SN/T 2868-2011
基本信息
标准号： SN/T 2868-2011
中文名称：西尼罗病毒病检疫技术规范
标准类别：商检行业标准(SN)
标准状态：现行
出版语种：简体中文
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标准分类号
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出版信息
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标准简介
SN/T 2868-2011 西尼罗病毒病检疫技术规范
SN/T2868-2011
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标准内容
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T2868—2011
西尼罗病毒病检疫技术规范
Quarantineprotocolfor westnilefever2011-05-31发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2011-12-01实施
本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。SN/T2868—2011
本标准参考了国际动物卫生组织（OIE)的《诊断试验和疫苗标准手册》（2008版）(Manual ofDiagnosticTestandVaccinesforTerrestrialAnimals)2.1.20章和有关行业标准、文献制定，补充了RT-PCR和实时荧光RT-PCR的检测方法
本标准由国家认证认可监督委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国上海出入境检验检疫局、中华人民共和国江苏出入境检验检疫局、中华人民共和国云南出人境检验检疫局。本标准主要起草人：邱璐、李健、姜焱、熊炜、周晓黎、蒋静、胡永强。I
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1范围
西尼罗病毒病检疫技术规范
本标准规定了西尼罗病毒病临床诊断和实验室诊断。本标准适用于西尼罗病毒病病原及抗体的检测。2规范性引用文件
SN/T2868—2011
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3临床诊断
3. 1发病症状
人和马感染后，多数不出现症状，部分感染者发生伴有类似流感症状的西尼罗热，少量严重的病例出现高热、剧烈头痛、颈项强直、昏迷、抽搐等中枢神经系统体症，发生西尼罗脑炎，甚至死亡。3.2流行病学
西尼罗病毒（westnilevirus，WNV)为单链RNA病毒，属黄病毒科黄病毒属。病毒呈球形，基因组编码三种结构蛋白(C、prM和E蛋白)与七种非结构蛋白。西尼罗病毒在抗原性上与同属黄病毒的日本乙型脑炎病毒、圣路易斯脑炎病毒、Kunjin病毒、登革病毒相似，在血清学检测时，易产生交叉反应西尼罗病毒于1937年首次分离，经蚊媒传播可引起人类或动物的西尼罗热及西尼罗脑炎。类、马、人等哺乳动物都是易感动物。其中鸟类是主要的储存宿主。该病在20世纪50年代～90年代都曾有过流行，特别是20世纪90年代以后，流行区呈扩大趋势，范围遍及非洲、欧洲、中东、西亚、中亚、大洋洲和北美洲等广大地区。目前我国尚无该病流行的报道，但随着全球气候变暖，疫源地旅行传播以及生物媒介等潜在因素的存在，为西尼罗病毒的传播提供了可能。加之该病毒自前在我国周边国家如印度、俄罗斯南部、东南亚等国已有报道，我国人群普遍缺之对该病毒的免疫力，一且传入，将导致严重的公共卫生灾难。4实验室诊断
4.1西尼罗病毒RT-PCR、实时荧光RT-PCR检测及套式PCR检测4.1.1方法介绍
可以进行西尼罗病毒核酸检测。本标准提供的三种核酸检测方法可以根据具体情况选择采用。PCR试验的前处理操作可以在BSL-2实验室进行。在对人、活动物或户体进行取样时，采样人员应佩戴个人防护设施，穿戴防护衣，佩戴防护口罩、面罩、手套1
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4.1.2设备、材料和试剂
设备、材料
4.1.2.1.1PCR仪。
实时荧光PCR检测仪
4.1.2.1.2
3电泳仪。
4.1.2.1.3
4.1.2. 1.4
4.1.2.1.5
凝胶成像分析系统。
高速台式冷冻离心机。
6普通台式离心机。
4.1.2.1.6
匀浆器。
4.1.2.1.7
4.1.2. 1.8
微量可调移液器。此内容来自标准下载网
4.1.2.1.9无RNase的离心管，吸头和无RNase的玻璃容器4.1.2.2试剂
除特别说明以外，本标准所用试剂均为分析纯，所有试剂均用无RNase污染的容器（用DEPC水处理后高压灭菌)分装。试验用水应符合GB/T6682规定，4.1.2.2.1裂解液：Trizol或其他，4.1.2.2.2异丙醇。
4.1.2.2.3TaqDNA酶。
4.1.2.2.4
75%乙醇：用新开启的无水乙醇和DEPC水配制，一20℃预冷。5dNTP：含dATP.dTTP、dCTP、dGTP各10mmol/L。4.1.2.2.5
4.1.2.2.6
4. 1. 2. 2.7
逆转录酶。
DEPC水：用DEPC处理后的水。
4.1.2.2.850XTAE缓冲液。
4.1.3采样、送检和处理
人员样本菜集
