，2℃～8℃离心5min。弃上清液，将离心管倒扣在灭菌纱布上，室温干燥5min～10min，加人15uL无RNase水，溶解RNA。6.3.3.2第一轮RT-PCR
按表1配制第一轮RT-PCR反应液。每管加RNA2μL.按照逆转录：45℃45min；预变性：95℃10min；34个循环：95℃30s.58℃45s.72℃1min；补充延伸：72℃5min；4℃保温，进行反应。
双蒸水（无RNAse）
第一轮RT-PCR反应液
10XPCR缓冲液(100mmol/LTris-HCl.pH8.3.500mmol/LKCI)MgCl(25 mmol/L)
dNTPmix(10 mmol/L)
M-MLV逆转录酶（200units/μL）核糖核酸酶抑制剂（10units/μL)AmplitaqGoldTMDNA聚合酶（5units/μL)第一轮RT-PCR引物组合（见B.2)注：表中所列均为1个反应的量。6.3.3.3
第二轮PCR反应
RT-PCR
单位为微升
WNV.EEEV、WEEV
多重RT-PCR
按表2配制第二轮PCR反应液，取第一轮RT-PCR产物1.5μL做模板，按照预变性：95℃10min；34个循环：95℃30s.58℃45s，72℃1min；补充延伸：72℃5min4℃保温，进行反应。表2第二轮PCR反应液
双蒸水（无RNAse）
10XPCR缓冲液(100mmol/LTris-HCl.pH8.3.500mmol/LKCl)MgCl(25mmol/L)
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单位为微升
WNV、EEEV、WEEV
多重PCR
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dNTPmix(10mmol/L)
AmplitagGoldTMDNA聚合酶（5units/μL）第二轮PCR引物组合（见B.2）
注：表中所列均为1个反应的量。6.3.3.4电泳
表2（续）
单位为微升
WNV.EEEV.WEEV
多重PCR
取PCR产物，用2%~3%琼脂糖凝胶，在10V/cm~15V/cm条件下电泳30min~50min。结果判定
阳性对照EEEV扩增出140bp条带，WEEV扩增出335bp条带，WNV扩增出248bp条带，阴性对照无任何可见扩增，试验成立。待检样品若出现同阳性对照大小一致的扩增条带，应将扩增产物回收、测序确定。
7血清学检测
7.1血凝抑制试验
设备和器材
U型血凝板、冷冻离心机、移液器（8孔道和单孔道)及配套枪头。试剂和材料
阳性血清，由指定单位提供。
7. 1. 2. 1
阴性血清，由指定单位提供。
抗原，由指定单位提供。
25%白陶土溶液（用硼酸盐缓冲液pH9.0配制）。7.1.2.42
硼酸盐缓冲液（pH9.0),配制见A.4.1。7.1.2.6DGV缓冲液.配制见A.4.2。红细胞：采集公鹅血，用DGV洗涤3次，最后重悬于DGV溶液中成7%悬液。存放于4℃备7.1.2.7
用。临用前将用硼酸盐缓冲液作1：24稀释。7.1.2.8血清样品：56℃灭活30min，取0.1mL待检血清加0.4mL25%白陶土溶液，混匀，置于37℃作用30min.3000g离心5min，取上清液备用。7.1.3操作方法
7.1.3.1HA试验
将抗原用硼酸盐缓冲液作10倍稀释，4℃放置1h。在血凝板的第1孔～第12孔加入0.05mL硼酸盐缓冲液；吸取0.05mL稀释后的抗原加入第1孔，混匀；从第一孔吸取0.05mL混匀后的抗原加入第2孔，混匀后吸取0.05mL至第3孔，依次倍比稀释至第11孔。从第11孔吸取0.05mL弃之。每6
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孔加人0.05mL工作浓度的公鹅红细胞，室温孵育45min～60min后观察结果。以红细胞发生完全凝集的最高稀释度作为病毒抗原的1个血凝素单位（1HA）。配制8单位抗原用于HI试验。7.1.3.2HI试验
HI试验程序见表3。除第1孔外，血凝板的第2孔～第10孔，每孔加入0.025mL硼酸盐缓冲液。第1孔和第2孔各加人0.025mL血清样品，混匀后从第2孔吸取0.025mL血清加入第3孔，依次倍比稀释至第8孔，混匀后从第8孔吸取0.025mL，弃去。第9孔和第10孔不加血清，第9孔为血凝素对照，第10孔为稀释液对照。除第10孔外，每孔加入8单位抗原0.025mL，4℃，过夜（或22℃~24℃，反应1h）。每孔加入0.05mL工作浓度的鹅红细胞悬液，37℃，30min后判定结果。每次试验设立阳性和阴性血清对照。
表3HI试验程序
稀释倍数
硼酸盐稀释液
8单位抗原
红细胞
7.1.4结果判定
0.025 0.025
J 0.025 J0.025
0.0250.025
4℃.过夜（或22℃~24℃，反应1h）0.05
37℃.30min
单位为毫升
血凝素对照稀释液对照
++++++++++++
