SN/T 2865-2011
基本信息
标准号： SN/T 2865-2011
中文名称：尼帕病毒病检疫技术规范
标准类别：商检行业标准(SN)
标准状态：现行
出版语种：简体中文
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标准简介
SN/T 2865-2011 尼帕病毒病检疫技术规范
SN/T2865-2011
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标准内容
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T2865—2011
尼帕病毒病检疫技术规范
Protocol of quarantine for Nipah virus disease2011-05-31发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2011-12-01实施
本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。SN/T2865—2011
本标准参考了世界动物卫生组织（OIE）《陆生动物诊断试验与疫苗标准手册》（2004版）2.10.10条“亨得拉和尼帕病毒病”。
本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国山东出入境检验检疫局本标准主要起草人：朱来华、梁成珠、郑小龙、岳志芹、肖西志、邓明俊、谭乐义、辛学谦。1
TKANTKAca
1范围
尼帕病毒病检疫技术规范
SN/T2865—2011
本标准规定了尼帕病毒病的病毒分离鉴定、电镜观察、免疫组织化学试验、微量血清中和试验、酶联免疫吸附试验等检疫方法
本标准适用于进出境动物尼帕病毒病的检疫2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3概述
3.1尼帕病毒（NipahvirusNiV)病是一种新出现的人畜共患传染病。尼帕病毒病的病原是副黏病毒科（Paramyxoviridae）成员，能够感染人、猪等多种动物。在猪群内传播迅速，症状却不明显，在人群中有人传人的可能，并且人感染NiV之后，死亡率高达40%～70%3.2NiV可以感染各个年龄段的猪，不同类别的猪表现出不同的临床症状，例如母猪首先表现为神经症状，而肉用猪表现为呼吸道症状，此外，圈养的母猪和公猪活动受到限制，可能掩盖其呼吸道症状，3.3人、猫、狗和马也可以感染NiV。人感染NiV后，多数以神经症状为主，也可以呼吸道症状为主，死亡率很高：狗感染NiV后，可出现类似犬瘟热症状；猫感染NiV后，死亡率很高；马感染NiV后可以出现神经症状，但是死亡率似乎较低。所以在临床诊断时，应注意感染的猪场及其周围人和其他动物的发病情况，注意发病猪场新近是否引进新猪。因尼帕病毒病是可感染人和多种动物的人畜共患传染病，所以处理带有或可能带有此活病毒的样品必须在BSL-4生物安全实验室内操作。3.4死后剖检发现NiV感染猪没有特征性病变，肺和脑膜是主要的病变器官。大多数病例表现由轻微到严重的肺部病变，包括程度不同的实变、气肿、淤血性溢血以及呼吸道有带血丝的分泌物，切开肺部，可见肺小叶间隔肿胀。脑膜弥漫性充血、水肿，其他的内脏器官没有明显的变化4病毒分离鉴定
4.1试剂、材料与仪器
4.1.1试剂与材料：Vero细胞或RK-13细胞、EMEM或其他培养基、抗生素贮存液、细胞消化液、细胞培养液和细胞维持液、细胞瓶和各种常规试剂等（见附录A）。试验用水应符合GB/T6682要求。4.1.2仪器：生物安全柜或超净工作台、倒置显微镜、高速冷冻离心机、二氧化碳培养箱、高压灭菌锅等。
4.2样品采集与处理
4.2.1样品采集与运送：无菌采集动物脑、肺、肾和脾脏等组织，4℃保存运送到BSL-4级生物安全实TTKANYKACa
SN/T2865—2011
验。也可用干冰保存运送，但病料不能长期存放在一20℃。4.2.2样品处理：无菌处理样品，样品称量，置于无菌密闭容器内，加人少量组织培养液和抗菌素，用无菌研槌研磨，制备成组织悬液。再加组织培养液，使最终为10%组织悬液。以1500r/min离心10min小心收取上清液低温保存备用。4.3病毒分离
4.3.1将上述上清液用维持液作倍比稀释，无菌接种于已长成单层的Vero或RK-13细胞瓶或细胞培养板上，每个滴度接种两瓶或两孔。同时设立细胞对照和阳性对照，单层细胞仅加维持液做细胞对照，用60倍稀释的标准病毒接种做阳性对照4.3.2加盖摇匀使之均匀分布于整个细胞层，置于37℃孵育1h。加人维持液置于37℃继续培养，逐日观察细胞病变（CPE），尼帕病毒（NiV）一般在3d内出现CPE。4.3.3无CPE出现者应盲传两代，即将细胞培养物冻融两次，再接种到单层细胞培养5d～7d。出现CPE者，待70%细胞出现CPE时，收取细胞毒。将感染细胞反复冻融数次，2000r/min离心10min，小心收集上清液，分装后低温保存，待进一步进行病毒鉴定。4.3.4用微量血清中和试验或其他方法对分离的病毒进行鉴定4.4结果判定
