SN/T 3523-2013
基本信息
标准号： SN/T 3523-2013
中文名称：化学品 鱼类雌激素、雄激素和芳香酶抑制活性试验方法
标准类别：商检行业标准(SN)
标准状态：现行
出版语种：简体中文
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标准简介
SN/T 3523-2013 化学品 鱼类雌激素、雄激素和芳香酶抑制活性试验方法
SN/T3523-2013
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标准内容
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/I3524—2013
化学品
鱼类生殖毒性试验方法
Chemicals--Fish assay for the reprocluction foxicology2013-03-01发布
中华人民共和
压家质量监督检验俭疫总局
2013-09-16实施
1范围
术语和定义
3方法局限性说明
测试原理
测试可接受性标推
方法描述
6.1仪器
测试溶液
鱼的饲养
预暴露和鱼的选择
7测试设计
7.1--般说明
7.2测试浓度的选择
8，试验过程
受试血的选择与称量
暴露条件·
灯光和温度
分析检测和测量的频率
一般说明
行活率
行为和表观
繁殖力
鱼的人道处死，
第二性特征的观察
卵黄蛋白原（VTG）
性腺组织病理学评价
9数据和报告
采氏方差分析(ANO)VA)对生物标志物响应进行评价5.2
测试结累报告
10对于测试结果的解释和接受
SN/T3524—2013
SN/T3524—2013
附录A（资料性附录）卵黄蛋口原分析的样品收集的推荐程序附录（资料生附录）检测特定内分泌活性物质对黑头朵争和青的第一性特症的评估……附录C（资料性附录）争类内分泌筛选别试实验条件，附录』（资料性附录）斑马血和黑呆鱼的产卵基板附示E（资料性附录）可接受的稀释水的-·些化学特性附录F（资料性附录）卵黄雀白原加噪样品和分析方法间参比标准附录((资料性附录）
参考文献
统计分析流程·
本标准按照（B/T，12009给出的规则起草SN/T3524—2013
今标准参考「经济合作与发展组织（OrganizalicnLorLconomicCoopcrationalelDevelopmncnt，OECD)T(22s：鱼奖短期生殖毒性测试》(Fish ShortTermRepradurtionAssay)（荧文版）。本标连山国家认证认可监督管理委员会投出并妇丁本标准起草单位：中匡检验检疫科学布究院。本标淮十要起卢人:程拖、翟矮、陈会明谢文、马获SN/T35242013
环境水半的化学物质与内分秘系统相互作用，危言人类和野生动物，故需要发展和验证鱼类检测内分泌干挑活性物质的技术和方法。「598年，以1并始着下修订已有测试指南，并发展新的测试指南，以筛选和检测港在的内分泌「扰物。其中一项重要研究内容就是发展鱼类内分泌干扰测试方法指南。鱼炎怎蛎生殖毒性测试经过了广泛的验证试验，针对所选定的化学物质，在多个实验室问进行了方法相关件和可靠性分析测,试，所选定的化学物质通过各种机制包括内分泌式求影响鱼类繁殖[1二～[5二本测试指南（229)所有测试终点都已对黑头朵鱼进行了验证，一部分终点已对日本青（例如卵肯蛋白惊和第性征)和斑马鱼(例如卵黄蛋白原)逝行了验证。验证部分工作己由测试方法指南组国家调机均(tae Nationa.Coorainators cf ieTeil Guideline Progratme)指宗的专家组完成6-,其他豹验证工作由美国坏境保护忌[7_委托指定的专家同行评议。本测试并不识别荷尔蒙干扰的特定机制,因为受试动物拥有完整的下[i脑-并体-性腺(HPG)轴,会对影响HPG轴的物质,产牛不同程度的反应本测试方法挡述了种体内筛选测试方法，性成熟的雄值和处丁产卵期的雌鱼放在起，在其生命周期中暴籍于化学品没有限的时问（2），在21d淼露期结束时，根所用物种，在雄性和端性色1对-·种或两种生物标志物终点选行测试，作为测试化学物质内分泌活性指标，这些测试终点包括卵黄蛋白原和第二性特征。对黑头呆鱼、日本青和斑马鱼可逝行卵蛋白原测试，而第二性特征只能在黑头呆鱼知日本青上测试。此外在懿个测试过程中每天都要监测定量繁殖力；性腺需要保留，可能通过病理组织学来评估测试动物的生殖健康，也为其他测设终点提供克有力的证据。此生物测试作为特定内分泌-上扰模式的体内筛选测试，其应用叫在“（)ECD内分泌十扰化学物质测试和评价框渠\中寿到。在这个框架内，鱼类忽期牛殖测试提议为等级4，作为休内试验提供有关多种内分泌干扰机制的数据。
1范围
化学品，鱼类生殖毒性试验方法SN/T 3524—2013
本标准规定了化学品对鱼类生殖毒性试验方法的方法局限性说明、测试原理、测试可接受性标准，方法满述、测试设计，试验过程、数据和报告、对丁测试结果的解释和接受。本标准适用于化学品血类生殖毒送测试2术语和定义
下列术语和定义适用于本文件,
承载率loading rate
单位体积水的鱼的漩重。
承载密度slanckingdensity
单位沐积水的鱼的数目：
卵黄蛋白原vitellogenin,VTG
卵黄蛋白原是一种蛋黄蛋白的磷髓糖蛋白前2.4
般产生手所有卵生动物的性成熟惟体中，maximum lolerated cecentrationeMre最大耐受浓度
最大耐受浓度，代表大约「C的10%2.5