阳性血清对照HI滴度误差不超过一个滴度，阴性对照HI滴度小于1/10，试验才为有效；待检血清的HI滴度在1/10～1/20之间为可疑，大于1/40为阳性，小于1/10为阴性。可疑样品重复试验后仍大于1：10的判为阳性。
7.2IgM捕获ELISA
7.2.1设备和器材
低温冰箱、超低温冰箱、37℃温箱、酶标仪（405nm）、单道微量移液器（1μL～20μL和20μL~200uL）、多道微量移液器（20μL～200μL)及配套枪头、96孔微量反应板。7.2.2试剂和材料
7.2.2. 11
ABTS底物溶液。
捕获抗体（羊抗马IgM抗体）。
辣根过氧化物酶标记α病毒属单抗（2A2C-3）。7.2.2.3
正常组织抗原，由指定单位提供。7.2.2.5EEE和WEE病毒抗原，由指定单位提供7.2.2.6
阳性血清（血清OD4元m值不小于0.6），由指定单位提供阴性血清（血清OD105nm值小于0.2），由指定单位提供。TYKANTKAca
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7.2.2.8包被液、磷酸盐缓冲溶液、封闭液和PBST溶液，配制见A.5。7.2.2.9检测样品：血清和（或）脑脊液。7.2.3试验步骤
7.2.3.1样品准备：用PBST溶液将阴阳性血清和被检血清1400倍稀释；脑脊液做1：2倍稀释。7.2.3.2包被：用包被液稀释捕获抗体至工作浓度，每孔100uL加至96孔微量反应板，密封后置湿盒中4℃静置14h。包被好的微量反应板4℃可保存45d。注：每批捕获抗体应通过试验滴定以确定其最佳包被浓度。7.2.3.3封闭：取7.2.3.2包被好的微量反应板，弃去孔内液体，每孔加人300μLPBST溶液进行洗涤，重复3次。每孔加人300μL封闭液，室温封闭60min～90min，弃去孔内液体，同前洗涤3次。7.2.3.4参照表4,进行试验布局。表4ELISA试验布局
Blank。
Blanke
注：Blank为空白对照，PC为阳性血清对照，NC为阴性血清对照,S为检测样品；a为正常组织抗原组，b为病毒抗原组。一块96孔微量反应板可检测21个未知样品7.2.3.5加入稀释后的待检样品、阳性血清、阴性血清，空白对照孔用PBST代替，每孔50uL，37℃、孵育90min～105min。
7.2.3.6同前洗板3次。加人用PBST稀释的病毒抗原和正常组织抗原，A1和A2孔加人50μLPBST，作无抗原对照。混匀，置湿盒中4℃孵育14h～28h7.2.3.7同前洗板3次。每孔加人50uL,PBST稀释的辣根过氧化物酶标记α病毒属单抗，37℃、湿盒中孵育90min~105min。
7.2.3.8同前洗板3次。每孔加人50uL底物溶液，混勾、封口后在室温避光孵育30min～35min。7.2.3.9用酶标仪测定OD405.mm值7.2.4结果判定
有效性判定
分别计算阳性血清对照病毒抗原孔和阴性血清对照病毒抗原孔的平均OD405m值，用阳性对照的平均ODAn5m值除以阴性对照的平均OD405am计算P/N值。P/N值≥2.0试验成立。7.2.4.2F
阳性临界值的计算
阳性临界值等于两个阴性血清对照病毒抗原孔的平均OD4a5m值再乘以2。7.2.4.3
结果判定
被检样品的OD405m值大于或等于阳性临界值，判定为阳性；被检样品的OD405m值小于阳性临界8
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值，判定为阴性；若同一样品病毒抗原孔产生的OD405mm值大于阳性临界OD405m值，但正常抗原孔的ODt05nm值大于病毒抗原孔的OD105mm，试验为非特异性反应，需重新试验。7.3蚀斑减数中和试验（PRNT）
7.3.1设备和器材
低温冰箱、超低温冰箱、水浴锅、二氧化碳培养箱、倒置式光学显微镜、生物安全柜（ClassIⅡ以上）、微量移液器（50μL～200μL)（及配套枪头）。7.3.2试剂和材料
7.3.2.1试剂
EMEM培养基、1OXEarlesBBS缓冲液，胎牛血清（FBS)（无BVDV、VEE、EEE和WEE抗体，并经辐照处理）、制霉菌素B、庆大霉素、碳酸氢钠溶液、中性红和铺板溶液（溶液I和溶液Ⅱ），配制见A.6。
7.3.2.2材料
Vero细胞、病毒储液（EEE，WEE，VEE）、阳性血清（分别抗VEE，EEE和WEE）、阴性血清、待检样品血清和(或)脑脊液」、玻璃移液管、离心管、细胞培养瓶。7.3.3操作步骤
7.3.3.1病毒抗原的工作浓度确定7.3.3.1.1病毒接种
用EMEM无血清培养基将病毒储液从10-1到10-梯度稀释后，每个梯度取0.2mL液体和0.2mLEMEM（含20%FBS）混合，37℃孵育75min～80min。每个稀释度各接种两瓶Vero细胞，0.1mL/瓶，37℃孵育1h~2h。
7.3.3.1.2铺板计数