检查各种对照试验，细胞对照正常，无CPE；阳性对照出现明显的CPE，说明试验成立。如果试验组出现明显的CPE，表现为细胞圆缩、脱落、裂解，则初步判定为病毒分离阳性；如果分离的细胞培养物能被NiV阳性血清中和或被其他方法鉴定，则分离的病毒为NiV。5电镜观察
5.1试剂、材料与仪器
5.1.1试剂与材料：2.5%戊二醛溶液、0.1mol/L磷酸缓冲液、乙酸异戊酯、乙醇、双蒸水、显影液、定影液、NiV、Vero细胞等。
5.1.2仪器：扫描电镜、临界点干燥仪、离子溅射镀膜仪、底片扫描仪。5.2操作方法
5.2.1用小盖玻片培养接毒的贴壁细胞。5.2.2用0.1mol/L,磷酸缓冲液（pH7.2)洗两次。5.2.3固定：用2.5%戊二醛溶液室温于通风橱固定1h。固定完后用0.1mol/L磷酸缓冲液和蒸馏水充分洗净。
5.2.4脱水：洗净后用35%、50%、70%、80%、90%、95%、100%乙醇逐渐上升脱水。每级各5min。5.2.5置换：用乙醇：乙酸异戊酯（1：1）混合液及100%乙酸异戊酯依次置换5min，最后将样品浸于乙酸异戊酯15min。
5.2.6临界点干燥：在于燥前先通过放人液体二氧化碳使得仪器压力罐温度降到低于室温10C，接看将样品放入小篮中置于罐内。打开进口阀，放入液体二氧化碳，至充满罐的50%～80%体积。再升温至20℃，使得二氧化碳置换乙酸异戊酯20min，再升温至40℃，此时压力应该大于80kg/cm。保持5min后，缓慢将二氧化碳气体放出，时间大概2h左右。待压力降到0时，再调节温度至室温，取出样品，暂存干燥器中备用。
5.2.7喷镀：将已干燥好的样品用导电胶粘于金属的样台上，再一起置于真空喷镀仪真空罩中，进行喷镀金铂合金镀层，完成后电镜下观察。2
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5.2.8电镜观察。
5.3结果判定
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如果电镜观察显示：病灶原生质膜增厚呈头发样，多核细胞突出，核正常。细胞外病毒粒子呈多形性（球形或细长形），大小为50nm～500nm不等，病毒粒子被有许多表面突起的膜包裹，核衣壳呈各异的螺旋状和人字形，并被囊膜所包被，则可初步判定为NiV阳性。免疫组织化学试验
6.1原理
免疫组化法用于检测福尔马林固定的组织或细胞，该方法还可以检测存放已久的病料，用于调查以往该病发生的情况。在发病动物的很多组织中都可以检测到该病毒，病料采集范围包括：不同的脑组织、脾脏、肾脏和纵隔淋巴结等。孕畜还应包括子宫、胎盘和胎儿的器官等。6.2试剂、材料与仪器
6.2.1试剂与材料：固定液、石蜡、玻片、二甲苯、无水乙醇、胰蛋白酶、脱脂奶粉、免抗尼帕病毒抗体、酶标二抗、显色液、Scotts溶液、H.O、中性封片剂和各种常规试剂等（见附录B）。6.2.2仪器：切片机和显微镜等。6.3病料处理
6.3.1将采集的病料浸人10倍体积的固定液中固定。7d后更换固定液，再维持一周。6.3.2将选取好的组织块放人新配的固定液中再固定7d，其间更换固定液三次，并在水平摇床上不断摇荡，以提高固定液的渗透力。6.3.3将固定好的组织块放人流水中漂洗24h。6.3.4放入下列不同浓度的酒精中脱水：75%酒精2h-+85%酒精2h--95%酒精I2h→95%酒精Ⅱ2h→100%酒精12h-+100%酒精2h。6.3.5放入香柏油和二甲本中透明：香柏油中12h-→二甲苯I1h-→二甲苯Ⅱ1h。6.3.6浸蜡：软蜡中放置40min；硬蜡中放置2h。6.3.7将浸好蜡的组织块放人包埋框中用硬蜡包埋，4℃冷却过夜6.3.8将石蜡块切成5μm厚的切片，用干净的载玻片贴片。6.4操作方法
6.4.1脱蜡：依次将切片放入二甲苯-二甲苯-二甲苯各1min，无水乙醇-无水乙醇-70%乙醇各5min，然后用流水冲洗。
6.4.2将切片置于蒸馏水中漂洗，然后浸人包含0.1%（质量浓度）胰蛋白酶的0.01mol/L氯化钙中（用0.1mol/L的氢氧化钠调pH值至7.8），37放置20min，用蒸留水冲洗。6.4.3将切片放人湿盒内用PBS漂洗5min。洗完后用吸水纸吸干组织块周围的液体，每张切片上滴加200μL3%的HzOz溶液，室温放置20min，然后倒掉HzOz，放入PBS中漂洗5min。6.4.4洗完后用吸水纸吸干组织块周围的液体，向切片上滴加200L适当稀释的免抗尼帕病毒抗体（用包含0.1%脱脂奶粉的PBS稀释，每份样品和对照均要设立平行试验），将切片封好置于37℃孵育h。
6.4.5将切片放人PBS中漂洗5min，洗完后用吸水纸吸干组织块周围的液体，滴加2滴～3滴酶标二TTKANTKACa
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抗，37℃孵育20min。
6.4.6将切片放人PBS中漂洗5min.洗完后用吸水纸吸干组织块周围的液体，滴加显色液，在显微镜下观察染色程度。阳性对照切片染色充分后（通常2min～5min），用蒸馏水漂洗终止反应6.4.7将切片用PBS漂洗5min，洗完后用吸水纸吸干组织块周围的液体，放人苏木素中复染1min~3min，用蒸馏水冲洗，加入Scotts溶液，流水冲洗。蒸馏水漂洗切片，用中性封片剂封片。6.4.8显微镜观察
6.5结果判定