HPG 轴 hypothalamic-pituiiary-gomadal axis:下丘胶-垂体-性腺轴。
3方法局限性说明
3.1射黄蛋白原(Vitellogenin,VTG)通常受循环的小源性战激素的刺激,比雌性卵牛脊椎动物的肝脏产生，卵黄蛋白原是黄蛋白的前提，一口在肝脏中产生，出血流迹人哪巢，并被发育中的雌性的子吸收详改变。卵黄蛋白原在未成熟的雌性和雄性鱼的血浆中几乎检测不到,因为它们缺乏足够的循坏嵯激索,似是在受外源性的雌激素的刺激下，肝赃能够合成并分泌VTG.3.2VTG的测显能够检测不同雌激素作用模式的化学物质,对雌激素类化学物质的检测,有可能通过测量雌性鱼的卵黄蛋自原的产主，并己在科学同行文献中有大量报道_8_。也有证明表示卵黄蛋白原的产生也能由暴露于芳香化的雄激素引起（_9]和L二0」)。在惟性体小的雌激素循环水平的降低，如通过抑制转化内源性雄激素为天然雌激素[7β-惟二醇的片香酶;会引起卵黄蛋白原水半的降低,这一点被用来检测具有片香酶扩制性质的化学物质（11和|12），己经建立「卵莫蛋白原与雌激素/芳香酶抑制的响应的生物相关性，并已被大量文献所报道。然而，在雌性体内VTG 的产生有可能也会被系统性和非内分泌干扰毒性作用模型所影响，颌如肝毒性。1
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3.3已经成功建立并标谁化了几种常规的测量方法。包括采用免疫化学的物抑特另性的翁联免疫吸收分所(ELISA)方法，收集熙头呆鱼的血液，斑马鱼的血液或头/尾的勺浆，以及背竭的肝肚.作为VT(G视量的样品_3]二.9、对丁言够,在而被中测的 VT 与肝牛所测具有良好的相关性[2汀，翁录A提供了对于卵黄蛋白原分新的样品收某的挫行程序，卵黄蛋原可灭用不同的测量方法，但都得基于验运的物孙特导性I.ISA方法。3.4特定物种的雄性鱼的第一坐特征是外部可见的，与内源·生雄激素循环水显定量响虚性这些在黑头某血和青工能体现·但斑乃位没有体现,因为斑马鱼不县备川定量的第性特往。科学文献的讲究表明，这奖现像在熙头象鱼2和胃谢22上有体现，出于较低的统计学微力：对雄性鱼第二性特征的减弱的解释需要灿以小心·需要基丁专家判断和极重分析。对于斑马值的壶用应该有所限制，为它们缺乏雄激素活性物质反成的定量第二性特征。3.5对丁黑头呆鱼，外源受试物暴露的上要指示是位于雕血喙的婚垫，对丁青筛，乳突过程的数日绍成「雌性查的外源件暴露丁雄嫩素受试物的主要标志物，附录B分别说明了对二黑头呆鱼和青將的性转征评价的推荐过程。
3.6为期21的鱼类测试包括定量产那量和可选作的病理恰测所寄的性腺的保存。一些监管机构可能需要这类额外的终点，以对测试动物牛殖处康迟行定完整的评估，或若以防卵蛋白原和第一悼特征刘化学品暴露没有响应：虽然呆些终点可能被诊新烂高（例如，班性和惟性烂婚据形成会诱乐那黄蛋门原），并不是测鼠的所有终点（例如尘蜡力和性腺纠织病学)部倾向于有明确确认的特定的细胞行动机制，见外，对于某些终点,允许山可能的内分这干扰挑而逛行握断，从而为进一步的试提供指导。虽然不是特定的内分泌作用，击于对内分泌下犹江性物质表现出敏感性5，繁殖力是一个包含在内的重要的终点，因为当它和其他终点人受影响，能够更加硝定的是此受试物很可能不其有内分泌下扰活性。然而当繁婧力受到影顺，会对推论的证实微出重要顽献，本标准提供『过·步进行数据结果解释和测试结果可接变受性的措导：
4测试原理
4.1处于尘育期的楚性和雌性鱼,共同暴露十试验容器中。它们的成熟和生育状态能够保证理特征的而这分，闪出能够保证每个终点的性别关的分测试，保证针对外源性化学物质的敏感性。在测试结束时，性特征可由剪汀腹部解剂，对性腺的H测碎认，、和关的尘物检测的总结，见附录C，测试·-鼓由将处于产卵斯的鱼进行饲养开始；衰老的动物弃旧，刘对于鱼年龄和牛有状念的指南见鱼选祥部分。测誠分析采用三化学物质暴露平行以及个火空白对照，必要时可采用溶剂对照。对于言和斑马鱼，预处现时使用两个器而或重复样（每个幕二包指5个雄性私5个常性鱼），对于黑头呆负，预处现时使用四个器血或重复样：年个器而包括2个难性和4个雌性鱼），这是为了在保持分析的足够可行性的情记下，适应性黑以架鱼的领域行为，军露进行21d，在21d暴露时对于任进行取样。每人观测定量繁殖力
4.2在211取时，所有动物人处死。对丁黑头呆位和方进行第二性特征测量，兑附录B；对于斑马鱼和黑实朵鱼，收血液样品.测定卵黄蛋方原，对于医马鱼也能收架头/尾代替检测其小的卵荧蛋原，见附录A；对于肯谢，收集肝脏检测VTG，见别录A，将性腺整体或解剖后固定历案做可选的炳理学评估23_
5测试可接受性标泡
恨认下适用情况，测试结哭能接受：a）在暴露期结束时，水(或溶剂)对照的死率不超过10%;；2
b）暴露期间，溶解氧浓度不少二空气和值（ASV)的60头；SN/I 3524—2013
暴露期间同一时问点的试验容器的水温庞变化不超过=1.5，针刘测试物种保技在2℃识心
度变化范围为，见附表C；
d）有证据表明溶液中测！试物质浓度能够良好的保持在平均测量值的=20%内(）有证据表明所有平行样的鱼在化学暴露开始前，以及对照平行样在整个测诚期司，都只有产卵活性。
6 方法描述
6.1仪器
溶氧仪剂pH计,
6. 1.2水硬要计和水盘激计
6．.3度控制仪器+最作够准续蓝控6.1.4亿学情性材料器正.只在合适的适合推荐物种承载和饲养密度的休积，别附录（。6.1. 5黑头果鱼和斑可的卵底物，翁录。6. 1. 6合适精妄约天平(例如精确至1 0. 5 2mg)。6.2水