4.1.3.1.1采集来自于疫区的人员、人境可疑人员、申请检验人员的血液。4.1.3.1.2采集怀疑死于西尼罗病人员的血液、脑髓液、组织样品，特别是脑组织和神经组织样品。4.1.3.2动物及产品样本采集
4.1.3.2.1采集来自疫区的活动物的血清4.1.3.2.2采集来自疫区的疑似感染的动物的脑、脊髓、其他组织样品，特别是神经组织样本。4.1.3.3禽鸟和蚊虫样本采集
4.1.3.3.1采集来自疫区的贸易鸟、禽类的血清4.1.3.3.2采集迁徒的鸟类血清。4.1.3.3.3采集来自疫区包装箱内的死鸟、死禽的脑、其他组织样本。4.1.3.3.4采集来自西尼罗疫区的藏匿于交通工具、运输设备中的蚊虫或以其他方式藏匿的蚊虫样本。特别是库蚊和饱血蚊虫
4.1.3.4来自西尼罗病毒病疫区的交通工具、运输设备的样本采集取样时将棉拭子用无菌PBS浸润后，在面积为5cm2×5cm区域内横直各擦拭10次，并不断转2
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换拭面，然后将拭子棉花端倾入装有pH7.2～7.4PBS液的试管中。4.1.3.5样本的送检和处理
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4.1.3.5.1
采样过程中样本不得交叉污染。样品采集后，放入密闭的塑料袋内，一个采样点的样品，放二个塑料袋，于保温箱中加冰、密封，送实验室。采集或处理的样本在2～8C条件下保存应不超过24h；若需长期保存，应放置一70℃冰箱，冻融不超过3次。4.1.3.5.2血清或血浆：用无菌注射器直接吸取至无菌离心管中，编号备用。4.1.3.5.3病毒培养物：用无菌滴管直接吸取至无菌离心管中，编号备用。4.1.3.5.4蚊体、神经或其他组织脏器：取待检样品2.0g置于匀浆器中.加人10mLPBS匀浆，然后将组织悬液转人离心管中3000r/min离心10min取上清液转入另一无菌离心管中，编号备用。4.1.3.5.5拭子：将装有拭子的试管在混旋仪上充分混旋提取，挤干拭子，取上清液。试管编号备用4.1.4操作步骤
引物和探针的设计
参见表A.1~表A.3。
4.1.4.2样本核酸提取
4.1.4.2.1在样本制备区进行。取n个灭菌的1.5mL离心管，其中n为被检样品数、一份阴性、一份阳性对照数量之和，对每管进行编号（阳性对照为DNA，无需此步骤）。4.1.4.2.2每管加入1mL裂解液，然后分别加入4.1.3.5处理后的被检样本、阴性对照、阳性对照各300μL，一份样本换用一个吸头，再加人200μL三氯甲烷，充分振荡均勾（如使用旋涡振荡器，避免振荡过于强烈产生乳化层）。在4℃条件下，12000r/min离心15min。4.1.4.2.3取与4.1.4.2.1中相同数量的1.5mL灭菌的离心管，加人400μL预冷的异内醇，将上步离心后样品及对照的上清液500L转移至相应的各管，避免吸到中间层，盖紧瓶盖，颠倒混均。-20℃冰箱静置30min。
4.1.4.2.412000r/min离心15min，轻轻倒去上清液，每管加人500μL75%乙醇，颠倒洗涤。4.1.4.2.512000r/min离心10min，轻轻倒去上清液，吸去残余液体，室温下干燥5min。4.1.4.2.6将抽提的RNA溶解在20μLDEPC水中待用4.1.4.3检测
4.1.4.3.1PCR反应体系
建议的三种PCR检测反应体系参见表A，4表A.6。每个样本设两个平行，每次反应应带阴性、阳性对照。可以采用两步法进行。4.1.4.3.2反应参数
4.1.4.3.2.1普通RT-PCR反应参数：42℃.60min；94℃.2min；94℃，20s,55℃,20，72℃，1min.35个循环；72℃.3min；25℃.15s.
4.1.4.3.2.2荧光RT-PCR反应参数：42℃.60min94℃，2min；94℃.15s，50℃，15s.72℃，30s，5个循环；94℃.15s.58℃，40s，40个循环（每个循环的第二步搜集荧光）。4.1.4.3.2.3套式PCR反应参数：3
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第步反应：70℃10min；45℃，45min；95℃，11min；95℃30s.55℃.45s72℃.60s.35个循环；72℃，5min；25℃，15s。第二步反应：95℃.30s，55℃，45s，72℃，60s.35个循环；72℃，5min25℃,15s.
4.1.4.3.3普通RT-PCR和套式PCR产物的电泳检测将50×TAE稀释成工作浓度，配制1.5%琼脂糖溶液，加热溶解，略为冷却后加人溴化乙锭储备液，使溴化乙锭的含量为0.5μg/mL，铺板。取10μLPCR反应产物，加2μL上样缓冲液，进行电泳。根据情况，选择恒定电流或恒定电压模式，当漠酚蓝迁移至接近凝胶末端三分之二处时，停止电泳。用凝胶成像系统记录结果。若发现条带的大小与阳性结果一致时，将PCR产物进行测序，再与数据库中序列进行比对。4.1.5结果判定
4.1.5.1普通RT-PCR结果判定
检测后，如果阴性对照和空白对照未出现条带，阳性对照出现预期大小扩增条带，样品未出现预期条带，则判定样品为阴性。
检测后，如果阴性对照和空白对照未出现条带，阳性对照和样品出现预期大小扩增条带，并且对样品的PCR产物进行测序分析，若证实与西尼罗病毒的核酸序列一致，则判定样品为阳性。反之，则判断为阴性。
4.1.5.2荧光RT-PCR结果判定
4.1.5.2.1总则
可以作为核酸检测的筛选试验。如要确诊，则需要进行普通RT-PCR试验并进行测序，或者其他相关试验完成。
4.1.5.2.2荧光RT-PCR结果分析条件设定直接读取检测结果。阅值设定原则根据仪器噪声情况进行调整，以阈值线刚好超过正常阴性样本扩增曲线的最高点为准。