将铺板溶液Ⅱ置于56℃水浴30min后转移到47℃水浴，同时将铺板溶液I置于47℃水浴。铺板前15min配制铺板溶液：将溶液I和溶液Ⅱ等体积混合，置于47℃水浴备用。弃去感作病毒液，每瓶加铺板溶液6mL.水平放置15min，待琼脂自然凝固后，37℃倒置培养2d～3d。逐日观察每个稀释度的蚀斑形成情况。取最接近100pfu(蚀斑形成单位）的稀释度，按式（1)折算为100PFU/0.1mL的稀释度（X）。用该稀释度作为病毒储液的工作浓度。(PFU/0.1mL）X（稀释度）=（100PFU/0.1mL)X（X）7.3.3.2细胞准备
+++...(1)
将Vero细胞传于25cm细胞瓶中，待细胞长满备用。若同时检测EEEV、WEEV和VEEV，每次试验至少需18瓶细胞作试验对照：3瓶用作细胞对照，6瓶用作感染工作浓度病毒对照（每种病毒2瓶），3瓶用作感染10-工作浓度病毒对照（每种病毒1瓶），6瓶用作EEE、WEE、VEE阳性血清对照（每种病毒做两瓶：一瓶加1：10稀释血清，一瓶加1：100稀释血清）。每份样品，若同时做VEE、EEE和WEE鉴别.需用6瓶细胞：每种病毒用2瓶，一瓶加1：10稀释血清，一瓶加1：100血清。7.3.3.3血清样品的稀释
7.3.3.3.1无菌吸取0.2mL待检样品和阳性血清加人0.8mLEMEM（含1×抗生素）中做1：5稀SN/T28632011
释后，取0.1mL稀释液加到0.9mL的EMEM（含1X抗生素）中，使得血清稀释度为1：50。样品和对照血清.56℃灭活25min～35min。取1.5mL离心管若干，如下分装：待测样品和阳性血清：每种病毒，各取1：5稀释和1：50稀释的血清0.2mL分别加入不同的离心管中：
一病毒对照：每种病毒，取3支管，每支加人0.2mLEMEM培养基（20%FBS）。2支做工作浓度病毒对照，1支做10-1工作浓度病毒对照；细胞对照：只含0.2mLEMEM培养基（10%FBS）。7.3.3.3.2将配制好的样品和对照置冰盒中，备用。7.3.3.4中和反应
7.3.3.4.1按7.3.3.1.2准备工作浓度病毒液（100PFU/0.1mL)。取0.2mL工作浓度病毒液加至1.8mLEMEM中，制备成10-1工作浓度病毒液（10PFU/0.1mL）。7.3.3.4.2取0.2mL工作浓度病毒液加人到7.3.3.3.1分装的待检血清和阳性血清中，稀释血清至1：10和1：100；取0.2mL稀释好的工作浓度病毒液和10-1工作浓度病毒液加人到7.3.3.3.1的病毒对照中；细胞对照不添加病毒液。分别混勾，37℃孵育75min～80min后转移到冰盒中备用7.3.3.5接种
弃去细胞培养液，取7.3.3.4.2反应后的混合物0.1mL加至7.3.3.2准备的细胞单层，使混合液均匀布满整个细胞表面。细胞对照加0.1mLEMEM(10%FBS）。37℃孵育1h~～2h，每隔20min摇动一次细胞瓶。免费标准下载网bzxz
7.3.3.6铺板
按照7.3.3.1.2的方法进行铺板。待琼脂自然凝固，37℃、5%二氧化碳倒置培养2d～3d，观察结果。
7.3.4结果判定
7.3.4.110-1工作浓度病毒对照相对于工作浓度病毒对照蚀斑减少90%土5%；阳性血清对照在1：10和1：100两个稀释度均无蚀斑出现，或蚀斑数在10个以内；细胞对照组无任何病毒蚀斑，细胞生长良好，则试验成立。
7.3.4.2若样品出现较多蚀斑.数量相当于工作浓度病毒对照蚀斑数的20%（及以上）.判定为阴性；若样品蚀斑数相当于工作浓度病毒对照蚀斑数的10%～20%，判定为可疑；若无可见病毒蚀斑，或蚀斑数量相当于工作浓度病毒对照蚀斑数的10%（及以内），判定为阳性8结果报告
8.1病原分离鉴定
在病毒分离中任一试验为阳性，且RT-PCR和（或）免疫荧光试验为阳性，就可判定为马脑脊髓炎（东部型或西部型）病原分离鉴定阳性。否则，报告为马脑脊髓炎（东部型或西部型）病原分离鉴定阴性。8.2血清学检测
在血凝抑制试验和病毒蚀斑减数中和试验中，任一试验结果为阳性，判定为马脑脊髓炎（东部型或西部型)抗体阳性。否则，报告为马脑脊髓炎（东部型或西部型)抗体阴性。若同一动物的血清和脑脊液的IgM捕获ELISA的结果均为阳性，报告为马脑脊髓炎（东部型或西部型）阳性，否则，需进一步试验10
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马脑脊髓炎（东部型和西部型）检疫技术规范
Quarantineprotocolforequineencephalitis(easternandwestern)2011-05-31发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2011-12-01实施
本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。SN/T2863—2011
本标准修改采用了世界动物卫生组织（OIE）的《陆生动物手册（2009版）第2.5.5章“马脑脊髓炎（东部型和西部型)”。除编辑性修改外，主要技术变化如下：细化了免疫荧光试验方法；