能够保证测试物种长时间存活和兰长的水能够压作测试用术，在测试期水质保持恒定：水的βII 值在 6. 5 --8. 5,但在给定的测i试期问应该在:一0. 5 pl1 值范用内为了误i=稀释水不会-不适当的影响测试结果（例如改变测试物质的外观）.分析叶取样应有间阿，重金属（如：C」、1b、2n,H、（d和Ni)，主要的期离子和阳离了:C-,Mg+a+,KT、-和 S-）、亲出剂（如:斯有的有机磷和所有的有机氯杀虫剂>和所有的有机碳和悬浮固体的测量，应采已的质量相对稳定内烯释水.每三H过行一次。如朱水质量已被证明在至少-年内保持稳定，测试频率能够诚少而增加州（如：6个片）。一些化毕物质的可接变的稀释水的特性列表见降录F6.3测试溶液
6.3.1所选撑浓度的测试溶液由储备获释释而成。储备液最好逆过使用机械方法如搅拌或照声波深解），将受试物简单的混合搅拌在稀择水中，泡和变（溶解）可用灭获得适当浓，度的诺备液。不推萃使用溶剂载体在是如要使用溶剂，则虚设置平行的溶剂对照目踏剂浓度应与化学处理组相间。对于非以溶解的物质：采用疮剂可能是技术角度最灯的解决方法：可参见（FC刀关于疑难物质和握合物水生毒性测试的指南文性2小。溶剂的选择山物质的化学性质嵌定。EC指南文件建议溶剂最高观察浓度为1001/1，但近来综述文章_25强调当使用溶齐迟行内分泌活性判试时，需要了起额外关注。因此建议在必妥的情况下：溶剂浓度最小化,满足技术可行性即叫（出测试物质的物理化学性质所决是）。
6.3.2采用流水式测试系统。这种系统连续的分散和稀释测试物质的循备液（：计量泵、比例泽器、绝和系统),以侵向试验容器提供一系列的液,。储备溶液的和稀释水的流速应每隔段时闻进行检查，最好足句天进行检香，在测试期间以及整个测试中变化不应超过为，成小心避免使用低档塑料管材或其他可能含生物活生物质的材浆。当选择沉水式系统的财料对，测试物质在这性材料上的可能的吸除作用应予以考虑，
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6.4鱼的饲养
6.4.1受试应从实验室群体色中选择，最好是从一个单独的群体中逆择，此群体在测试前应已在与测试所用的水危和照明条性相似的条性下至少适应肉周。注意加载速率和饲养密度需用丁使丑的测试物种.见附录（。
6.4.2经过48h的适减期.根据下列标润记录死率：在7d内祥体的死亡率大十10%：舍牟整群；a
b）群体死率在5%～10%:额外适应7±时间;好果死亡率在第二个7超过5%，舍弃整醛c）在7d内的群体死率小于5%：接受群体。6.4.3在适应期间、预暴露期间成者暴露期间，色不辑接受疾病治疗。6.5预暴露和鱼的选择
推荐采片1周～2周的预暴露期并深再与实际测试相似的容器，在整个饲养和暴露期间，准随意饲养。景露期采用米自提供繁殖成熟动物的实验室的性成熟的雌整成鱼（如：就黑头呆血和青而言，有清晰可见的第二性特征),活化产环。只是在一毅情况区(而不是狐立地考虑观测给定一红鱼的实际繁殖状态）头朵鱼应大约为20（上2周龄，假设它解包经在整个生命周期在25℃12℃进行了培养：日本青应大约为16（一2)周龄假设他们已经在懿个生命凰期在25℃十2℃进行？增养：斑马血应大约为16（12)周龄，假设他们已经在整个生命周期征：26.℃主2:C进行了培养。么与暴露期问每大评估产卵量。推荐在进人分板测试幂露阶段前在所有的乎行样中观察产卵情说。此阶段尚无法提供颈斯的每天产卵的定量观蔡操作指南，崛殿需要对每个物观察到平均产卵10个位。天）来用根据产卵情况的随机化封别设计来分布不同实验水半的平行样以确保平行样的平衡分有。7测试设计
7.1一般说明
7.1.1受试物的三个浓度，个参（水)以及（如果需要)一个溶剂对照：会在实验中用到。这些数据可以进行分析，以确定实组和对照组旗应之问的统计学显著性差异。这些分析能够提示对于不利影响进一步的长期测试（如存活率，发育、生长繁殖是否适扇于化学品测试，而不是用于风险评信26]。
7.1,2对丁斑马鱼和青,在实验第2过莱自每个试水苹和来白对照的雄性和雌性鱼（两个平行样,每个平行样5条雄性和5条雌性鱼),作为样品,用米测量卵黄蛋白原以及在使用的情况下测量第一性特行。对于黑头吴鱼，在暴露的第21d,雉性和雌生位（四个行样,每个平行栏2条雄性和4条雌性鱼）以及对照控制.作为样品用米测量卵黄蛋白原和第二性等征。需要对定量繁殖力进行评信.性腺组织成全部或原位固定以便在需要对作可选的病理学评古。7.2测试浓度的选择
7.2.1针对测试目的,最高测试浓度应由 MTC 决定,其中MTC 可来自于个摄寻范围,或米白其他的毒理数据，或10 mg/,或在水中的最人溶解度，这其中的最低悄：MTC定义为导致小于10%致死量的化学物质的最高测试浓度。使这种方法的前提是口前己有，·些经验的急性致死数船或其他毒性数据可以用米信算MTC，古算MT是不准确的.而Ⅱ通常需要一定的专业判断。7.2.2三个测试浓度浓度间距因子不超过0.并要求用丁稀降的水做参比（必要时采乃溶剂参比)摧荐深用间距去子准3.210。
8试验过程
受试鱼的选择与称量
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在试验开始时要尽最减少鱼的体重变化，这一点很重要。在此测试中建议使用的不同的物种的合适尺寸范围，见附录（，对丁测试中使用的整群的鱼，如果可能的话，在测试始时应保持雌性和睡性色的个体体互范围在同性别的算术平均体重20内，为厂估计乎沟体重，建议在测试前抽样测量样品色群的体章，
8.2暴露条件