4.1.5.2.3荧光RT-PCR质控标准
阴性对照无Ct值并且无扩增曲线阳性校准品应呈现出典型的阳性扩增曲线。如阴性对照和阳性校准品扩增曲线不满足以上条件，此次实验视为无效。4.1.5.2.4判定
当样品的Ct值大于或等于40.并且未出现扩增曲线，则判断为阴性。当样品的Ct值小于或等于30时，同时出现典型的扩增曲线，则判断为阳性当样品的Ct值大于30而小于40.并出现扩增曲线时，建议复检，复检后的Ct值仍然小于40，并出现扩增曲线，可判断为阳性。若Ct值大于40，则判断为阴性4.1.5.3套式RT-PCR结果判定
检测后，阴性对照和空白对照未出现条带，阳性对照在248bp出现扩增条带。如样品出现与阳性对照大小一致的扩增条带，则样品疑似阳性，通过对样品的PCR产物进行测序4
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分析，证实与数据库公布的西尼罗病毒的核酸序列一致，则判定样品为阳性。如样品出现的条带大小与阳性对照接近，则实验需从RNA提取开始重新进行，最终结果需通过测序最后判定。4.1.5.4结果描述
以西尼罗病毒核酸阴性或核酸阳性对结果进行描述4.2西尼罗病毒抗体捕捉ELISA检测4.2.1检测方法介绍
可以对西尼罗病毒抗体进行检测。4.2.2设备、材料和试剂
4.2.2.1酶标仪。
4.2.2.2洗板机。
4.2.2.3可调移液器。
包被缓冲液：0.01mol/L磷酸盐缓冲液，pH7.2，可根据试剂盒或具体方法的不同略有差异4.2.2.4
4.2.2.5稀释缓冲液或洗液（PBST）：0.01mol/L磷酸盐缓冲液，pH7.2，含0.05%Tween，可根据试剂盒或具体方法的不同略有差异。4.2.2.6
封闭缓冲液：以PBST配制的5%脱脂奶粉溶液，可根据试剂盒或具体方法的不同略有差异。显色液：ABTS（3-乙基苯并噻唑-6-磺酸），可以选择其他的底物。4.2.2.81
IgM抗体：根据检测对象（为人、马还是其他动物）不同而异WNV标准阳性血清：根据检测对象（为人、马还是其他动物）不同而异。4.2.2.9
4.2.2. 11
WNV标准阴性血清：根据检测对象（为人、马还是其他动物）不同而异。WNV病毒或标准抗原：根据检测对象（为人、马还是其他动物）不同而异。阴性对照抗原：根据检测对象（为人、马还是其他动物）不同而异4.2.2.131
HRP标记的黄病毒或WNV的单抗：根据检测对象（为人、马还是其他动物）不同而异。4.2.3采样、送检和处理
按4.1.3中有关血清采集的内容进行。4.2.4操作步骤
4.2.4.1在ELISA反应96板上包被经过稀释的IgM抗体（稀释度依据生产商或方法建立方提供的建议而确定），100μL/孔，在4℃湿盒中包被过夜。包被后的板可以存放数周。4.2.4.2以200μL/孔～300μL/孔的量，用PBST洗板3次～5次4.2.4.3加人封闭缓冲液，37℃下孵育60min。重复4.2.4.2。4.2.4.4用PBST稀释待检血清、WNV阳性血清、WNV阴性血清，稀释浓度依据方法和试剂盒可有差异。
4.2.4.5将稀释完成的血清以50μL/孔～100uL/孔加人到包被好的板中，37℃下作用1h～1.5h。每一样本应做复孔，共做4份复孔（在后面的步骤中，2孔加WNV标准抗原，2孔加阴性对照抗原）。4.2.4.6重复4.2.4.2。
4.2.4.7加人用PBST稀释好的病毒抗原及阴性对照抗原，每孔的加样量与血清加样量等同4.2.4.84℃湿盒中反应过夜
4.2.4.9重复4.2.4.2。
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4.2.4.10用PBST稀释HRP标记的黄病毒或WNV单抗（稀释度依据生产商或方法建立方提供的建议而确定），加人板中，加液量与血清及病毒加液量一致，37℃下作用1h。4.2.4.11重复4.2.4.2。
4.2.4.12每孔加入显色液.加液量与血清及病毒加液量一致，室温或37℃下作用30min。4.2.4.13加入1mol/L的硫酸终止反应。用酶标仪在405nm（根据底物）下测定OD值。4.2.5结果判定
待检样品的OD值（加WNV标准抗原）为阴性对照OD值的2倍或以上、并且为待检样品的OL值（加阴性对照抗原）的2倍或以上，判断为IgM捕获ELISA阳性。可采用等效的试剂盒方法或其他建立的ELISA方法中的判定标准判定，但事先应经过验证实验4.3蚀斑减少中和试验（PRN）
4.3.1方法介绍
可以对西尼罗病毒抗体进行检测。4.3.2设备、材料和试剂
4.3.2.1二氧化碳培养箱。
离心机。
4.3.2.3可调移液器。
4.3.2.4vero细胞。
vero细胞培养基：DMEM或MEM培养基。4.3.2.6月
胎牛血清。
培养基添加用抗生素（终浓度青链霉素100U/mL；链霉素100μg/mL）。无菌PBS（无钙、镁离子）。
0.25%胰酶-EDTA
细胞维持液：MEM培养基中添加4%的胎牛血清及双抗4.3.2.11
WNV标准毒株：用含10%豚鼠补体的培养基稀释到工作浓度。WNV阳性血清：根据检测对象（为人、马还是其他动物）不同而异。4.3.2.13
WNV阴性血清：根据检测对象（为人、马还是其他动物）不同而异。4.3.2.14
2%琼脂：配制后高压待用。
2X不含酚红的含Earles平衡盐的MEM维持液溶液。0.45%碳酸氢钠
溶液I：2X不含酚红的含Earle's平衡盐的MEM溶液十4%胎牛血清十双抗营养琼脂：等量预热的2%琼脂糖与溶液I混合而成，实验开始前新鲜配制。0.5%中性红溶液：pH7.4，高压或过滤除菌。覆盖琼脂：营养琼脂十中性红溶液（终浓度0.003%）。4.3.3美
