SN/T 3306.5-2013 国境口岸环介导恒温扩增(LAMP)检测方法 第5部分:布鲁氏菌 SN/T3306.5-2013 标准压缩包解压密码：www.bzxz.net

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准$N/T 3306.5---2013
国境口岸环介导恒温扩增（LAMP）检测方法第5部分：布鲁氏菌
Loop-meciaterf isotkermal amplifiction detection method at fronticr port-.Part 5 : Bruceltosis
2013-03-01发布
2013-09-16实施
中华人民共和国
国家质量督检验检疫总局
SN/13306《国境口岸环介导恒温扩增（LAMP）检测方法》出分为：部分：—-…「部分·鼠疫杆菌
第2部分，产系至弧菌：
--—第3部分：志贺氏菌，
---第1部分·嗜肺军闭幽；
：第5部分布鲁民岗。
本部分为SN/T3306的第E部分。
本部分按照G3/11.二—-2005给出的则节SN/F3306.5—2013
请注意家文件的某些内容可能涉及专刹。本文件的发布机构不承扣识别这些专利的责任，有解分有国家认证认监督管现理委员会提出并归口。本部分起草单位，中华人民共和国上海出人境检验检疫局中国疾病颜防控制中心广州华峰生物科技有限公司，
本部分主起草人：陆晔、田桢、邱球、钩志英、章琪、李遇、方筠、李琥虹、何宁乎、李平、卢钟、王婷、间愿、以诚、杜止平、医狗。1范围
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国境口岸环介导恒温扩增（LAMP）检测方法第5部分：布鲁氏菌
SN/T3306的本部分规定了国境口岸检测布鲁低菌病疑似样本、不明物质等样品中布看氏菌的环介导组凝扩([AMP)法
本部分适用于国境口岸布書氏菌的筛选检测：2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的用文件，仪注日期的版本适用于本文件：凡是不注H期的引用文件，其最新版本（敏括所有的惨改草)适用本文件。GB/T 6682分析实验案用水规格和试验方法G1316885布鲁氏菌病监测标准
(GB1S89实验室生物安全通用要求WS/28C—2002临床诊断中聚合酶链反应(PCR)技术的廠用3缩略语
下列缩略语适用于本文件。
Bewaine：甜菜斌
Bst酶：BstDNA聚合（大片段）BstDNApolymerase(largefragrnent)）DNA：脱氧核糖核酸（eeoxyibonucleiracio）dNTF脱氧核苔三磷酸（(deoxyribonucleosidetripHosphareEDTA，乙兰歇四Z酸(ethyl&nediafnireitetraaceit acidyLAMP：环介导温扩增（loomedizted.isothierialamplificationTriton X-1o0:聚乙二醇辛基基
4生物安全措施
为了保护实验室人员的安全，应出通过生物安全培训并具备资质的工作人员检测布鲁氏菌，所有培养物和废弃物应参照GB1S489中的有关规定热行5防污染措施
防止污染措施应符合WS/T230-2002的规定。6技术処墓
振据布鲁氏菌的特异性序列基因设计特异性内引物、外引物各一对，作特异性识别靶序列上的独立1
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区域，利用Bs酶启动循坏链置换反应，在待异性基因序列启动元补链合成，在商一链上五补序列周雨复始形成有很多环的花蒙结构的莹·坏DNA混合物，从NTP析出的熊暇根离子与度应溶液卡的镁离子结合，产生副产物（焦磷酸镁），形成乳当色沉淀，可观查判渐结果：另加人核酸显色液，可灿察颜色变化判定结来。
7试剂和材判www.bzxz.net
除有持殊说期外，所有实验用试剂均为分析纯：实验用水符合GB/T6682中一级水的要求。7.1引物：有鲁氏菌检测用引物组，选取特异性的布鲁菌外膜蛋白25基因（OMP25）的序列.分析保守性，设计出能专一性鉴别布鲁氏菌的特片性引物组，该引物组出如下四条引物组放：外引物17.5 0 × ThcrmoPol 缓冲液: 含 200 nmol/L Tris-HCl(pH 8. 8), 100 mmcl/L 崇 钟漆液100 ol/L.硫酸铵溶液、25 mmol/ 硫酸镁溶液.1%T-1om X-1(007.6硫酸镁溶液：150 mmel/1.。7.7甜菜碱:5 ol/1.