如果镜检切片显示细胞质可见褐色/红色颗粒状着色点，细胞核皇蓝色，则判定为NiV阳性。7微量血清中和试验
7.1试剂、材料与仪器
7.1.1试剂与材料：细胞培养液、细胞维持液、细胞消化液和抗生素贮存液等，标准阳性血清、阴性血清和被检血清经56℃灭能30min备用，Vero细胞和尼帕病毒株NiV（见附录A）。7.1.2仪器：生物安全柜、二氧化碳培养箱、倒置显微镜、液氮贮存罐、微量细胞培养板等。7.2操作方法
7.2.1中和病毒滴度（TCIDso）测定7.2.1.1中和病毒制备
将保存于液氮中的NiV种毒取出置于4℃C缓慢融化，将融化的种毒用维持液作60借稀释后，取1mL接种于长成单层Vero细胞的细胞瓶中，吸附1h。先用维持液洗涤一次，再加入维持液，放置于37℃恒温箱中培养36h～48h，当50%～75%细胞出现CPE，即可收获病毒培养液，分装成1mL后冻存（一70℃以下）备用。
7.2.1.2病毒滴度测定
在微量细胞培养板（96孔）每孔加25uL细胞培养液，用病毒稀释液将冻存病毒作10-1，10-2....…10-8系列稀释，每一稀释度的病毒接种八孔，每孔25μL。正常细胞对照，四孔至八孔不加病毒，仅加25μL病毒稀释液。每孔100uLVero细胞（2.4×10/100μL），置37℃培养，48h后初判，72h终判。如细胞对照正常，接种病毒的细胞出现CPE（细胞圆缩、脱离、裂解），记录试验数据。根据Karber法计算该批病毒的毒价（半数组织感染量TCIDs）。7.2.2微量血清中和试验
7.2.2.1在96孔细胞培养板上每孔加25L细胞培养液。第一列四孔作被检血清（毒性）对照，每孔加25μL被检血清，用移液器混匀后弃25μL；第二列四孔，每孔加25μL被检血清，混匀后吸出25μL至第三孔，依次倍比稀释到第四孔，即血清稀释为1：2、1：4和1：8，每一稀释度各四孔。7.2.2.2用病毒稀释液将病毒稀释成工作浓度200TCIDs0，第一列四孔加病毒稀释液（无病毒）作被检血清（毒性）对照，第二至四列的各孔加25L稀释的病毒。盖上培养板，轻轻摇匀，放入二氧化碳保湿培养箱（5%二氧化碳）37℃孵育1h。阴、阳性血清对照（方法同上）。7.2.2.3病毒滴度验证试验，将工作浓度的中和病毒再作10-1、10-2、10-\稀释.再加25μL病毒稀释液，每一稀释度各四孔。正常细胞对照，留四孔至八孔，每孔仅加25μL的病毒稀释液，不加血清和病4
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毒。上述每孔加100μLVero细胞，细胞浓度为（2.4×10*/100μL）。放人二氧化碳保湿培养箱（5%二氧化碳）37℃培养，48h用倒置显微镜进行初步判定.72h后最终判定结果。7.3结果判定
7.3.1检查各种对照试验，细胞对照正常，无CPE；阴性血清出现明显的CPE，表现为多个细胞发生融合，形成合胞体，最后细胞脱落、裂解；阳性血清无CPE，细胞不出现病变。病毒滴度验证时滴度与原测定滴度相差应在0.31og1范围内，说明病毒稀释浓度符合微量血清中和试验的工作浓度。被检血清对照孔不出现病变，说明被检血清无毒性反应。7.3.2在各种对照成立的情况下，检查各个被检血清的CPE。如果出现CPE，则判为阴性孔；如果不出现CPE，则判为阳性孔。以完全中和病毒感染性（即不出现CPE)的最大稀释度为该血清的中和抗体效价。
7.3.3如被检血清孔1：4为阴性，判该动物为血清学阴性。如被检血清1：4或更高稀释度的孔为阳性，判该动物为血清学阳性。如被检血清孔1：2为阳性，则该动物判为可疑。出现可疑情况时，应对可疑血清重试一次，最终判定结果以重试为准。如果两次试验均为可疑反应，则该动物视为血清学阳性动物处理。
8酶联免疫吸附试验（ELISA）
8.1试剂、材料与仪器
8.1.1试剂与材料：PBS、病毒抗原、细胞对照抗原、封闭液、洗涤液、底物溶液、终止液、脱脂奶粉、H,O2、阳性血清、弱阳性血清和阴性血清等（见附录C,参见附录D)。8.1.2仪器：酶标仪、96孔酶标板、振荡培养箱等。8.2操作方法
8.2.1将病毒抗原和细胞对照抗原用PBS1：1000稀释，将稀释后的抗原加入96孔板中，1、3、5、7、9和11孔滴加病毒抗原，2、4、6、8、10和12孔滴加细胞对照抗原。置于37℃振荡培养1h或4℃过夜，每孔50L
8.2.2倒掉孔内液体，在吸水纸上吸干，每孔加满洗涤液（PBS-T），静置1min～2min后倒掉，吸干，重复洗三次。
8.2.3加入封闭液，每孔100uL，置37℃振荡孵育30min。8.2.4用PBS-T洗板三次（同上）。8.2.5按照8.2.3每孔加人100uL准备好的待检血清，各缓冲液对照孔加人100μLPBS（含5%鸡血清和5%脱脂奶粉），置37℃静止1h。8.2.6用PBS-T洗板三次（同上）。8.2.7用含1%脱脂奶粉的PBS-T稀释酶标抗体，混匀后除底物对照孔外每孔加人100μL.底物对照孔加人100μL含1%脱脂奶粉的PBS-T。置37℃静止1h。8.2.8用PBS-T洗板三次（同上）。8.2.9每孔加入100uL底物溶液，置室温（18℃～22℃）静止10min。8.2.10每孔加人100μL的1mol/L硫酸终止反应8.2.11将板置于酶标仪上，在450nm波长条件下读取光吸收值。8.2.12每次试验设立强阳性、弱阳性、阴性血清、各缓冲液对照孔和未感染病毒的细胞抗原对照孔。5