采样、送检和处理
按4.1.3中有关血清采集的内容进行。4.3.4操作步骤
病毒培养
见4.4.3在70~80%细胞出现CPE后，反复冻融2次3次，-80℃备用。6
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4.3.4.2蚀斑形成单位(PFU)测定SN/T2868—2011
接种前用PBS冲洗细胞，弃冲洗液，然后接种。用细胞维持液以10倍量稀释病毒，共7个稀释度，接种于长满单层vero细胞的96孔培养板上，每个稀释度接种8孔，100uL/孔，对照组只加细胞维持液，在37℃二氧化碳孵箱中吸附1h～2h，每15min摇动一次，弃病毒液，并用PBS冲洗，弃液。以100uL/孔加人营养琼脂于上述培养板中，37℃二氧化碳培养箱中孵育3d～4d,再以100μL/孔加人覆盖琼脂，12h～24h后观察细胞病变，计算PFU（每毫升病毒原液的蚀斑数）。然后稀释100PFU50L的病毒工作液，稀释液含10%豚鼠补体。4.3.4.3蚀斑减少中和试验
被检血清试验前在56℃灭活30min。待检血清、标准阳性血清、标准阴性血清用细胞维持液做倍量稀释，稀释后体积50μL，加入等体积100PFU/50μL的病毒悬液，混勾，37℃作用1h～1.5h，然后将混合液接种到长满单层vero细胞的96孔培养板上，100uL/孔，每个稀释度接种5孔～8孔，于37℃二氧化碳培养箱中作用1h～2h，弃液，加入营养琼脂100μL/孔，37℃二氧化碳培养箱中孵育3d～4d，再以100μL/孔加人覆盖琼脂，12h～24h后观察细胞病变，计数蚀斑形成数量。4.3.5结果判定
待检样本中和效价大于1：10.判定为阳性。4.4西尼罗病毒分离
4.4.1方法介绍
可以对西尼罗病原进行分离。再通过其他实验对病原进行进一步鉴别。4.4.2设备、材料和试剂
4.4.2.1二氧化碳培养箱。
离心机。
可调移液器。
倒置显微镜
均质机、匀浆器、超声裂解器。4.4.2.5
细胞培养板。
滤器（0.45μm）。
vero细胞
vero细胞培养基：DMEM或MEM培养基胎牛血清。
细胞维持液，培养基中添加3%的胎牛血清及双抗培养基添加用双抗（终浓度青链霉素100U/mL；链霉素100μg/mL）。4.4.2. 13
无菌PBS(pH7.2～pH7.4无钙、镁离子）。4.4.2.14
0.25%胰酶-EDTA
采样、送检和处理
按4.1.3中有关内容进行
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采集样本后，应在24h内送达实验室进行检测。为保证分离效果，储存时应尽量保持在一80℃以下。在条件充许范围内尽可能保证在最低温度下运送样本血液样本直接冻融2次～3次，用含10%胎牛血清的PBS稀释10倍，3000r/min离心10min，上清液用滤器过滤后备用。
脑髓液样本用含10%胎牛血清的PBS稀释5倍～10倍，3000r/min离心10min，上清液用滤器过滤后备用。
用于病毒分离的组织样本需在预处理时，在PBS中加入10%的胎牛血清，初步粉碎后，冻融几次，用超声裂解仪裂解，上清液离心过滤后备用4.4.4操作步骤
将处理好的样本0.1mL接种到形成良好单层的Vero细胞的细胞培养板中，每个样本接种4孔，放置于37℃二氧化碳培养箱吸附1h，去除干预的样本，加人细胞维持液，继续放人37℃二氧化碳培养箱培养5d，每日观察细胞病变（CPE)，详细记录。4.4.5结果判定
若5d内未出现细胞病变，则收取培养物盲传3代继续培养观察，仍未出现CPE的样本，病毒分离判定为阴性。若出现典型的细胞病变，则进一步采用RT-PCR、ELISA或蚀斑减少中和等试验进行鉴定。
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附录A
（资料性附录）
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西尼罗病毒RT-PCR、实时荧光RT-PCR、套式PCR引物探针及反应体系表A.1
普通RT-PCR检测引物
扩增片断大小
正向引物（WNVEF)：5-GAAGATGATGAATATGGAGGC-3\反向引物（WNVER）：3-CATGTGTCAATGCTTCCTTTG-5表A.2
实时荧光RT-PCR检测引物探针
引物和探针序列
正向引物(TWNEF)：5*-GCGATCTCTCCACCAAAGCT-3”反向引物(TWNER)：3'-GGGTCAGCACGTTTGTCATTG-5Taqman探针(TWNEP):5-FTGCCCGACCATGGGAGAAGCTCP-3表A.3
套式RT-PCR检测引物
第一步：正向引物5*-ACCAACTACTGTGGAGTC-3反向引物：3\-CTACATCTCACCTTCATTTC-5第二步：正向引物：5*-GCCTTCATACACACTAAAG3”反向引物：3-CTAAGCCATTACATGCCA-5表A.4
RT-PCR缓冲液
硫酸镁
正义引物
反义引物
转录酶
DNA聚合酶
贮备液浓度
25mmol/L
2.5mmol/L
50μmol/1
50gμmol/1
5U/μL
RT-PCR反应体系
终浓度
1mmol/L
0.2mmol/L
1jimol/L
1 μmol/L
扩增片断大小
扩增片断大小
加样量
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DEPC水
总体积
RT-PCR缓冲液
硫酸镁
正义引物
反义引物
逆转录酶
DNA聚合酶
DEPC水
总体积
第一步
贮备液浓度
表A.4（续）
终浓度
实时荧光RT-PCR反应体系
贮备液浓度