细化了逆转录聚合酶链式反应检测方法；一增加了血凝试验内容；
一修改了IgM捕获ELISA的底物作用时间为30min~35min；删除了补体结合试验
本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国重庆出入境检验检疫局、重庆市进出口食品安全工程技术研究中心、中华人民共和国山东出入境检验检疫局。本标准主要起草人：王昱、李应国、肖进文、梁成珠、聂福平、刘生峰、王国民、李贤良、周启明1
TYKAONTKACa
1范围
马脑脊髓炎（东部型和西部型）检疫技术规范
SN/T2863—2011
本标准规定了东部型马脑脊髓炎和西部型马脑脊髓炎的病毒分离、免疫荧光试验、RT-PCR试验、血凝抑制试验、IgM捕获ELISA和蚀斑减数中和试验的技术要求，本标准适用于进出境动物的东部型马脑脊髓炎和西部型马脑脊髓炎的检疫规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注明日期的引用文件，其最新版本（包括所用的修改单）适用于本文件GB/T18088出入境动物检疫采样
3缩略语
下列缩略语适用于本文件。
3.1EEE(easternequineencephalitis）：东部型马脑脊髓炎3.2WEE（westernequineencephalitis）：西部型马脑脊髓炎3.3VEE（venezuelanequineencephalitis）：委内瑞拉马脑脊髓炎3.4WN（westnilefever）：西尼罗河热3.5RK-13细胞系（rabbitkidney-13cellline）：兔肾细胞系3.6Vero细胞系（africangreenmonkeykidneycellline）：非洲绿猴肾细胞系3.7RT-PCR（reversetranscription-polymerasechainreaction）：逆转录聚合酶链式反应4
生物安全要求
本标准的病毒分离、免疫荧光试验和蚀斑减数中和试验，均需在生物安全Ⅲ级以上的实验室进行。实验人员需提前进行EEE疫苗免疫，蚀斑减数中和抗体滴度在1：40以上。5样品采集
5.1试剂和材料
采血针、离心管、样品瓶、手术镊子、开颅钳、断骨刀、手术剪刀、样品缓冲液（配制见A，1.3）。5.2采样数量和类型
采样的数量按照GB/T18088的要求执行。样品类型包括：血清、脑脊液、组织L脑和（或）脊髓]。1
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SN/T2863—2011
5.3采集方法
5.3.1血清样品
采集全血10mL～15mL，提取血清3mL以上，立即低温运送到实验室。5.3.2脑脊液样品
无菌采集脑脊液1mL以上，立即低温运送到实验室5.3.3组织样品
无菌采取动物脑、脊髓，存放于无菌样品瓶，低温48h内运送到实验室。如果48h内无法运送到实验室，则需干冰冷冻运送。
病原分离鉴定
6.1病毒分离
6.1.1设备和器材
低温冰箱、超低温冰箱、二氧化碳培养箱、冷冻离心机（≥3000g）、生物安全柜（ClassⅡ以上）、倒置光学显微镜、细胞瓶、注射器、移液器（1.0mL~10mL）及配套枪头。6.1.2试剂和材料
6.1.2.1RK-13和(或)Vero细胞
6.1.2.2MEM培养基。
6.1.2.33日龄～5日龄乳鼠。
6日龄～8日龄SPF鸡胚。
5胎牛血清（无BVDV抗体及其他牛病抗体）。6.1.2.6
样品缓冲液，配制见A.1.3。
细胞生长液和维持液.配制见A.2.1。6.1.2.8
ATV缓冲液，配制见A.2.2。
6.1.3操作方法
样品制备
组织样品低温均质后，加人样品缓冲液制成10%悬液，1500g，4℃离心20min。取上清液过滤除菌，置冰盒备用。血清、脑脊液直接使用。6.1.3.2细胞分离试验
用适量ATV缓冲液，将培养的RK-13细胞和（或）Vero细胞传代。待细胞长至80%～100%，每瓶细胞按10%体积加入样品悬液.37℃感作1h～2h后加人细胞维持液，37℃培养6d～8d，逐日观察细胞病变。每份样品接种RK-13和（或）Vero细胞各2瓶.同时设定正常培养细胞对照。若第一代培养中无细胞病变.则将细胞反复冻融3次，合并两瓶细胞培养物上清液，取适量上清液感染新的单层细胞；将出现70%90%细胞病变的细胞培养物反复冻融后，取上清液进行RT-PCR和(或)免疫荧光试验鉴定2
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6.1.3.3鸡胚分离
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每份样品接种2枚～4枚6日龄～8日龄SPF鸡胚卵黄囊，0.5mL/枚，孵化7d。弃24h内死亡鸡胚，收集24h后死亡鸡胚，用RT-PCR和（或）免疫荧光试验鉴定。若第一代鸡胚无死亡，再盲传一代6.1.4结果判定
6.1.4.1细胞分离试验