8. 2. 1时间
在预暴露之后，测减时间为21d。推荐的预暴露时间为1周~2周。8.2.2饲养
8.2.2.1血的饲养采用适当的饲料见附录,在保持身体条件止常发方的速率下随意喉养。注意避免微牛物生长和水浑浊。作为一般准则，每关的定量可分成两份或三份多个等份饲料米遗行每天的多次喂养，何次喂养间隔至心3。也可以进行单欲较太的定量喂养，尤其在周末。在取样或厂检前12h应控制避食。
8.2.2.2对于喂鱼的饲料应进行污染物评占，如有机氯农药、多环芳烃（PAHs)、多氯联苯(PCJ3s），避免使用含有较高水平的植物雌激素的简粒，因为有可能导致已知的摊激素括抗剂（如17能二醇）分析的响应，
8.2.2.3未吃完的饲料和粪便应从试验容露巾理出去，每周至沙两次，例如采用吸管认真消理每个容器的底部
8.2.3灯光和温度
光照和水温应适合测试物种，参见附录C8.3分析检测和测量的频率
8.3.1在暴露期并始之前，应深证化学物质传递系绕的正嘴工作，斯有需案的分析方法都成己建立，包括化学物质在测试系统中的稳定性的充分认识。在测试潮间，受试物的浓度应定期测定，具体如下：稀释水和受试物储备液的流速最好得天检查，垒小每周检查两次.在整个测试期间不得超过10不。建议在测试开始时测量所有容器中的受试物的实际浓度，随启每周测试-次。8、3.2建议测试结果基丁测量浓度，但是如果溶液中受试物的浓度在测试期间,稳定保持在标称浓度的士20%之内、那么测试结果川基于计莫值或测量值，8.3.3样品可能需要进行过滤(例如使用0.45 m孔径)或离心。如果需要建议采用离心过程：但是如果测试材料不吸附到过滤，过滤器也可以接受。8.3.4在测试过程中,应至少每周测量次所有泌验容幕中的溶解氧、温度和PlI值。每周至少测量一次参比浓度和最高浓度试验容器巾的总硬度和值。最好至少在-个试验容器中进行温度的连续监测，
8.4观察
8.4.1一般说明
在分析过中或者分析结束时，对一比普通的（如：行活率）和宣要的生物响应（好卵奠蛋户原水乎）5
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进行评估，要求每天定量观测繁殖，8.4.2存活率
在测试期训应衔天观察鱼，记录死亡率，尽早移去掉的鱼，参比或试验容器中的死掉的鱼不应被取代。测试期训死掉的的性别适过肉喂观察性腺来确定。8.4.3行为和表观
8.4,3.1需要注意任何异常行为（相对于参比对照；这可能包括一般毒性的迹象，如强力呼破，不调游泳、失去平衡、非典静止或迟食，另外也需要注意外部异常（如：出血、变色），在效据解释时，需要仔纳考虑这些毒性表现，因为它们可能表明在此液度下：内分泌效应的生物标志物是不可靠的，这种行为观察也可以提供有用的定性信忌·告知浩在的在木来对鱼的测试要求，例如，黑头果色暴露丁瘫他素时·能观蔡到正常的虽性或雕性化的雌性鱼的领工致击忙；斑马鱼暴露于罐素或抗雄素后，其交配和在挪晓光照产卵的行为特行有所减少或抑制8.4.3.2由于外观（主要是颜》的蒸些方问可以随处埋变化很快，所以在从测试系统中移除受试鱼之前进行定性观察很重要。对于黑头呆鱼：已有的经验表月，一些内分论活性化学物质可能最初诱发以下外部特往的变化：体色(明或暗），着色模式(垂直带的存在)和体形(头部和胸部区或），因此在测试期司及测试结求时，需对鱼的物理外观进行观察。8.4.4繁殖力
衔天定量观测产助量，并基于重复样做记录。产卵量应记录为基于重复样的产所数量/存活的斓性/每天，每天从试验容器中移出卵，产卵基板应放在试验容器中，以便黑头朵崔和斑马鱼能够在正常条件下产卵。阴件给出了对丁斑马鱼和熙头呆鱼厚的产卵苯板的详绍信息。目本言不要求提供产卵基板。bzxZ.net
8.4.5鱼的人道处死
在第2l d,良1在暴露结束时，鱼,用适量的三卡因「三卡因中洗碘酸，Mctacain,MS-222(CA3号 886-86-2)实拖安乐死，l0cmg/L~500m/1,采月300mg/LNal1C0，缓洲(小办打，CAS号144-55-8)，以减少黏膜刺激;取血或绰织进行卵黄蛋台原检测，如附录A所示，8.2.6第二性特征的观察
些内分泌活性化学物质可诱发特定的第二性征的变化（雄性黑头果鱼垫的数日，雄性育乳头状突起)。侦得注意的是，特定作用模式的化学物质可能会导致动物异性的异常的第一性特征的发生，例如雄激素受体激活剂，如去甲雄三烯醇,甲睾酮和双氛晕酮,可能会导致雌性黑头呆位形成明显的婚垫或性育鳞形成乳头状突起(F二67「21和_22])），另有报道，碟激受体激活剂会减少婚垫数口和成年雄烂颈背背垫的尺（「27和287)，总体的形态学观察可以提供有用的定正和定量信息，告知浩在的在未来对鱼的测试要求。黑头吴鱼婚垫的数量和尺寸大小以及青的乳头状突起以百接量化或更切实的保存标木。黑头呆鱼和青的第二性特征评价雄荐程，见附录B，8.4.7卵黄蛋白原(VG)
8.4.7、1采用肛素钠润洗的微显血细胞比容毛细管或替代的差射器心脏穿刺技不,从尾动脉/静脉坡让。根据鱼的人小,对丁黑头呆鱼每条鱼收渠的血积--殷在5 ul～60 μL,斑马每条5 μ～15 μL：血浆从血液中通过离心分离，与蛋卢悔制齐一起在一80中储存，直至邪黄蛋卢原分析时。或者对下背可采用肝脏群品斑马鱼叫采用头/尾浆液，作为卵黄蛋白原测定的组织来源见附录A，VTC6