25mmol/L
2.5mmol/L
25μmol/L
25 ymol/L
5U/μL
5U/μL
5μumol/L
终浓度
1mmol/L
0.2.mmol/L
1 μmol/1
1gmol/L
0.1μmol/L
套式RT-PCR反应体系
浓度/50μL（反应体系）
10mmol/LTris-HCI.pH8.3
50mmol/LKCl
2.0 mmol/L MgCl
0, 8 mmol/L dNTP
25UM-MLV逆转录酶
1.25URNase抑制剂
37.5pmol第一步正义引物
37.5pmol第一步反义引物
样品加样量2ML
第二步
加样量
加样量
10 mmol/LTris-HCl.pH8,3
50mmol/LKCl
2. 0 mmol/L MgCl,
0. 8 mmol/L dNTP
1. 25U Tag
37.5pmol第二步正义引物
37.5pmol第二步反义引物
样品加样量1.5μL(为第一步PCR反应产物）
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本标准规定了西尼罗病毒病临床诊断和实验室诊断。本标准适用于西尼罗病毒病病原及抗体的检测。2规范性引用文件
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下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3临床诊断
3. 1发病症状
人和马感染后，多数不出现症状，部分感染者发生伴有类似流感症状的西尼罗热，少量严重的病例出现高热、剧烈头痛、颈项强直、昏迷、抽搐等中枢神经系统体症，发生西尼罗脑炎，甚至死亡。3.2流行病学
西尼罗病毒（westnilevirus，WNV)为单链RNA病毒，属黄病毒科黄病毒属。病毒呈球形，基因组编码三种结构蛋白(C、prM和E蛋白)与七种非结构蛋白。西尼罗病毒在抗原性上与同属黄病毒的日本乙型脑炎病毒、圣路易斯脑炎病毒、Kunjin病毒、登革病毒相似，在血清学检测时，易产生交叉反应西尼罗病毒于1937年首次分离，经蚊媒传播可引起人类或动物的西尼罗热及西尼罗脑炎。类、马、人等哺乳动物都是易感动物。其中鸟类是主要的储存宿主。该病在20世纪50年代～90年代都曾有过流行，特别是20世纪90年代以后，流行区呈扩大趋势，范围遍及非洲、欧洲、中东、西亚、中亚、大洋洲和北美洲等广大地区。目前我国尚无该病流行的报道，但随着全球气候变暖，疫源地旅行传播以及生物媒介等潜在因素的存在，为西尼罗病毒的传播提供了可能。加之该病毒自前在我国周边国家如印度、俄罗斯南部、东南亚等国已有报道，我国人群普遍缺之对该病毒的免疫力，一且传入，将导致严重的公共卫生灾难。4实验室诊断
4.1西尼罗病毒RT-PCR、实时荧光RT-PCR检测及套式PCR检测4.1.1方法介绍
可以进行西尼罗病毒核酸检测。本标准提供的三种核酸检测方法可以根据具体情况选择采用。PCR试验的前处理操作可以在BSL-2实验室进行。在对人、活动物或户体进行取样时，采样人员应佩戴个人防护设施，穿戴防护衣，佩戴防护口罩、面罩、手套1
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4.1.2设备、材料和试剂
设备、材料
4.1.2.1.1PCR仪。
实时荧光PCR检测仪
4.1.2.1.2
3电泳仪。
4.1.2.1.3
4.1.2. 1.4
4.1.2.1.5
凝胶成像分析系统。
高速台式冷冻离心机。
6普通台式离心机。
4.1.2.1.6
匀浆器。
4.1.2.1.7
4.1.2. 1.8
微量可调移液器。此内容来自标准下载网
4.1.2.1.9无RNase的离心管，吸头和无RNase的玻璃容器4.1.2.2试剂
除特别说明以外，本标准所用试剂均为分析纯，所有试剂均用无RNase污染的容器（用DEPC水处理后高压灭菌)分装。试验用水应符合GB/T6682规定，4.1.2.2.1裂解液：Trizol或其他，4.1.2.2.2异丙醇。
4.1.2.2.3TaqDNA酶。
4.1.2.2.4
75%乙醇：用新开启的无水乙醇和DEPC水配制，一20℃预冷。5dNTP：含dATP.dTTP、dCTP、dGTP各10mmol/L。4.1.2.2.5
4.1.2.2.6
4. 1. 2. 2.7
逆转录酶。
DEPC水：用DEPC处理后的水。
4.1.2.2.850XTAE缓冲液。
4.1.3采样、送检和处理
人员样本菜集
4.1.3.1.1采集来自于疫区的人员、人境可疑人员、申请检验人员的血液。4.1.3.1.2采集怀疑死于西尼罗病人员的血液、脑髓液、组织样品，特别是脑组织和神经组织样品。4.1.3.2动物及产品样本采集
4.1.3.2.1采集来自疫区的活动物的血清4.1.3.2.2采集来自疫区的疑似感染的动物的脑、脊髓、其他组织样品，特别是神经组织样本。4.1.3.3禽鸟和蚊虫样本采集
4.1.3.3.1采集来自疫区的贸易鸟、禽类的血清4.1.3.3.2采集迁徒的鸟类血清。4.1.3.3.3采集来自疫区包装箱内的死鸟、死禽的脑、其他组织样本。4.1.3.3.4采集来自西尼罗疫区的藏匿于交通工具、运输设备中的蚊虫或以其他方式藏匿的蚊虫样本。特别是库蚊和饱血蚊虫
4.1.3.4来自西尼罗病毒病疫区的交通工具、运输设备的样本采集取样时将棉拭子用无菌PBS浸润后，在面积为5cm2×5cm区域内横直各擦拭10次，并不断转2
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换拭面，然后将拭子棉花端倾入装有pH7.2～7.4PBS液的试管中。4.1.3.5样本的送检和处理