7.8 显色液:液度为 1 0co×SYBR Green7.9阳性对照：可溯源的标雅菌株，载含封的片段的DNA亦可：7. 10 0. 2 1nL杆 1. 5 mE. 塑料离心管。 7.11
吸头.配套移液器使用.
8仪器和设备
8. 1移液幕:量程 0.5 μL~[0 μl.,量程 i3 ml.~100 rl..量程 [cc μL~1 000 μL8.2高速台武离心机：7000g：
8.3水浴锅或加热模块：65℃1℃和150℃土！℃8.4计时器。
9检测程序
在鲁民渐 LAMP检测程序见图 1 。2
10操作步骤
10.1样品制备、增菌培养
待测差品
前处后的样本、出择性增唑液、培募后的可疑菌袜细菌ENA提取
1.AMP支应
结巢飛察
传统方法谢认
图1布鲁氏菌LAMP检测程序
按（B16885逆行祥品制备和增菌。10.2模板DNA的制备
10.2.1总则
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参照WS/T230一2002小5.3中的原则制备检测慎板.可采用下述方法，也间使用等效的商品化DNA提取试剂盒，并H说明提取制备极DVA：提敢阳性对照:布鲁底菌基因组DNA。10.2.2前处理祥本模板DNA的制备刘于10.1获得的处理后样本沉采用如下方法制备模版DNA：沉淀中加人80u1.PNA提液，混勾后沸水浴10min，置冰上10min；于7G00多离心2nzin，上清液即为模板1VA，取上滑液置一20 ℃ 可保存 E个上备用。
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10.2.3增菌液模板DNA的制备
取1c.=获得的增菌液1L加到1.5ml.无菌离心管中，7000g离心2min，尽量吸弃t清液，再按照1G.2.2步骤制备模板DNA以得检测。10.2.4可疑菌落模板 DNA的制备对于1C.1分高到的可疑卤落，可点捞挑圾可疑菌路·再按照10.2.2步骤制备模板DNA以待检测。
10.3环介导恒温核酸扩增
10. 3. 1反应体系
布鲁民菌IAMP反成伦系见表1。
布鲁氏菌LAMP·反应体素
ThuesnoPol缓冲液
外侧游物（F3）
外侧下游引物（B3)
内谢L游引物(FIP)
内下游引物（BIP）
硫酸镔济液
Bst DAA 聚会酶
DNA漠板
去离子水
10. 3. 2 反应应过程
工作液浓度
1epmniyr
ienmai/
-o gmmolyi
isa.mmiolyi
反应体系终浓度
.2oi/L
U.2 μnol/L
t.6 μuul/l.
1.fμmol/l.
.. 6 mrrl/1.
0. 8 tcl/L
6 umol/L
0. 16 T1/μrL
按照表1所述配制反应体系;65℃恒温扩增60 min,80“C2 nin使酶失新·反应即结来。10.3.3空自对照、阴性对照、阳性对照设置每次反应应设置阴性对照、空自对照和阿性炫照。空白对照以无菌水代替DVA模板，阴性对照以DNA提取液代替DNA模板。10.4结果观察
在上述反应管中人2μI.显色藏.轻轻混匀并在黑色背急下观察。显色液优选为炙光染料SYERGreell
10.5结果判定
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在空向对照和阴性对照反应管液体为授色，阳性对照反应管液体呈缘免的条件下：引性结果：待检样品反应管液体皇绿色，该样品检验结果为初筛阳性，对烊品的增朗液威可疑纯菌落进步按GI316835中的操作步骤进行确认后报告结果。)
阴性结果：待检样品反应管液体呈橙色，卿间报告检验结果为阴性。
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