细胞对照无任何细胞病变，细胞生长良好，试验成立。若被检样品连传两代均无细胞病变，判定为阴性；若出现圆缩、脱落等细胞病变，进一步进行RT-PCR和（或）免疫荧光试验。6.1.4.2鸡胚分离试验
若连传两代，均无鸡胚死亡，判定为阴性；若出现鸡胚死亡，进一步进行RT-PCR和（或）免疫荧光试验6.2免疫荧光试验
6.2.1设备和器材
二氧化碳培养箱、生物安全（ClassⅡ以上）、倒置荧光显微镜、低温冰箱、超低温冰箱、Leighton试管和移液器等。
6.2.2试剂和材料
6.2.2.1丙酮。
6.2.2.2Vero细胞。
6.2.2.3MEM培养基。
6.2.2.40.5%伊文思蓝染色液
EEEV和WEEV病毒储液。
阴性血清（和一抗来源相同）。一抗[EEEV抗体和（或）WEEV抗体]。FITC标记二抗（FITC标记物种特异性抗体）。FITC标记一抗[EEEV抗体和（或）WEEV抗体]。6.2.2.10
细胞生长液和维持液，配制见A.2.16.2.2.11
ATV缓冲液，配制见A.2.2。
PBS溶液，配制见A.3.1。
封闭溶液（含封闭液1和封闭液2），配制见A.3.2。封固溶液，配制见A.3.3。
6.2.3操作方法
准备试验
6.2.3.1.1加入ATV缓冲液，将Vero细胞传代到Leighton试管，37℃，5%二氧化碳培养1d～2d。待细胞长至80%～100%，取0.1mL待鉴定的分离培养物感染Vero细胞，每个样品接种6支～7支Leighton试管，同时设立1支2支正常培养细胞对照。用MEM培养基将EEEV和WEEV病毒储液稀释到100TCIDso～1000TCIDs后感染Vero细胞，作阳性对照。加入适量细胞维持液，37℃5%二氧化碳培养，
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6.2.3.1.2逐日取出一块玻片，PBS溶液润洗一次，一70℃预冷丙酮固定5min~10min。6.2.3.1.3滴加FITC标记一抗.37℃湿盒孵育25min45min后，PBS溶液润洗一次。6.2.3.1.4用新鲜PBS溶液浸泡5min~10min，双蒸水润洗1次，空气中干燥，滴加一滴封固溶液，加盖片，用荧光显微镜（490nmol/L）进行观察。确定出最佳感染效果后，将余下的玻片固定备用。6.2.3.1.5组织冰冻切片，丙酮固定5min~10min组织涂片空气中干燥30min，丙酮固定。将固定好的片子密闭、保存于一70℃备用。6.2.3.2染色
6.2.3.2.1直接免疫荧光抗体法
每个样品同时做两张片子，分别用封闭液1和封闭液2进行封闭，37℃湿盒孵育30min，滴加FITC标记一抗，按6.2.3.1.2~6.2.3.1.4进行孵育、洗涤、干燥和观察。6.2.3.2.2间接免疫荧光抗体法
滴加一抗，37℃湿盒孵育25min～45min。PBS润洗一次后，再用新鲜PBS浸泡5min～10min，双蒸水润洗一次，置玻片架上，细胞面向上，滴加FITC标记二抗，按6.2.3.1.2～6.2.3.1.4进行孵育、洗涤、十燥和观察。用相同比例稀释的阴性血清作阴性对照。注：工作浓度未知的一抗，可以作1：10,1：20,1：40,1：80,1：160梯度稀释，作用于阳性对照进行染色6.2.4结果判定
阳性对照出现特异性荧光，正常细胞对照无任何特异性荧光，且阴性血清对照无特异性荧光，试验成立；样品呈现特异性荧光，判定为阳性；样品无特异性荧光，判定为阴性。6.3逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）6.3.1设备和器材
生物安全柜、低温冰箱、超低温冰箱、高速冷冻离心机（≥12000g）、PCR仪、凝胶电泳仪、凝胶成像仪（或UV灯）、微量移液器（0.5μL～1000μL）及配套枪头等。6.3.2试剂和材料
6.3.2.1Trizol*试剂。
6.3.2.220mg/μL糖原。
6.3.2.310XPCR缓冲液。
6.3.2.425mmol/L氯化镁。
200units/μLM-MLV逆转录酶。
6.3.2.610units/μL核糖核酸酶抑制剂。6.3.2.7
WN、EEE和WEE阳性对照。
阴性对照。
6.3.2.95units/μLAmpliTaqGoldTMDNAPolymeraseDNA聚合酶。10mmol/LdNTPmix(dATP、dTTP、dCTP和dGTP各2.5mmol/L)。6.3.2.10
乙醇、异丙醇、三氯甲烷、TAE缓冲液、双蒸水（无RNAse）、琼脂糖、DNA电泳载样缓冲液、1）该聚合酶是AppliedBiosystems公司提供的产品的商品名，是适合的市售产品的实例，给出这一信息是方便本标准的使用者，并不表示对这一产品的认可。如果其他等效产品具有相同功效，则可使用这些等效产品。4
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DNA相对分子质量标准、DNA凝胶染色剂6.3.3