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的训量应基于已验证的相应的 ELISA方法,采用应的VIG标准和相应的抗体，推荐采用能够检测ng/mL血浆（或ng/mL组织）的VTG水平的方法，为这是术添露维鱼的本底水平8.4.7.2卵黄蛋白原分析的质量控制道过使用标准品，空白利至少重复分析样来达到。对驾～ELISA方法，都应进行基质效应试验（样品稀整效应）以确定最低样品稀释了：册来迹行VTC分析的ELTSA板包活一列质量控制样品：至少6个校准标准品，其浓度范围酒盖预期的卵黄蛋自原浓度·至少一个非特异生结含分析测试空样（一式芮份）。这些空白样的及光度应小于最高校准称准吸收的5%，至少对每个样品稀释液的两个笋份（重复祥）过行分析，重复样如朱差异大上20为，需晏童新分析，
8.4.7.3校准由线的相关系数（R）应人=3.99，但是，较高的析关性并不足以保证作所有范围内对浓支的准确预测。了有足够高的标准出线的相关性，从校准止线计算高来的每个标准的浓,女，成在标称浓度的7℃%～120%内。如果你称浓变趋势远离校谁回归线的追势（如：在低浓度），可能需要将校雅曲线分为低浓变和高浓度范用，或者采州非直线损型认充分拟合吸收数据。如果吨线分为两段，存没也线的R9.9
8.4.7.4检测限(1.OD)的定义为最低分析标准品的浓度.定量限（LOQ)的定义为最低分析标准品的淡度乘以最低稀释圈子
8.4.7.5每天进行别黄蛋广原的测试来用分析法问参比标准制最的骊样出成进行分析，弱录F。预期浓度与测盘浓度的比值将与当大逊行的每组测试结乐一起授告。8.4.8性腺组织病理学评价
蓝管部门可能要求进行性腺组织病理学议价，以研究花学品暴露后H轴的月标器写。必此性腺通过全身固冠或逛部后固定：当要求做病理组欲学评价时，特定的科腺内分泌相关的响应将作为测试物质内分泌活性的评古。这些诊断的响应基不上包括辈丸的母纪跑的存性，茎丸间质纪跑曾牛，降低的形度，增加精原细胞和滤泡增牛：具他性腺方面的损伤.如羽母细胞闭锁.晕丸性腹病变变形和阶段的变化，可能白不同的原因形。对鱼类性豚织病绿学的洋细反骤的指商将用上解部、固定、切片和腺组织病理学评价L231。
9数据和报告
9.1采用方差分析(ANOVA)对生物标志物响应进行评价在确定化学物质的潜在内分活生时，采用力差分析（ANOVA)对受试组和对照组之间的响应进行比较。如果使用了溶剂对照，对二衔个终点.在稀释水和溶剂对照之间进行逅当的统计检验，在随后的统计分析中，如何处理稀释水和对照溶剂的数据,相关指南可参见OED文件_2}二：所有的生物学响乐数据应按性别分开·分分析和报告。如果态数方法所要求的假设不能满足非正态分布（妇ShapiroWik’s测试)或多样性差异（Bartletts测试或l.eve:ne:s测试）,应考患在进行AVA前将数据转化为均一化差异，或逆行[权ANVA。多肃比较I>urnets测试（参数）或Maln-Whilney校正的131erro:测试(非参数可用于非单调剂最响应，如巢剂量-响应大致是单调的,可使用,H他统计检验（如JorcsheereTerpstra测诚或Williams测试）。录（提供了统计流程图.以帮尚确定使用的最适当的统计划试。额外的信息也可参见（EC工）关于当前生态毒性数抛统计分析方法的文件！29。9.2测试结果报告
测试设备：
2）负费人员及其研究责：
b）每个实验室应体现凹熟练使用各种代表性化学物质的能力：
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化学品
鱼类生殖毒性试验方法
Chemicals--Fish assay for the reprocluction foxicology2013-03-01发布
中华人民共和
压家质量监督检验俭疫总局
2013-09-16实施
1范围
术语和定义
3方法局限性说明
测试原理
测试可接受性标推
方法描述
6.1仪器
测试溶液
鱼的饲养
预暴露和鱼的选择
7测试设计
7.1--般说明
7.2测试浓度的选择
8，试验过程
受试血的选择与称量
暴露条件·
灯光和温度
分析检测和测量的频率
一般说明
行活率
行为和表观
繁殖力
鱼的人道处死，
第二性特征的观察
卵黄蛋白原（VTG）
性腺组织病理学评价
9数据和报告
采氏方差分析(ANO)VA)对生物标志物响应进行评价5.2
测试结累报告
10对于测试结果的解释和接受
SN/T3524—2013
SN/T3524—2013
附录A（资料性附录）卵黄蛋口原分析的样品收集的推荐程序附录（资料生附录）检测特定内分泌活性物质对黑头朵争和青的第一性特症的评估……附录C（资料性附录）争类内分泌筛选别试实验条件，附录』（资料性附录）斑马血和黑呆鱼的产卵基板附示E（资料性附录）可接受的稀释水的-·些化学特性附录F（资料性附录）卵黄雀白原加噪样品和分析方法间参比标准附录((资料性附录）
参考文献
统计分析流程·
本标准按照（B/T，12009给出的规则起草SN/T3524—2013
今标准参考「经济合作与发展组织（OrganizalicnLorLconomicCoopcrationalelDevelopmncnt，OECD)T(22s：鱼奖短期生殖毒性测试》(Fish ShortTermRepradurtionAssay)（荧文版）。本标连山国家认证认可监督管理委员会投出并妇丁本标准起草单位：中匡检验检疫科学布究院。本标淮十要起卢人:程拖、翟矮、陈会明谢文、马获SN/T35242013