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结果判定
OD比值计算见式（1）：
OD比值=
待检血清NiV抗原孔OD值
待检血清细胞对照抗原孔OD值
当OD比值大于2.0,NiV抗原OD值大于0.20时为阳性。当OD比值大于2.0,NiV抗原OD值小于0.20时为阴性。当OD比值在2.0～2.2之间为可疑ELISA可疑或阳性血清用中和试验进行验证。9综合判定
9.1病毒分离、电镜观察结果均为病原初步诊断·需要进一步应用免疫组织化学试验或血清中和试验进行确证。
9.2ELISA结果为血清学初步诊断，需要应用血清中和试验进行确证6
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A.1抗生素贮存液
（规范性附录）
病毒分离培养基和试剂的配制
SN/T2865—2011
用灭菌三蒸水配成每毫升含10000IU青霉素和10mg链霉素的抗生素贮存液，用微孔滤膜（0.22μm）过滤除菌，分装成2mL/瓶，一20℃冻存备用。保存期不超过60d。A.2细胞消化液（0.02%EDTA）
EDTA（乙二胺四乙酸二钠）
氯化钠
氯化钾
磷酸氢二钠
磷酸二氢钾
加三蒸水至1000mL，充分溶解，分装成小瓶，115℃高压灭菌10min，4℃冷藏备用。保存期不超过90d。
A.3细胞培养液和细胞维持液
细胞培养液：含10%灭能的无菌胎牛血清（FBS)的EMEM培养基。细胞维持液：含2%灭能的无菌胎牛血清（FBS)的EMEM培养基细胞培养液和细胞维持液均用微孔滤膜（0.22um）过滤除菌，分装成小瓶，4℃保存备用。保存期不超过60d。使用时加1%抗生素贮存液（终浓度为每毫升EMEM培养基含100IU和100μg），并用7.5%碳酸氢钠溶液调pH值至7.0~7.27
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B.1固定液
附录B
（规范性附录）
免疫组织化学试验试剂配制
10%福尔马林生理盐水固定液的配制：氯化钠8.5g，蒸馏水900mL，40%福尔马林100mL.混匀即可。
2显色液
将2mg3-氨基-9-乙基咔唑溶于200μL二甲基甲酰胺中，加入10mL0.02mol/L醋酸缓冲液，调pH值为5.0，再加入5μLH.O（30%，质量浓度）混匀，现用现配。BScott's溶液
碳酸氢钠（NaHCO，）
硫酸镁（MgSO,·7H20)
加双蒸水至1000mL，充分溶解.分装成小瓶115℃高压灭菌10min，4℃冷藏备用8
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C.1磷酸盐缓冲液（PBS）
磷酸氢二钠
磷酸二氢钾
氯化钠
氯化钾
附录C
（规范性附录）
ELISA试验试剂的配制
先加适量的双蒸水，完全溶解后加双蒸水定容至1000mL，pH为7.4。2磷酸盐缓冲液-吐温（PBS-T）洗涤液C2
PBS1000mL，吐温-20(Tween-20)0.5mL，混匀。3封闭液
PBS1000mL，加5mL鸡血清和5g脱脂奶粉，溶解混匀C.4底物溶液
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C.4.1称取柠檬酸（C,H.O，·H.O)10.5g，先加适量的双蒸水，完全溶解后加人双蒸水定容至1000mL，配成0.05mol/L柠檬酸溶液。
C.4.2称取1mg3，35,5-四甲基联苯胺（TMB）溶于10mL柠檬酸磷酸盐缓冲液（0.05mol/LpH5.0），用前再加入2μL30%（体积分数）H，O.即成底物溶液。9
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D.1病毒抗原制备
附录D
（资料性附录）
ELISA抗原制备与样品前处理
D.1.1在滚瓶中培养Vero细胞直至单层，每瓶保留5mL培养液，其余倒掉。在BSL-4实验室条件下将NiV病毒接种到Vero细胞。
D.1.233℃旋转滚瓶30min以吸附病毒，然后每瓶加60mL细胞培养液，33℃继续旋转48h。D.1.3用预冷的0.01mol/LPBS洗涤病毒感染的细胞一次，每瓶刮取细胞，收集到5mL～10mL预冷的PBS中。
D.1.4将收集的细胞转移至50mL离心管中，4℃300g离心5min，倒掉PBS.用预冷的TNM重悬细胞，每瓶大约0.5mLTNM。
D.1.5加NP40裂解液至1%，用移液器吹打5次～10次以裂解细胞D.1.64℃600g离心10min
D.1.7轻轻地将上清液移人一个新管中，添加乙二胺四乙酸至1.5mol/L。补加TNE至10mL.进行分装，一80℃冷冻并用6千赫-射线照射，并存于一80℃备用。D.2细胞对照抗原制备
在滚瓶中培养Vero细胞直至单层，用预冷的PBS洗涤单层细胞，刮取细胞，每瓶收集到5mL～10mL预冷的PBS中。后面的步骤同上D.1.4～D.1.7。D.3样品前处理