操作步骤
RNA提取
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分别取组织悬液（或血浆、分离培养物）和阴、阳性对照250μL，加人750μLTrizol。振荡混匀，冰上静置5min。加入200μL三氯甲烷，旋涡振荡15s，冰上静置5min。12000g.2℃~8℃，离心15min。取500μL上层液与等体积一20℃预冷异丙醇混合，加1μL糖原，室温静置10min15min后，12000g，2℃～8℃，离心10min沉淀RNA。弃上清液，加人1mL70%乙醇，轻轻混匀，保存于一70℃。临用前，取出保存于乙醇中的样品和对照RNA，7500g，2℃～8℃离心5min。弃上清液，将离心管倒扣在灭菌纱布上，室温干燥5min～10min，加人15uL无RNase水，溶解RNA。6.3.3.2第一轮RT-PCR
按表1配制第一轮RT-PCR反应液。每管加RNA2μL.按照逆转录：45℃45min；预变性：95℃10min；34个循环：95℃30s.58℃45s.72℃1min；补充延伸：72℃5min；4℃保温，进行反应。
双蒸水（无RNAse）
第一轮RT-PCR反应液
10XPCR缓冲液(100mmol/LTris-HCl.pH8.3.500mmol/LKCI)MgCl(25 mmol/L)
dNTPmix(10 mmol/L)
M-MLV逆转录酶（200units/μL）核糖核酸酶抑制剂（10units/μL)AmplitaqGoldTMDNA聚合酶（5units/μL)第一轮RT-PCR引物组合（见B.2)注：表中所列均为1个反应的量。6.3.3.3
第二轮PCR反应
RT-PCR
单位为微升
WNV.EEEV、WEEV
多重RT-PCR
按表2配制第二轮PCR反应液，取第一轮RT-PCR产物1.5μL做模板，按照预变性：95℃10min；34个循环：95℃30s.58℃45s，72℃1min；补充延伸：72℃5min4℃保温，进行反应。表2第二轮PCR反应液
双蒸水（无RNAse）
10XPCR缓冲液(100mmol/LTris-HCl.pH8.3.500mmol/LKCl)MgCl(25mmol/L)
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单位为微升
WNV、EEEV、WEEV
多重PCR
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dNTPmix(10mmol/L)
AmplitagGoldTMDNA聚合酶（5units/μL）第二轮PCR引物组合（见B.2）
注：表中所列均为1个反应的量。6.3.3.4电泳
表2（续）
单位为微升
WNV.EEEV.WEEV
多重PCR
取PCR产物，用2%~3%琼脂糖凝胶，在10V/cm~15V/cm条件下电泳30min~50min。结果判定
阳性对照EEEV扩增出140bp条带，WEEV扩增出335bp条带，WNV扩增出248bp条带，阴性对照无任何可见扩增，试验成立。待检样品若出现同阳性对照大小一致的扩增条带，应将扩增产物回收、测序确定。
7血清学检测
7.1血凝抑制试验
设备和器材
U型血凝板、冷冻离心机、移液器（8孔道和单孔道)及配套枪头。试剂和材料
阳性血清，由指定单位提供。
7. 1. 2. 1
阴性血清，由指定单位提供。
抗原，由指定单位提供。
25%白陶土溶液（用硼酸盐缓冲液pH9.0配制）。7.1.2.42
硼酸盐缓冲液（pH9.0),配制见A.4.1。7.1.2.6DGV缓冲液.配制见A.4.2。红细胞：采集公鹅血，用DGV洗涤3次，最后重悬于DGV溶液中成7%悬液。存放于4℃备7.1.2.7
用。临用前将用硼酸盐缓冲液作1：24稀释。7.1.2.8血清样品：56℃灭活30min，取0.1mL待检血清加0.4mL25%白陶土溶液，混匀，置于37℃作用30min.3000g离心5min，取上清液备用。7.1.3操作方法
7.1.3.1HA试验
将抗原用硼酸盐缓冲液作10倍稀释，4℃放置1h。在血凝板的第1孔～第12孔加入0.05mL硼酸盐缓冲液；吸取0.05mL稀释后的抗原加入第1孔，混匀；从第一孔吸取0.05mL混匀后的抗原加入第2孔，混匀后吸取0.05mL至第3孔，依次倍比稀释至第11孔。从第11孔吸取0.05mL弃之。每6
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孔加人0.05mL工作浓度的公鹅红细胞，室温孵育45min～60min后观察结果。以红细胞发生完全凝集的最高稀释度作为病毒抗原的1个血凝素单位（1HA）。配制8单位抗原用于HI试验。7.1.3.2HI试验