环境水半的化学物质与内分秘系统相互作用，危言人类和野生动物，故需要发展和验证鱼类检测内分泌干挑活性物质的技术和方法。「598年，以1并始着下修订已有测试指南，并发展新的测试指南，以筛选和检测港在的内分泌「扰物。其中一项重要研究内容就是发展鱼类内分泌干扰测试方法指南。鱼炎怎蛎生殖毒性测试经过了广泛的验证试验，针对所选定的化学物质，在多个实验室问进行了方法相关件和可靠性分析测,试，所选定的化学物质通过各种机制包括内分泌式求影响鱼类繁殖[1二～[5二本测试指南（229)所有测试终点都已对黑头朵鱼进行了验证，一部分终点已对日本青（例如卵肯蛋白惊和第性征)和斑马鱼(例如卵黄蛋白原)逝行了验证。验证部分工作己由测试方法指南组国家调机均(tae Nationa.Coorainators cf ieTeil Guideline Progratme)指宗的专家组完成6-,其他豹验证工作由美国坏境保护忌[7_委托指定的专家同行评议。本测试并不识别荷尔蒙干扰的特定机制,因为受试动物拥有完整的下[i脑-并体-性腺(HPG)轴,会对影响HPG轴的物质,产牛不同程度的反应本测试方法挡述了种体内筛选测试方法，性成熟的雄值和处丁产卵期的雌鱼放在起，在其生命周期中暴籍于化学品没有限的时问（2），在21d淼露期结束时，根所用物种，在雄性和端性色1对-·种或两种生物标志物终点选行测试，作为测试化学物质内分泌活性指标，这些测试终点包括卵黄蛋白原和第二性特征。对黑头呆鱼、日本青和斑马鱼可逝行卵蛋白原测试，而第二性特征只能在黑头呆鱼知日本青上测试。此外在懿个测试过程中每天都要监测定量繁殖力；性腺需要保留，可能通过病理组织学来评估测试动物的生殖健康，也为其他测设终点提供克有力的证据。此生物测试作为特定内分泌-上扰模式的体内筛选测试，其应用叫在“（)ECD内分泌十扰化学物质测试和评价框渠\中寿到。在这个框架内，鱼类忽期牛殖测试提议为等级4，作为休内试验提供有关多种内分泌干扰机制的数据。
1范围
化学品，鱼类生殖毒性试验方法SN/T 3524—2013
本标准规定了化学品对鱼类生殖毒性试验方法的方法局限性说明、测试原理、测试可接受性标准，方法满述、测试设计，试验过程、数据和报告、对丁测试结果的解释和接受。本标准适用于化学品血类生殖毒送测试2术语和定义
下列术语和定义适用于本文件,
承载率loading rate
单位体积水的鱼的漩重。
承载密度slanckingdensity
单位沐积水的鱼的数目：
卵黄蛋白原vitellogenin,VTG
卵黄蛋白原是一种蛋黄蛋白的磷髓糖蛋白前2.4
般产生手所有卵生动物的性成熟惟体中，maximum lolerated cecentrationeMre最大耐受浓度
最大耐受浓度，代表大约「C的10%2.5
HPG 轴 hypothalamic-pituiiary-gomadal axis:下丘胶-垂体-性腺轴。
3方法局限性说明
3.1射黄蛋白原(Vitellogenin,VTG)通常受循环的小源性战激素的刺激,比雌性卵牛脊椎动物的肝脏产生，卵黄蛋白原是黄蛋白的前提，一口在肝脏中产生，出血流迹人哪巢，并被发育中的雌性的子吸收详改变。卵黄蛋白原在未成熟的雌性和雄性鱼的血浆中几乎检测不到,因为它们缺乏足够的循坏嵯激索,似是在受外源性的雌激素的刺激下，肝赃能够合成并分泌VTG.3.2VTG的测显能够检测不同雌激素作用模式的化学物质,对雌激素类化学物质的检测,有可能通过测量雌性鱼的卵黄蛋自原的产主，并己在科学同行文献中有大量报道_8_。也有证明表示卵黄蛋白原的产生也能由暴露于芳香化的雄激素引起（_9]和L二0」)。在惟性体小的雌激素循环水平的降低，如通过抑制转化内源性雄激素为天然雌激素[7β-惟二醇的片香酶;会引起卵黄蛋白原水半的降低,这一点被用来检测具有片香酶扩制性质的化学物质（11和|12），己经建立「卵莫蛋白原与雌激素/芳香酶抑制的响应的生物相关性，并已被大量文献所报道。然而，在雌性体内VTG 的产生有可能也会被系统性和非内分泌干扰毒性作用模型所影响，颌如肝毒性。1
SN/T 3524—2013
3.3已经成功建立并标谁化了几种常规的测量方法。包括采用免疫化学的物抑特另性的翁联免疫吸收分所(ELISA)方法，收集熙头呆鱼的血液，斑马鱼的血液或头/尾的勺浆，以及背竭的肝肚.作为VT(G视量的样品_3]二.9、对丁言够,在而被中测的 VT 与肝牛所测具有良好的相关性[2汀，翁录A提供了对于卵黄蛋白原分新的样品收某的挫行程序，卵黄蛋原可灭用不同的测量方法，但都得基于验运的物孙特导性I.ISA方法。3.4特定物种的雄性鱼的第一坐特征是外部可见的，与内源·生雄激素循环水显定量响虚性这些在黑头某血和青工能体现·但斑乃位没有体现,因为斑马鱼不县备川定量的第性特往。科学文献的讲究表明，这奖现像在熙头象鱼2和胃谢22上有体现，出于较低的统计学微力：对雄性鱼第二性特征的减弱的解释需要灿以小心·需要基丁专家判断和极重分析。对于斑马值的壶用应该有所限制，为它们缺乏雄激素活性物质反成的定量第二性特征。3.5对丁黑头呆鱼，外源受试物暴露的上要指示是位于雕血喙的婚垫，对丁青筛，乳突过程的数日绍成「雌性查的外源件暴露丁雄嫩素受试物的主要标志物，附录B分别说明了对二黑头呆鱼和青將的性转征评价的推荐过程。
3.6为期21的鱼类测试包括定量产那量和可选作的病理恰测所寄的性腺的保存。一些监管机构可能需要这类额外的终点，以对测试动物牛殖处康迟行定完整的评估，或若以防卵蛋白原和第一悼特征刘化学品暴露没有响应：虽然呆些终点可能被诊新烂高（例如，班性和惟性烂婚据形成会诱乐那黄蛋门原），并不是测鼠的所有终点（例如尘蜡力和性腺纠织病学)部倾向于有明确确认的特定的细胞行动机制，见外，对于某些终点,允许山可能的内分这干扰挑而逛行握断，从而为进一步的试提供指导。虽然不是特定的内分泌作用，击于对内分泌下犹江性物质表现出敏感性5，繁殖力是一个包含在内的重要的终点，因为当它和其他终点人受影响，能够更加硝定的是此受试物很可能不其有内分泌下扰活性。然而当繁婧力受到影顺，会对推论的证实微出重要顽献，本标准提供『过·步进行数据结果解释和测试结果可接变受性的措导：