D.3.1在Ⅱ级生物安全柜内.用含0.5%（体积分数）TritonX-100和0.5%（体积分数）吐温-20的PBS在96孔板上1：5稀释待检血清，将板封好放入56℃水浴30min灭活D.3.2将22.5μL灭活血清与等量用PBS1：100稀释的细胞对照抗原混合，置于18℃～22℃孵育30min。
D.3.3每孔加405μL封闭液，使血清最终稀释度为1：100.置于18℃～22℃孵育30min，备用。10
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本标准参考了世界动物卫生组织（OIE）《陆生动物诊断试验与疫苗标准手册》（2004版）2.10.10条“亨得拉和尼帕病毒病”。
本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国山东出入境检验检疫局本标准主要起草人：朱来华、梁成珠、郑小龙、岳志芹、肖西志、邓明俊、谭乐义、辛学谦。1
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本标准规定了尼帕病毒病的病毒分离鉴定、电镜观察、免疫组织化学试验、微量血清中和试验、酶联免疫吸附试验等检疫方法
本标准适用于进出境动物尼帕病毒病的检疫2规范性引用文件
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3.1尼帕病毒（NipahvirusNiV)病是一种新出现的人畜共患传染病。尼帕病毒病的病原是副黏病毒科（Paramyxoviridae）成员，能够感染人、猪等多种动物。在猪群内传播迅速，症状却不明显，在人群中有人传人的可能，并且人感染NiV之后，死亡率高达40%～70%3.2NiV可以感染各个年龄段的猪，不同类别的猪表现出不同的临床症状，例如母猪首先表现为神经症状，而肉用猪表现为呼吸道症状，此外，圈养的母猪和公猪活动受到限制，可能掩盖其呼吸道症状，3.3人、猫、狗和马也可以感染NiV。人感染NiV后，多数以神经症状为主，也可以呼吸道症状为主，死亡率很高：狗感染NiV后，可出现类似犬瘟热症状；猫感染NiV后，死亡率很高；马感染NiV后可以出现神经症状，但是死亡率似乎较低。所以在临床诊断时，应注意感染的猪场及其周围人和其他动物的发病情况，注意发病猪场新近是否引进新猪。因尼帕病毒病是可感染人和多种动物的人畜共患传染病，所以处理带有或可能带有此活病毒的样品必须在BSL-4生物安全实验室内操作。3.4死后剖检发现NiV感染猪没有特征性病变，肺和脑膜是主要的病变器官。大多数病例表现由轻微到严重的肺部病变，包括程度不同的实变、气肿、淤血性溢血以及呼吸道有带血丝的分泌物，切开肺部，可见肺小叶间隔肿胀。脑膜弥漫性充血、水肿，其他的内脏器官没有明显的变化4病毒分离鉴定
4.1试剂、材料与仪器
4.1.1试剂与材料：Vero细胞或RK-13细胞、EMEM或其他培养基、抗生素贮存液、细胞消化液、细胞培养液和细胞维持液、细胞瓶和各种常规试剂等（见附录A）。试验用水应符合GB/T6682要求。4.1.2仪器：生物安全柜或超净工作台、倒置显微镜、高速冷冻离心机、二氧化碳培养箱、高压灭菌锅等。
4.2样品采集与处理
4.2.1样品采集与运送：无菌采集动物脑、肺、肾和脾脏等组织，4℃保存运送到BSL-4级生物安全实TTKANYKACa
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验。也可用干冰保存运送，但病料不能长期存放在一20℃。4.2.2样品处理：无菌处理样品，样品称量，置于无菌密闭容器内，加人少量组织培养液和抗菌素，用无菌研槌研磨，制备成组织悬液。再加组织培养液，使最终为10%组织悬液。以1500r/min离心10min小心收取上清液低温保存备用。4.3病毒分离
4.3.1将上述上清液用维持液作倍比稀释，无菌接种于已长成单层的Vero或RK-13细胞瓶或细胞培养板上，每个滴度接种两瓶或两孔。同时设立细胞对照和阳性对照，单层细胞仅加维持液做细胞对照，用60倍稀释的标准病毒接种做阳性对照4.3.2加盖摇匀使之均匀分布于整个细胞层，置于37℃孵育1h。加人维持液置于37℃继续培养，逐日观察细胞病变（CPE），尼帕病毒（NiV）一般在3d内出现CPE。4.3.3无CPE出现者应盲传两代，即将细胞培养物冻融两次，再接种到单层细胞培养5d～7d。出现CPE者，待70%细胞出现CPE时，收取细胞毒。将感染细胞反复冻融数次，2000r/min离心10min，小心收集上清液，分装后低温保存，待进一步进行病毒鉴定。4.3.4用微量血清中和试验或其他方法对分离的病毒进行鉴定4.4结果判定
检查各种对照试验，细胞对照正常，无CPE；阳性对照出现明显的CPE，说明试验成立。如果试验组出现明显的CPE，表现为细胞圆缩、脱落、裂解，则初步判定为病毒分离阳性；如果分离的细胞培养物能被NiV阳性血清中和或被其他方法鉴定，则分离的病毒为NiV。5电镜观察
5.1试剂、材料与仪器
5.1.1试剂与材料：2.5%戊二醛溶液、0.1mol/L磷酸缓冲液、乙酸异戊酯、乙醇、双蒸水、显影液、定影液、NiV、Vero细胞等。
5.1.2仪器：扫描电镜、临界点干燥仪、离子溅射镀膜仪、底片扫描仪。5.2操作方法