HI试验程序见表3。除第1孔外，血凝板的第2孔～第10孔，每孔加入0.025mL硼酸盐缓冲液。第1孔和第2孔各加人0.025mL血清样品，混匀后从第2孔吸取0.025mL血清加入第3孔，依次倍比稀释至第8孔，混匀后从第8孔吸取0.025mL，弃去。第9孔和第10孔不加血清，第9孔为血凝素对照，第10孔为稀释液对照。除第10孔外，每孔加入8单位抗原0.025mL，4℃，过夜（或22℃~24℃，反应1h）。每孔加入0.05mL工作浓度的鹅红细胞悬液，37℃，30min后判定结果。每次试验设立阳性和阴性血清对照。
表3HI试验程序
稀释倍数
硼酸盐稀释液
8单位抗原
红细胞
7.1.4结果判定
0.025 0.025
J 0.025 J0.025
0.0250.025
4℃.过夜（或22℃~24℃，反应1h）0.05
37℃.30min
单位为毫升
血凝素对照稀释液对照
++++++++++++
阳性血清对照HI滴度误差不超过一个滴度，阴性对照HI滴度小于1/10，试验才为有效；待检血清的HI滴度在1/10～1/20之间为可疑，大于1/40为阳性，小于1/10为阴性。可疑样品重复试验后仍大于1：10的判为阳性。
7.2IgM捕获ELISA
7.2.1设备和器材
低温冰箱、超低温冰箱、37℃温箱、酶标仪（405nm）、单道微量移液器（1μL～20μL和20μL~200uL）、多道微量移液器（20μL～200μL)及配套枪头、96孔微量反应板。7.2.2试剂和材料
7.2.2. 11
ABTS底物溶液。
捕获抗体（羊抗马IgM抗体）。
辣根过氧化物酶标记α病毒属单抗（2A2C-3）。7.2.2.3
正常组织抗原，由指定单位提供。7.2.2.5EEE和WEE病毒抗原，由指定单位提供7.2.2.6
阳性血清（血清OD4元m值不小于0.6），由指定单位提供阴性血清（血清OD105nm值小于0.2），由指定单位提供。TYKANTKAca
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7.2.2.8包被液、磷酸盐缓冲溶液、封闭液和PBST溶液，配制见A.5。7.2.2.9检测样品：血清和（或）脑脊液。7.2.3试验步骤
7.2.3.1样品准备：用PBST溶液将阴阳性血清和被检血清1400倍稀释；脑脊液做1：2倍稀释。7.2.3.2包被：用包被液稀释捕获抗体至工作浓度，每孔100uL加至96孔微量反应板，密封后置湿盒中4℃静置14h。包被好的微量反应板4℃可保存45d。注：每批捕获抗体应通过试验滴定以确定其最佳包被浓度。7.2.3.3封闭：取7.2.3.2包被好的微量反应板，弃去孔内液体，每孔加人300μLPBST溶液进行洗涤，重复3次。每孔加人300μL封闭液，室温封闭60min～90min，弃去孔内液体，同前洗涤3次。7.2.3.4参照表4,进行试验布局。表4ELISA试验布局
Blank。
Blanke
注：Blank为空白对照，PC为阳性血清对照，NC为阴性血清对照,S为检测样品；a为正常组织抗原组，b为病毒抗原组。一块96孔微量反应板可检测21个未知样品7.2.3.5加入稀释后的待检样品、阳性血清、阴性血清，空白对照孔用PBST代替，每孔50uL，37℃、孵育90min～105min。
7.2.3.6同前洗板3次。加人用PBST稀释的病毒抗原和正常组织抗原，A1和A2孔加人50μLPBST，作无抗原对照。混匀，置湿盒中4℃孵育14h～28h7.2.3.7同前洗板3次。每孔加人50uL,PBST稀释的辣根过氧化物酶标记α病毒属单抗，37℃、湿盒中孵育90min~105min。
7.2.3.8同前洗板3次。每孔加人50uL底物溶液，混勾、封口后在室温避光孵育30min～35min。7.2.3.9用酶标仪测定OD405.mm值7.2.4结果判定
有效性判定
分别计算阳性血清对照病毒抗原孔和阴性血清对照病毒抗原孔的平均OD405m值，用阳性对照的平均ODAn5m值除以阴性对照的平均OD405am计算P/N值。P/N值≥2.0试验成立。7.2.4.2F
阳性临界值的计算
阳性临界值等于两个阴性血清对照病毒抗原孔的平均OD4a5m值再乘以2。7.2.4.3
结果判定
被检样品的OD405m值大于或等于阳性临界值，判定为阳性；被检样品的OD405m值小于阳性临界8
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值，判定为阴性；若同一样品病毒抗原孔产生的OD405mm值大于阳性临界OD405m值，但正常抗原孔的ODt05nm值大于病毒抗原孔的OD105mm，试验为非特异性反应，需重新试验。7.3蚀斑减数中和试验（PRNT）
7.3.1设备和器材
低温冰箱、超低温冰箱、水浴锅、二氧化碳培养箱、倒置式光学显微镜、生物安全柜（ClassIⅡ以上）、微量移液器（50μL～200μL)（及配套枪头）。7.3.2试剂和材料
7.3.2.1试剂
EMEM培养基、1OXEarlesBBS缓冲液，胎牛血清（FBS)（无BVDV、VEE、EEE和WEE抗体，并经辐照处理）、制霉菌素B、庆大霉素、碳酸氢钠溶液、中性红和铺板溶液（溶液I和溶液Ⅱ），配制见A.6。
7.3.2.2材料