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4.1.3.5.1
采样过程中样本不得交叉污染。样品采集后，放入密闭的塑料袋内，一个采样点的样品，放二个塑料袋，于保温箱中加冰、密封，送实验室。采集或处理的样本在2～8C条件下保存应不超过24h；若需长期保存，应放置一70℃冰箱，冻融不超过3次。4.1.3.5.2血清或血浆：用无菌注射器直接吸取至无菌离心管中，编号备用。4.1.3.5.3病毒培养物：用无菌滴管直接吸取至无菌离心管中，编号备用。4.1.3.5.4蚊体、神经或其他组织脏器：取待检样品2.0g置于匀浆器中.加人10mLPBS匀浆，然后将组织悬液转人离心管中3000r/min离心10min取上清液转入另一无菌离心管中，编号备用。4.1.3.5.5拭子：将装有拭子的试管在混旋仪上充分混旋提取，挤干拭子，取上清液。试管编号备用4.1.4操作步骤
引物和探针的设计
参见表A.1~表A.3。
4.1.4.2样本核酸提取
4.1.4.2.1在样本制备区进行。取n个灭菌的1.5mL离心管，其中n为被检样品数、一份阴性、一份阳性对照数量之和，对每管进行编号（阳性对照为DNA，无需此步骤）。4.1.4.2.2每管加入1mL裂解液，然后分别加入4.1.3.5处理后的被检样本、阴性对照、阳性对照各300μL，一份样本换用一个吸头，再加人200μL三氯甲烷，充分振荡均勾（如使用旋涡振荡器，避免振荡过于强烈产生乳化层）。在4℃条件下，12000r/min离心15min。4.1.4.2.3取与4.1.4.2.1中相同数量的1.5mL灭菌的离心管，加人400μL预冷的异内醇，将上步离心后样品及对照的上清液500L转移至相应的各管，避免吸到中间层，盖紧瓶盖，颠倒混均。-20℃冰箱静置30min。
4.1.4.2.412000r/min离心15min，轻轻倒去上清液，每管加人500μL75%乙醇，颠倒洗涤。4.1.4.2.512000r/min离心10min，轻轻倒去上清液，吸去残余液体，室温下干燥5min。4.1.4.2.6将抽提的RNA溶解在20μLDEPC水中待用4.1.4.3检测
4.1.4.3.1PCR反应体系
建议的三种PCR检测反应体系参见表A，4表A.6。每个样本设两个平行，每次反应应带阴性、阳性对照。可以采用两步法进行。4.1.4.3.2反应参数
4.1.4.3.2.1普通RT-PCR反应参数：42℃.60min；94℃.2min；94℃，20s,55℃,20，72℃，1min.35个循环；72℃.3min；25℃.15s.
4.1.4.3.2.2荧光RT-PCR反应参数：42℃.60min94℃，2min；94℃.15s，50℃，15s.72℃，30s，5个循环；94℃.15s.58℃，40s，40个循环（每个循环的第二步搜集荧光）。4.1.4.3.2.3套式PCR反应参数：3
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第步反应：70℃10min；45℃，45min；95℃，11min；95℃30s.55℃.45s72℃.60s.35个循环；72℃，5min；25℃，15s。第二步反应：95℃.30s，55℃，45s，72℃，60s.35个循环；72℃，5min25℃,15s.
4.1.4.3.3普通RT-PCR和套式PCR产物的电泳检测将50×TAE稀释成工作浓度，配制1.5%琼脂糖溶液，加热溶解，略为冷却后加人溴化乙锭储备液，使溴化乙锭的含量为0.5μg/mL，铺板。取10μLPCR反应产物，加2μL上样缓冲液，进行电泳。根据情况，选择恒定电流或恒定电压模式，当漠酚蓝迁移至接近凝胶末端三分之二处时，停止电泳。用凝胶成像系统记录结果。若发现条带的大小与阳性结果一致时，将PCR产物进行测序，再与数据库中序列进行比对。4.1.5结果判定
4.1.5.1普通RT-PCR结果判定
检测后，如果阴性对照和空白对照未出现条带，阳性对照出现预期大小扩增条带，样品未出现预期条带，则判定样品为阴性。
检测后，如果阴性对照和空白对照未出现条带，阳性对照和样品出现预期大小扩增条带，并且对样品的PCR产物进行测序分析，若证实与西尼罗病毒的核酸序列一致，则判定样品为阳性。反之，则判断为阴性。
4.1.5.2荧光RT-PCR结果判定
4.1.5.2.1总则
可以作为核酸检测的筛选试验。如要确诊，则需要进行普通RT-PCR试验并进行测序，或者其他相关试验完成。
4.1.5.2.2荧光RT-PCR结果分析条件设定直接读取检测结果。阅值设定原则根据仪器噪声情况进行调整，以阈值线刚好超过正常阴性样本扩增曲线的最高点为准。
4.1.5.2.3荧光RT-PCR质控标准
阴性对照无Ct值并且无扩增曲线阳性校准品应呈现出典型的阳性扩增曲线。如阴性对照和阳性校准品扩增曲线不满足以上条件，此次实验视为无效。4.1.5.2.4判定
当样品的Ct值大于或等于40.并且未出现扩增曲线，则判断为阴性。当样品的Ct值小于或等于30时，同时出现典型的扩增曲线，则判断为阳性当样品的Ct值大于30而小于40.并出现扩增曲线时，建议复检，复检后的Ct值仍然小于40，并出现扩增曲线，可判断为阳性。若Ct值大于40，则判断为阴性4.1.5.3套式RT-PCR结果判定
检测后，阴性对照和空白对照未出现条带，阳性对照在248bp出现扩增条带。如样品出现与阳性对照大小一致的扩增条带，则样品疑似阳性，通过对样品的PCR产物进行测序4
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分析，证实与数据库公布的西尼罗病毒的核酸序列一致，则判定样品为阳性。如样品出现的条带大小与阳性对照接近，则实验需从RNA提取开始重新进行，最终结果需通过测序最后判定。4.1.5.4结果描述