5.2.1用小盖玻片培养接毒的贴壁细胞。5.2.2用0.1mol/L,磷酸缓冲液（pH7.2)洗两次。5.2.3固定：用2.5%戊二醛溶液室温于通风橱固定1h。固定完后用0.1mol/L磷酸缓冲液和蒸馏水充分洗净。
5.2.4脱水：洗净后用35%、50%、70%、80%、90%、95%、100%乙醇逐渐上升脱水。每级各5min。5.2.5置换：用乙醇：乙酸异戊酯（1：1）混合液及100%乙酸异戊酯依次置换5min，最后将样品浸于乙酸异戊酯15min。
5.2.6临界点干燥：在于燥前先通过放人液体二氧化碳使得仪器压力罐温度降到低于室温10C，接看将样品放入小篮中置于罐内。打开进口阀，放入液体二氧化碳，至充满罐的50%～80%体积。再升温至20℃，使得二氧化碳置换乙酸异戊酯20min，再升温至40℃，此时压力应该大于80kg/cm。保持5min后，缓慢将二氧化碳气体放出，时间大概2h左右。待压力降到0时，再调节温度至室温，取出样品，暂存干燥器中备用。
5.2.7喷镀：将已干燥好的样品用导电胶粘于金属的样台上，再一起置于真空喷镀仪真空罩中，进行喷镀金铂合金镀层，完成后电镜下观察。2
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5.2.8电镜观察。
5.3结果判定
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如果电镜观察显示：病灶原生质膜增厚呈头发样，多核细胞突出，核正常。细胞外病毒粒子呈多形性（球形或细长形），大小为50nm～500nm不等，病毒粒子被有许多表面突起的膜包裹，核衣壳呈各异的螺旋状和人字形，并被囊膜所包被，则可初步判定为NiV阳性。免疫组织化学试验
6.1原理
免疫组化法用于检测福尔马林固定的组织或细胞，该方法还可以检测存放已久的病料，用于调查以往该病发生的情况。在发病动物的很多组织中都可以检测到该病毒，病料采集范围包括：不同的脑组织、脾脏、肾脏和纵隔淋巴结等。孕畜还应包括子宫、胎盘和胎儿的器官等。6.2试剂、材料与仪器
6.2.1试剂与材料：固定液、石蜡、玻片、二甲苯、无水乙醇、胰蛋白酶、脱脂奶粉、免抗尼帕病毒抗体、酶标二抗、显色液、Scotts溶液、H.O、中性封片剂和各种常规试剂等（见附录B）。6.2.2仪器：切片机和显微镜等。6.3病料处理
6.3.1将采集的病料浸人10倍体积的固定液中固定。7d后更换固定液，再维持一周。6.3.2将选取好的组织块放人新配的固定液中再固定7d，其间更换固定液三次，并在水平摇床上不断摇荡，以提高固定液的渗透力。6.3.3将固定好的组织块放人流水中漂洗24h。6.3.4放入下列不同浓度的酒精中脱水：75%酒精2h-+85%酒精2h--95%酒精I2h→95%酒精Ⅱ2h→100%酒精12h-+100%酒精2h。6.3.5放入香柏油和二甲本中透明：香柏油中12h-→二甲苯I1h-→二甲苯Ⅱ1h。6.3.6浸蜡：软蜡中放置40min；硬蜡中放置2h。6.3.7将浸好蜡的组织块放人包埋框中用硬蜡包埋，4℃冷却过夜6.3.8将石蜡块切成5μm厚的切片，用干净的载玻片贴片。6.4操作方法
6.4.1脱蜡：依次将切片放入二甲苯-二甲苯-二甲苯各1min，无水乙醇-无水乙醇-70%乙醇各5min，然后用流水冲洗。
6.4.2将切片置于蒸馏水中漂洗，然后浸人包含0.1%（质量浓度）胰蛋白酶的0.01mol/L氯化钙中（用0.1mol/L的氢氧化钠调pH值至7.8），37放置20min，用蒸留水冲洗。6.4.3将切片放人湿盒内用PBS漂洗5min。洗完后用吸水纸吸干组织块周围的液体，每张切片上滴加200μL3%的HzOz溶液，室温放置20min，然后倒掉HzOz，放入PBS中漂洗5min。6.4.4洗完后用吸水纸吸干组织块周围的液体，向切片上滴加200L适当稀释的免抗尼帕病毒抗体（用包含0.1%脱脂奶粉的PBS稀释，每份样品和对照均要设立平行试验），将切片封好置于37℃孵育h。
6.4.5将切片放人PBS中漂洗5min，洗完后用吸水纸吸干组织块周围的液体，滴加2滴～3滴酶标二TTKANTKACa
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抗，37℃孵育20min。
6.4.6将切片放人PBS中漂洗5min.洗完后用吸水纸吸干组织块周围的液体，滴加显色液，在显微镜下观察染色程度。阳性对照切片染色充分后（通常2min～5min），用蒸馏水漂洗终止反应6.4.7将切片用PBS漂洗5min，洗完后用吸水纸吸干组织块周围的液体，放人苏木素中复染1min~3min，用蒸馏水冲洗，加入Scotts溶液，流水冲洗。蒸馏水漂洗切片，用中性封片剂封片。6.4.8显微镜观察
6.5结果判定
如果镜检切片显示细胞质可见褐色/红色颗粒状着色点，细胞核皇蓝色，则判定为NiV阳性。7微量血清中和试验
7.1试剂、材料与仪器
7.1.1试剂与材料：细胞培养液、细胞维持液、细胞消化液和抗生素贮存液等，标准阳性血清、阴性血清和被检血清经56℃灭能30min备用，Vero细胞和尼帕病毒株NiV（见附录A）。7.1.2仪器：生物安全柜、二氧化碳培养箱、倒置显微镜、液氮贮存罐、微量细胞培养板等。7.2操作方法
7.2.1中和病毒滴度（TCIDso）测定7.2.1.1中和病毒制备