Vero细胞、病毒储液（EEE，WEE，VEE）、阳性血清（分别抗VEE，EEE和WEE）、阴性血清、待检样品血清和(或)脑脊液」、玻璃移液管、离心管、细胞培养瓶。7.3.3操作步骤
7.3.3.1病毒抗原的工作浓度确定7.3.3.1.1病毒接种
用EMEM无血清培养基将病毒储液从10-1到10-梯度稀释后，每个梯度取0.2mL液体和0.2mLEMEM（含20%FBS）混合，37℃孵育75min～80min。每个稀释度各接种两瓶Vero细胞，0.1mL/瓶，37℃孵育1h~2h。
7.3.3.1.2铺板计数
将铺板溶液Ⅱ置于56℃水浴30min后转移到47℃水浴，同时将铺板溶液I置于47℃水浴。铺板前15min配制铺板溶液：将溶液I和溶液Ⅱ等体积混合，置于47℃水浴备用。弃去感作病毒液，每瓶加铺板溶液6mL.水平放置15min，待琼脂自然凝固后，37℃倒置培养2d～3d。逐日观察每个稀释度的蚀斑形成情况。取最接近100pfu(蚀斑形成单位）的稀释度，按式（1)折算为100PFU/0.1mL的稀释度（X）。用该稀释度作为病毒储液的工作浓度。(PFU/0.1mL）X（稀释度）=（100PFU/0.1mL)X（X）7.3.3.2细胞准备
+++...(1)
将Vero细胞传于25cm细胞瓶中，待细胞长满备用。若同时检测EEEV、WEEV和VEEV，每次试验至少需18瓶细胞作试验对照：3瓶用作细胞对照，6瓶用作感染工作浓度病毒对照（每种病毒2瓶），3瓶用作感染10-工作浓度病毒对照（每种病毒1瓶），6瓶用作EEE、WEE、VEE阳性血清对照（每种病毒做两瓶：一瓶加1：10稀释血清，一瓶加1：100稀释血清）。每份样品，若同时做VEE、EEE和WEE鉴别.需用6瓶细胞：每种病毒用2瓶，一瓶加1：10稀释血清，一瓶加1：100血清。7.3.3.3血清样品的稀释
7.3.3.3.1无菌吸取0.2mL待检样品和阳性血清加人0.8mLEMEM（含1×抗生素）中做1：5稀SN/T28632011
释后，取0.1mL稀释液加到0.9mL的EMEM（含1X抗生素）中，使得血清稀释度为1：50。样品和对照血清.56℃灭活25min～35min。取1.5mL离心管若干，如下分装：待测样品和阳性血清：每种病毒，各取1：5稀释和1：50稀释的血清0.2mL分别加入不同的离心管中：
一病毒对照：每种病毒，取3支管，每支加人0.2mLEMEM培养基（20%FBS）。2支做工作浓度病毒对照，1支做10-1工作浓度病毒对照；细胞对照：只含0.2mLEMEM培养基（10%FBS）。7.3.3.3.2将配制好的样品和对照置冰盒中，备用。7.3.3.4中和反应
7.3.3.4.1按7.3.3.1.2准备工作浓度病毒液（100PFU/0.1mL)。取0.2mL工作浓度病毒液加至1.8mLEMEM中，制备成10-1工作浓度病毒液（10PFU/0.1mL）。7.3.3.4.2取0.2mL工作浓度病毒液加人到7.3.3.3.1分装的待检血清和阳性血清中，稀释血清至1：10和1：100；取0.2mL稀释好的工作浓度病毒液和10-1工作浓度病毒液加人到7.3.3.3.1的病毒对照中；细胞对照不添加病毒液。分别混勾，37℃孵育75min～80min后转移到冰盒中备用7.3.3.5接种
弃去细胞培养液，取7.3.3.4.2反应后的混合物0.1mL加至7.3.3.2准备的细胞单层，使混合液均匀布满整个细胞表面。细胞对照加0.1mLEMEM(10%FBS）。37℃孵育1h~～2h，每隔20min摇动一次细胞瓶。免费标准下载网bzxz
7.3.3.6铺板
按照7.3.3.1.2的方法进行铺板。待琼脂自然凝固，37℃、5%二氧化碳倒置培养2d～3d，观察结果。
7.3.4结果判定
7.3.4.110-1工作浓度病毒对照相对于工作浓度病毒对照蚀斑减少90%土5%；阳性血清对照在1：10和1：100两个稀释度均无蚀斑出现，或蚀斑数在10个以内；细胞对照组无任何病毒蚀斑，细胞生长良好，则试验成立。
7.3.4.2若样品出现较多蚀斑.数量相当于工作浓度病毒对照蚀斑数的20%（及以上）.判定为阴性；若样品蚀斑数相当于工作浓度病毒对照蚀斑数的10%～20%，判定为可疑；若无可见病毒蚀斑，或蚀斑数量相当于工作浓度病毒对照蚀斑数的10%（及以内），判定为阳性8结果报告
8.1病原分离鉴定
在病毒分离中任一试验为阳性，且RT-PCR和（或）免疫荧光试验为阳性，就可判定为马脑脊髓炎（东部型或西部型）病原分离鉴定阳性。否则，报告为马脑脊髓炎（东部型或西部型）病原分离鉴定阴性。8.2血清学检测
在血凝抑制试验和病毒蚀斑减数中和试验中，任一试验结果为阳性，判定为马脑脊髓炎（东部型或西部型)抗体阳性。否则，报告为马脑脊髓炎（东部型或西部型)抗体阴性。若同一动物的血清和脑脊液的IgM捕获ELISA的结果均为阳性，报告为马脑脊髓炎（东部型或西部型）阳性，否则，需进一步试验10
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