以西尼罗病毒核酸阴性或核酸阳性对结果进行描述4.2西尼罗病毒抗体捕捉ELISA检测4.2.1检测方法介绍
可以对西尼罗病毒抗体进行检测。4.2.2设备、材料和试剂
4.2.2.1酶标仪。
4.2.2.2洗板机。
4.2.2.3可调移液器。
包被缓冲液：0.01mol/L磷酸盐缓冲液，pH7.2，可根据试剂盒或具体方法的不同略有差异4.2.2.4
4.2.2.5稀释缓冲液或洗液（PBST）：0.01mol/L磷酸盐缓冲液，pH7.2，含0.05%Tween，可根据试剂盒或具体方法的不同略有差异。4.2.2.6
封闭缓冲液：以PBST配制的5%脱脂奶粉溶液，可根据试剂盒或具体方法的不同略有差异。显色液：ABTS（3-乙基苯并噻唑-6-磺酸），可以选择其他的底物。4.2.2.81
IgM抗体：根据检测对象（为人、马还是其他动物）不同而异WNV标准阳性血清：根据检测对象（为人、马还是其他动物）不同而异。4.2.2.9
4.2.2. 11
WNV标准阴性血清：根据检测对象（为人、马还是其他动物）不同而异。WNV病毒或标准抗原：根据检测对象（为人、马还是其他动物）不同而异。阴性对照抗原：根据检测对象（为人、马还是其他动物）不同而异4.2.2.131
HRP标记的黄病毒或WNV的单抗：根据检测对象（为人、马还是其他动物）不同而异。4.2.3采样、送检和处理
按4.1.3中有关血清采集的内容进行。4.2.4操作步骤
4.2.4.1在ELISA反应96板上包被经过稀释的IgM抗体（稀释度依据生产商或方法建立方提供的建议而确定），100μL/孔，在4℃湿盒中包被过夜。包被后的板可以存放数周。4.2.4.2以200μL/孔～300μL/孔的量，用PBST洗板3次～5次4.2.4.3加人封闭缓冲液，37℃下孵育60min。重复4.2.4.2。4.2.4.4用PBST稀释待检血清、WNV阳性血清、WNV阴性血清，稀释浓度依据方法和试剂盒可有差异。
4.2.4.5将稀释完成的血清以50μL/孔～100uL/孔加人到包被好的板中，37℃下作用1h～1.5h。每一样本应做复孔，共做4份复孔（在后面的步骤中，2孔加WNV标准抗原，2孔加阴性对照抗原）。4.2.4.6重复4.2.4.2。
4.2.4.7加人用PBST稀释好的病毒抗原及阴性对照抗原，每孔的加样量与血清加样量等同4.2.4.84℃湿盒中反应过夜
4.2.4.9重复4.2.4.2。
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4.2.4.10用PBST稀释HRP标记的黄病毒或WNV单抗（稀释度依据生产商或方法建立方提供的建议而确定），加人板中，加液量与血清及病毒加液量一致，37℃下作用1h。4.2.4.11重复4.2.4.2。
4.2.4.12每孔加入显色液.加液量与血清及病毒加液量一致，室温或37℃下作用30min。4.2.4.13加入1mol/L的硫酸终止反应。用酶标仪在405nm（根据底物）下测定OD值。4.2.5结果判定
待检样品的OD值（加WNV标准抗原）为阴性对照OD值的2倍或以上、并且为待检样品的OL值（加阴性对照抗原）的2倍或以上，判断为IgM捕获ELISA阳性。可采用等效的试剂盒方法或其他建立的ELISA方法中的判定标准判定，但事先应经过验证实验4.3蚀斑减少中和试验（PRN）
4.3.1方法介绍
可以对西尼罗病毒抗体进行检测。4.3.2设备、材料和试剂
4.3.2.1二氧化碳培养箱。
离心机。
4.3.2.3可调移液器。
4.3.2.4vero细胞。
vero细胞培养基：DMEM或MEM培养基。4.3.2.6月
胎牛血清。
培养基添加用抗生素（终浓度青链霉素100U/mL；链霉素100μg/mL）。无菌PBS（无钙、镁离子）。
0.25%胰酶-EDTA
细胞维持液：MEM培养基中添加4%的胎牛血清及双抗4.3.2.11
WNV标准毒株：用含10%豚鼠补体的培养基稀释到工作浓度。WNV阳性血清：根据检测对象（为人、马还是其他动物）不同而异。4.3.2.13
WNV阴性血清：根据检测对象（为人、马还是其他动物）不同而异。4.3.2.14
2%琼脂：配制后高压待用。
2X不含酚红的含Earles平衡盐的MEM维持液溶液。0.45%碳酸氢钠
溶液I：2X不含酚红的含Earle's平衡盐的MEM溶液十4%胎牛血清十双抗营养琼脂：等量预热的2%琼脂糖与溶液I混合而成，实验开始前新鲜配制。0.5%中性红溶液：pH7.4，高压或过滤除菌。覆盖琼脂：营养琼脂十中性红溶液（终浓度0.003%）。4.3.3美
采样、送检和处理
按4.1.3中有关血清采集的内容进行。4.3.4操作步骤
病毒培养
见4.4.3在70~80%细胞出现CPE后，反复冻融2次3次，-80℃备用。6
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4.3.4.2蚀斑形成单位(PFU)测定SN/T2868—2011
接种前用PBS冲洗细胞，弃冲洗液，然后接种。用细胞维持液以10倍量稀释病毒，共7个稀释度，接种于长满单层vero细胞的96孔培养板上，每个稀释度接种8孔，100uL/孔，对照组只加细胞维持液，在37℃二氧化碳孵箱中吸附1h～2h，每15min摇动一次，弃病毒液，并用PBS冲洗，弃液。以100uL/孔加人营养琼脂于上述培养板中，37℃二氧化碳培养箱中孵育3d～4d,再以100μL/孔加人覆盖琼脂，12h～24h后观察细胞病变，计算PFU（每毫升病毒原液的蚀斑数）。然后稀释100PFU50L的病毒工作液，稀释液含10%豚鼠补体。4.3.4.3蚀斑减少中和试验