将保存于液氮中的NiV种毒取出置于4℃C缓慢融化，将融化的种毒用维持液作60借稀释后，取1mL接种于长成单层Vero细胞的细胞瓶中，吸附1h。先用维持液洗涤一次，再加入维持液，放置于37℃恒温箱中培养36h～48h，当50%～75%细胞出现CPE，即可收获病毒培养液，分装成1mL后冻存（一70℃以下）备用。
7.2.1.2病毒滴度测定
在微量细胞培养板（96孔）每孔加25uL细胞培养液，用病毒稀释液将冻存病毒作10-1，10-2....…10-8系列稀释，每一稀释度的病毒接种八孔，每孔25μL。正常细胞对照，四孔至八孔不加病毒，仅加25μL病毒稀释液。每孔100uLVero细胞（2.4×10/100μL），置37℃培养，48h后初判，72h终判。如细胞对照正常，接种病毒的细胞出现CPE（细胞圆缩、脱离、裂解），记录试验数据。根据Karber法计算该批病毒的毒价（半数组织感染量TCIDs）。7.2.2微量血清中和试验
7.2.2.1在96孔细胞培养板上每孔加25L细胞培养液。第一列四孔作被检血清（毒性）对照，每孔加25μL被检血清，用移液器混匀后弃25μL；第二列四孔，每孔加25μL被检血清，混匀后吸出25μL至第三孔，依次倍比稀释到第四孔，即血清稀释为1：2、1：4和1：8，每一稀释度各四孔。7.2.2.2用病毒稀释液将病毒稀释成工作浓度200TCIDs0，第一列四孔加病毒稀释液（无病毒）作被检血清（毒性）对照，第二至四列的各孔加25L稀释的病毒。盖上培养板，轻轻摇匀，放入二氧化碳保湿培养箱（5%二氧化碳）37℃孵育1h。阴、阳性血清对照（方法同上）。7.2.2.3病毒滴度验证试验，将工作浓度的中和病毒再作10-1、10-2、10-\稀释.再加25μL病毒稀释液，每一稀释度各四孔。正常细胞对照，留四孔至八孔，每孔仅加25μL的病毒稀释液，不加血清和病4
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毒。上述每孔加100μLVero细胞，细胞浓度为（2.4×10*/100μL）。放人二氧化碳保湿培养箱（5%二氧化碳）37℃培养，48h用倒置显微镜进行初步判定.72h后最终判定结果。7.3结果判定
7.3.1检查各种对照试验，细胞对照正常，无CPE；阴性血清出现明显的CPE，表现为多个细胞发生融合，形成合胞体，最后细胞脱落、裂解；阳性血清无CPE，细胞不出现病变。病毒滴度验证时滴度与原测定滴度相差应在0.31og1范围内，说明病毒稀释浓度符合微量血清中和试验的工作浓度。被检血清对照孔不出现病变，说明被检血清无毒性反应。7.3.2在各种对照成立的情况下，检查各个被检血清的CPE。如果出现CPE，则判为阴性孔；如果不出现CPE，则判为阳性孔。以完全中和病毒感染性（即不出现CPE)的最大稀释度为该血清的中和抗体效价。
7.3.3如被检血清孔1：4为阴性，判该动物为血清学阴性。如被检血清1：4或更高稀释度的孔为阳性，判该动物为血清学阳性。如被检血清孔1：2为阳性，则该动物判为可疑。出现可疑情况时，应对可疑血清重试一次，最终判定结果以重试为准。如果两次试验均为可疑反应，则该动物视为血清学阳性动物处理。
8酶联免疫吸附试验（ELISA）
8.1试剂、材料与仪器
8.1.1试剂与材料：PBS、病毒抗原、细胞对照抗原、封闭液、洗涤液、底物溶液、终止液、脱脂奶粉、H,O2、阳性血清、弱阳性血清和阴性血清等（见附录C,参见附录D)。8.1.2仪器：酶标仪、96孔酶标板、振荡培养箱等。8.2操作方法
8.2.1将病毒抗原和细胞对照抗原用PBS1：1000稀释，将稀释后的抗原加入96孔板中，1、3、5、7、9和11孔滴加病毒抗原，2、4、6、8、10和12孔滴加细胞对照抗原。置于37℃振荡培养1h或4℃过夜，每孔50L
8.2.2倒掉孔内液体，在吸水纸上吸干，每孔加满洗涤液（PBS-T），静置1min～2min后倒掉，吸干，重复洗三次。
8.2.3加入封闭液，每孔100uL，置37℃振荡孵育30min。8.2.4用PBS-T洗板三次（同上）。8.2.5按照8.2.3每孔加人100uL准备好的待检血清，各缓冲液对照孔加人100μLPBS（含5%鸡血清和5%脱脂奶粉），置37℃静止1h。8.2.6用PBS-T洗板三次（同上）。8.2.7用含1%脱脂奶粉的PBS-T稀释酶标抗体，混匀后除底物对照孔外每孔加人100μL.底物对照孔加人100μL含1%脱脂奶粉的PBS-T。置37℃静止1h。8.2.8用PBS-T洗板三次（同上）。8.2.9每孔加入100uL底物溶液，置室温（18℃～22℃）静止10min。8.2.10每孔加人100μL的1mol/L硫酸终止反应8.2.11将板置于酶标仪上，在450nm波长条件下读取光吸收值。8.2.12每次试验设立强阳性、弱阳性、阴性血清、各缓冲液对照孔和未感染病毒的细胞抗原对照孔。5
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结果判定
OD比值计算见式（1）：
OD比值=
待检血清NiV抗原孔OD值
待检血清细胞对照抗原孔OD值
当OD比值大于2.0,NiV抗原OD值大于0.20时为阳性。当OD比值大于2.0,NiV抗原OD值小于0.20时为阴性。当OD比值在2.0～2.2之间为可疑ELISA可疑或阳性血清用中和试验进行验证。9综合判定