4测试原理
4.1处于尘育期的楚性和雌性鱼,共同暴露十试验容器中。它们的成熟和生育状态能够保证理特征的而这分，闪出能够保证每个终点的性别关的分测试，保证针对外源性化学物质的敏感性。在测试结束时，性特征可由剪汀腹部解剂，对性腺的H测碎认，、和关的尘物检测的总结，见附录C，测试·-鼓由将处于产卵斯的鱼进行饲养开始；衰老的动物弃旧，刘对于鱼年龄和牛有状念的指南见鱼选祥部分。测誠分析采用三化学物质暴露平行以及个火空白对照，必要时可采用溶剂对照。对于言和斑马鱼，预处现时使用两个器而或重复样（每个幕二包指5个雄性私5个常性鱼），对于黑头呆负，预处现时使用四个器血或重复样：年个器而包括2个难性和4个雌性鱼），这是为了在保持分析的足够可行性的情记下，适应性黑以架鱼的领域行为，军露进行21d，在21d暴露时对于任进行取样。每人观测定量繁殖力
4.2在211取时，所有动物人处死。对丁黑头呆位和方进行第二性特征测量，兑附录B；对于斑马鱼和黑实朵鱼，收血液样品.测定卵黄蛋方原，对于医马鱼也能收架头/尾代替检测其小的卵荧蛋原，见附录A；对于肯谢，收集肝脏检测VTG，见别录A，将性腺整体或解剖后固定历案做可选的炳理学评估23_
5测试可接受性标泡
恨认下适用情况，测试结哭能接受：a）在暴露期结束时，水(或溶剂)对照的死率不超过10%;；2
b）暴露期间，溶解氧浓度不少二空气和值（ASV)的60头；SN/I 3524—2013
暴露期间同一时问点的试验容器的水温庞变化不超过=1.5，针刘测试物种保技在2℃识心
度变化范围为，见附表C；
d）有证据表明溶液中测！试物质浓度能够良好的保持在平均测量值的=20%内(）有证据表明所有平行样的鱼在化学暴露开始前，以及对照平行样在整个测诚期司，都只有产卵活性。
6 方法描述
6.1仪器
溶氧仪剂pH计,
6. 1.2水硬要计和水盘激计
6．.3度控制仪器+最作够准续蓝控6.1.4亿学情性材料器正.只在合适的适合推荐物种承载和饲养密度的休积，别附录（。6.1. 5黑头果鱼和斑可的卵底物，翁录。6. 1. 6合适精妄约天平(例如精确至1 0. 5 2mg)。6.2水
能够保证测试物种长时间存活和兰长的水能够压作测试用术，在测试期水质保持恒定：水的βII 值在 6. 5 --8. 5,但在给定的测i试期问应该在:一0. 5 pl1 值范用内为了误i=稀释水不会-不适当的影响测试结果（例如改变测试物质的外观）.分析叶取样应有间阿，重金属（如：C」、1b、2n,H、（d和Ni)，主要的期离子和阳离了:C-,Mg+a+,KT、-和 S-）、亲出剂（如:斯有的有机磷和所有的有机氯杀虫剂>和所有的有机碳和悬浮固体的测量，应采已的质量相对稳定内烯释水.每三H过行一次。如朱水质量已被证明在至少-年内保持稳定，测试频率能够诚少而增加州（如：6个片）。一些化毕物质的可接变的稀释水的特性列表见降录F6.3测试溶液
6.3.1所选撑浓度的测试溶液由储备获释释而成。储备液最好逆过使用机械方法如搅拌或照声波深解），将受试物简单的混合搅拌在稀择水中，泡和变（溶解）可用灭获得适当浓，度的诺备液。不推萃使用溶剂载体在是如要使用溶剂，则虚设置平行的溶剂对照目踏剂浓度应与化学处理组相间。对于非以溶解的物质：采用疮剂可能是技术角度最灯的解决方法：可参见（FC刀关于疑难物质和握合物水生毒性测试的指南文性2小。溶剂的选择山物质的化学性质嵌定。EC指南文件建议溶剂最高观察浓度为1001/1，但近来综述文章_25强调当使用溶齐迟行内分泌活性判试时，需要了起额外关注。因此建议在必妥的情况下：溶剂浓度最小化,满足技术可行性即叫（出测试物质的物理化学性质所决是）。
6.3.2采用流水式测试系统。这种系统连续的分散和稀释测试物质的循备液（：计量泵、比例泽器、绝和系统),以侵向试验容器提供一系列的液,。储备溶液的和稀释水的流速应每隔段时闻进行检查，最好足句天进行检香，在测试期间以及整个测试中变化不应超过为，成小心避免使用低档塑料管材或其他可能含生物活生物质的材浆。当选择沉水式系统的财料对，测试物质在这性材料上的可能的吸除作用应予以考虑，
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6.4鱼的饲养
6.4.1受试应从实验室群体色中选择，最好是从一个单独的群体中逆择，此群体在测试前应已在与测试所用的水危和照明条性相似的条性下至少适应肉周。注意加载速率和饲养密度需用丁使丑的测试物种.见附录（。
6.4.2经过48h的适减期.根据下列标润记录死率：在7d内祥体的死亡率大十10%：舍牟整群；a
b）群体死率在5%～10%:额外适应7±时间;好果死亡率在第二个7超过5%，舍弃整醛c）在7d内的群体死率小于5%：接受群体。6.4.3在适应期间、预暴露期间成者暴露期间，色不辑接受疾病治疗。6.5预暴露和鱼的选择