被检血清试验前在56℃灭活30min。待检血清、标准阳性血清、标准阴性血清用细胞维持液做倍量稀释，稀释后体积50μL，加入等体积100PFU/50μL的病毒悬液，混勾，37℃作用1h～1.5h，然后将混合液接种到长满单层vero细胞的96孔培养板上，100uL/孔，每个稀释度接种5孔～8孔，于37℃二氧化碳培养箱中作用1h～2h，弃液，加入营养琼脂100μL/孔，37℃二氧化碳培养箱中孵育3d～4d，再以100μL/孔加人覆盖琼脂，12h～24h后观察细胞病变，计数蚀斑形成数量。4.3.5结果判定
待检样本中和效价大于1：10.判定为阳性。4.4西尼罗病毒分离
4.4.1方法介绍
可以对西尼罗病原进行分离。再通过其他实验对病原进行进一步鉴别。4.4.2设备、材料和试剂
4.4.2.1二氧化碳培养箱。
离心机。
可调移液器。
倒置显微镜
均质机、匀浆器、超声裂解器。4.4.2.5
细胞培养板。
滤器（0.45μm）。
vero细胞
vero细胞培养基：DMEM或MEM培养基胎牛血清。
细胞维持液，培养基中添加3%的胎牛血清及双抗培养基添加用双抗（终浓度青链霉素100U/mL；链霉素100μg/mL）。4.4.2. 13
无菌PBS(pH7.2～pH7.4无钙、镁离子）。4.4.2.14
0.25%胰酶-EDTA
采样、送检和处理
按4.1.3中有关内容进行
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采集样本后，应在24h内送达实验室进行检测。为保证分离效果，储存时应尽量保持在一80℃以下。在条件充许范围内尽可能保证在最低温度下运送样本血液样本直接冻融2次～3次，用含10%胎牛血清的PBS稀释10倍，3000r/min离心10min，上清液用滤器过滤后备用。
脑髓液样本用含10%胎牛血清的PBS稀释5倍～10倍，3000r/min离心10min，上清液用滤器过滤后备用。
用于病毒分离的组织样本需在预处理时，在PBS中加入10%的胎牛血清，初步粉碎后，冻融几次，用超声裂解仪裂解，上清液离心过滤后备用4.4.4操作步骤
将处理好的样本0.1mL接种到形成良好单层的Vero细胞的细胞培养板中，每个样本接种4孔，放置于37℃二氧化碳培养箱吸附1h，去除干预的样本，加人细胞维持液，继续放人37℃二氧化碳培养箱培养5d，每日观察细胞病变（CPE)，详细记录。4.4.5结果判定
若5d内未出现细胞病变，则收取培养物盲传3代继续培养观察，仍未出现CPE的样本，病毒分离判定为阴性。若出现典型的细胞病变，则进一步采用RT-PCR、ELISA或蚀斑减少中和等试验进行鉴定。
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附录A
（资料性附录）
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西尼罗病毒RT-PCR、实时荧光RT-PCR、套式PCR引物探针及反应体系表A.1
普通RT-PCR检测引物
扩增片断大小
正向引物（WNVEF)：5-GAAGATGATGAATATGGAGGC-3\反向引物（WNVER）：3-CATGTGTCAATGCTTCCTTTG-5表A.2
实时荧光RT-PCR检测引物探针
引物和探针序列
正向引物(TWNEF)：5*-GCGATCTCTCCACCAAAGCT-3”反向引物(TWNER)：3'-GGGTCAGCACGTTTGTCATTG-5Taqman探针(TWNEP):5-FTGCCCGACCATGGGAGAAGCTCP-3表A.3
套式RT-PCR检测引物
第一步：正向引物5*-ACCAACTACTGTGGAGTC-3反向引物：3\-CTACATCTCACCTTCATTTC-5第二步：正向引物：5*-GCCTTCATACACACTAAAG3”反向引物：3-CTAAGCCATTACATGCCA-5表A.4
RT-PCR缓冲液
硫酸镁
正义引物
反义引物
转录酶
DNA聚合酶
贮备液浓度
25mmol/L
2.5mmol/L
50μmol/1
50gμmol/1
5U/μL
RT-PCR反应体系
终浓度
1mmol/L
0.2mmol/L
1jimol/L
1 μmol/L
扩增片断大小
扩增片断大小
加样量
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DEPC水
总体积
RT-PCR缓冲液
硫酸镁
正义引物
反义引物
逆转录酶
DNA聚合酶
DEPC水
总体积
第一步
贮备液浓度
表A.4（续）
终浓度
实时荧光RT-PCR反应体系
贮备液浓度
25mmol/L
2.5mmol/L
25μmol/L
25 ymol/L
5U/μL
5U/μL
5μumol/L
终浓度
1mmol/L
0.2.mmol/L
1 μmol/1
1gmol/L
0.1μmol/L
套式RT-PCR反应体系
浓度/50μL（反应体系）
10mmol/LTris-HCI.pH8.3
50mmol/LKCl
2.0 mmol/L MgCl
0, 8 mmol/L dNTP
25UM-MLV逆转录酶
1.25URNase抑制剂
37.5pmol第一步正义引物
37.5pmol第一步反义引物
样品加样量2ML
第二步
加样量
加样量
10 mmol/LTris-HCl.pH8,3
50mmol/LKCl
2. 0 mmol/L MgCl,
0. 8 mmol/L dNTP
1. 25U Tag
37.5pmol第二步正义引物
37.5pmol第二步反义引物
样品加样量1.5μL(为第一步PCR反应产物）
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