9.1病毒分离、电镜观察结果均为病原初步诊断·需要进一步应用免疫组织化学试验或血清中和试验进行确证。
9.2ELISA结果为血清学初步诊断，需要应用血清中和试验进行确证6
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A.1抗生素贮存液
（规范性附录）
病毒分离培养基和试剂的配制
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用灭菌三蒸水配成每毫升含10000IU青霉素和10mg链霉素的抗生素贮存液，用微孔滤膜（0.22μm）过滤除菌，分装成2mL/瓶，一20℃冻存备用。保存期不超过60d。A.2细胞消化液（0.02%EDTA）
EDTA（乙二胺四乙酸二钠）
氯化钠
氯化钾
磷酸氢二钠
磷酸二氢钾
加三蒸水至1000mL，充分溶解，分装成小瓶，115℃高压灭菌10min，4℃冷藏备用。保存期不超过90d。
A.3细胞培养液和细胞维持液
细胞培养液：含10%灭能的无菌胎牛血清（FBS)的EMEM培养基。细胞维持液：含2%灭能的无菌胎牛血清（FBS)的EMEM培养基细胞培养液和细胞维持液均用微孔滤膜（0.22um）过滤除菌，分装成小瓶，4℃保存备用。保存期不超过60d。使用时加1%抗生素贮存液（终浓度为每毫升EMEM培养基含100IU和100μg），并用7.5%碳酸氢钠溶液调pH值至7.0~7.27
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B.1固定液
附录B
（规范性附录）
免疫组织化学试验试剂配制
10%福尔马林生理盐水固定液的配制：氯化钠8.5g，蒸馏水900mL，40%福尔马林100mL.混匀即可。
2显色液
将2mg3-氨基-9-乙基咔唑溶于200μL二甲基甲酰胺中，加入10mL0.02mol/L醋酸缓冲液，调pH值为5.0，再加入5μLH.O（30%，质量浓度）混匀，现用现配。BScott's溶液
碳酸氢钠（NaHCO，）
硫酸镁（MgSO,·7H20)
加双蒸水至1000mL，充分溶解.分装成小瓶115℃高压灭菌10min，4℃冷藏备用8
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C.1磷酸盐缓冲液（PBS）
磷酸氢二钠
磷酸二氢钾
氯化钠
氯化钾
附录C
（规范性附录）
ELISA试验试剂的配制
先加适量的双蒸水，完全溶解后加双蒸水定容至1000mL，pH为7.4。2磷酸盐缓冲液-吐温（PBS-T）洗涤液C2
PBS1000mL，吐温-20(Tween-20)0.5mL，混匀。3封闭液
PBS1000mL，加5mL鸡血清和5g脱脂奶粉，溶解混匀C.4底物溶液
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C.4.1称取柠檬酸（C,H.O，·H.O)10.5g，先加适量的双蒸水，完全溶解后加人双蒸水定容至1000mL，配成0.05mol/L柠檬酸溶液。
C.4.2称取1mg3，35,5-四甲基联苯胺（TMB）溶于10mL柠檬酸磷酸盐缓冲液（0.05mol/LpH5.0），用前再加入2μL30%（体积分数）H，O.即成底物溶液。9
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D.1病毒抗原制备
附录D
（资料性附录）
ELISA抗原制备与样品前处理
D.1.1在滚瓶中培养Vero细胞直至单层，每瓶保留5mL培养液，其余倒掉。在BSL-4实验室条件下将NiV病毒接种到Vero细胞。
D.1.233℃旋转滚瓶30min以吸附病毒，然后每瓶加60mL细胞培养液，33℃继续旋转48h。D.1.3用预冷的0.01mol/LPBS洗涤病毒感染的细胞一次，每瓶刮取细胞，收集到5mL～10mL预冷的PBS中。
D.1.4将收集的细胞转移至50mL离心管中，4℃300g离心5min，倒掉PBS.用预冷的TNM重悬细胞，每瓶大约0.5mLTNM。
D.1.5加NP40裂解液至1%，用移液器吹打5次～10次以裂解细胞D.1.64℃600g离心10min
D.1.7轻轻地将上清液移人一个新管中，添加乙二胺四乙酸至1.5mol/L。补加TNE至10mL.进行分装，一80℃冷冻并用6千赫-射线照射，并存于一80℃备用。D.2细胞对照抗原制备
在滚瓶中培养Vero细胞直至单层，用预冷的PBS洗涤单层细胞，刮取细胞，每瓶收集到5mL～10mL预冷的PBS中。后面的步骤同上D.1.4～D.1.7。D.3样品前处理
D.3.1在Ⅱ级生物安全柜内.用含0.5%（体积分数）TritonX-100和0.5%（体积分数）吐温-20的PBS在96孔板上1：5稀释待检血清，将板封好放入56℃水浴30min灭活D.3.2将22.5μL灭活血清与等量用PBS1：100稀释的细胞对照抗原混合，置于18℃～22℃孵育30min。
D.3.3每孔加405μL封闭液，使血清最终稀释度为1：100.置于18℃～22℃孵育30min，备用。10
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