推荐采片1周～2周的预暴露期并深再与实际测试相似的容器，在整个饲养和暴露期间，准随意饲养。景露期采用米自提供繁殖成熟动物的实验室的性成熟的雌整成鱼（如：就黑头呆血和青而言，有清晰可见的第二性特征),活化产环。只是在一毅情况区(而不是狐立地考虑观测给定一红鱼的实际繁殖状态）头朵鱼应大约为20（上2周龄，假设它解包经在整个生命周期在25℃12℃进行了培养：日本青应大约为16（一2)周龄假设他们已经在懿个生命凰期在25℃十2℃进行？增养：斑马血应大约为16（12)周龄，假设他们已经在整个生命周期征：26.℃主2:C进行了培养。么与暴露期问每大评估产卵量。推荐在进人分板测试幂露阶段前在所有的乎行样中观察产卵情说。此阶段尚无法提供颈斯的每天产卵的定量观蔡操作指南，崛殿需要对每个物观察到平均产卵10个位。天）来用根据产卵情况的随机化封别设计来分布不同实验水半的平行样以确保平行样的平衡分有。7测试设计
7.1一般说明
7.1.1受试物的三个浓度，个参（水)以及（如果需要)一个溶剂对照：会在实验中用到。这些数据可以进行分析，以确定实组和对照组旗应之问的统计学显著性差异。这些分析能够提示对于不利影响进一步的长期测试（如存活率，发育、生长繁殖是否适扇于化学品测试，而不是用于风险评信26]。
7.1,2对丁斑马鱼和青,在实验第2过莱自每个试水苹和来白对照的雄性和雌性鱼（两个平行样,每个平行样5条雄性和5条雌性鱼),作为样品,用米测量卵黄蛋白原以及在使用的情况下测量第一性特行。对于黑头吴鱼，在暴露的第21d,雉性和雌生位（四个行样,每个平行栏2条雄性和4条雌性鱼）以及对照控制.作为样品用米测量卵黄蛋白原和第二性等征。需要对定量繁殖力进行评信.性腺组织成全部或原位固定以便在需要对作可选的病理学评古。7.2测试浓度的选择
7.2.1针对测试目的,最高测试浓度应由 MTC 决定,其中MTC 可来自于个摄寻范围,或米白其他的毒理数据，或10 mg/,或在水中的最人溶解度，这其中的最低悄：MTC定义为导致小于10%致死量的化学物质的最高测试浓度。使这种方法的前提是口前己有，·些经验的急性致死数船或其他毒性数据可以用米信算MTC，古算MT是不准确的.而Ⅱ通常需要一定的专业判断。7.2.2三个测试浓度浓度间距因子不超过0.并要求用丁稀降的水做参比（必要时采乃溶剂参比)摧荐深用间距去子准3.210。
8试验过程
受试鱼的选择与称量
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在试验开始时要尽最减少鱼的体重变化，这一点很重要。在此测试中建议使用的不同的物种的合适尺寸范围，见附录（，对丁测试中使用的整群的鱼，如果可能的话，在测试始时应保持雌性和睡性色的个体体互范围在同性别的算术平均体重20内，为厂估计乎沟体重，建议在测试前抽样测量样品色群的体章，
8.2暴露条件
8. 2. 1时间
在预暴露之后，测减时间为21d。推荐的预暴露时间为1周~2周。8.2.2饲养
8.2.2.1血的饲养采用适当的饲料见附录,在保持身体条件止常发方的速率下随意喉养。注意避免微牛物生长和水浑浊。作为一般准则，每关的定量可分成两份或三份多个等份饲料米遗行每天的多次喂养，何次喂养间隔至心3。也可以进行单欲较太的定量喂养，尤其在周末。在取样或厂检前12h应控制避食。
8.2.2.2对于喂鱼的饲料应进行污染物评占，如有机氯农药、多环芳烃（PAHs)、多氯联苯(PCJ3s），避免使用含有较高水平的植物雌激素的简粒，因为有可能导致已知的摊激素括抗剂（如17能二醇）分析的响应，
8.2.2.3未吃完的饲料和粪便应从试验容露巾理出去，每周至沙两次，例如采用吸管认真消理每个容器的底部
8.2.3灯光和温度
光照和水温应适合测试物种，参见附录C8.3分析检测和测量的频率
8.3.1在暴露期并始之前，应深证化学物质传递系绕的正嘴工作，斯有需案的分析方法都成己建立，包括化学物质在测试系统中的稳定性的充分认识。在测试潮间，受试物的浓度应定期测定，具体如下：稀释水和受试物储备液的流速最好得天检查，垒小每周检查两次.在整个测试期间不得超过10不。建议在测试开始时测量所有容器中的受试物的实际浓度，随启每周测试-次。8、3.2建议测试结果基丁测量浓度，但是如果溶液中受试物的浓度在测试期间,稳定保持在标称浓度的士20%之内、那么测试结果川基于计莫值或测量值，8.3.3样品可能需要进行过滤(例如使用0.45 m孔径)或离心。如果需要建议采用离心过程：但是如果测试材料不吸附到过滤，过滤器也可以接受。8.3.4在测试过程中,应至少每周测量次所有泌验容幕中的溶解氧、温度和PlI值。每周至少测量一次参比浓度和最高浓度试验容器巾的总硬度和值。最好至少在-个试验容器中进行温度的连续监测，
8.4观察
8.4.1一般说明
在分析过中或者分析结束时，对一比普通的（如：行活率）和宣要的生物响应（好卵奠蛋户原水乎）5
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进行评估，要求每天定量观测繁殖，8.4.2存活率
在测试期训应衔天观察鱼，记录死亡率，尽早移去掉的鱼，参比或试验容器中的死掉的鱼不应被取代。测试期训死掉的的性别适过肉喂观察性腺来确定。8.4.3行为和表观
8.4,3.1需要注意任何异常行为（相对于参比对照；这可能包括一般毒性的迹象，如强力呼破，不调游泳、失去平衡、非典静止或迟食，另外也需要注意外部异常（如：出血、变色），在效据解释时，需要仔纳考虑这些毒性表现，因为它们可能表明在此液度下：内分泌效应的生物标志物是不可靠的，这种行为观察也可以提供有用的定性信忌·告知浩在的在木来对鱼的测试要求，例如，黑头果色暴露丁瘫他素时·能观蔡到正常的虽性或雕性化的雌性鱼的领工致击忙；斑马鱼暴露于罐素或抗雄素后，其交配和在挪晓光照产卵的行为特行有所减少或抑制8.4.3.2由于外观（主要是颜》的蒸些方问可以随处埋变化很快，所以在从测试系统中移除受试鱼之前进行定性观察很重要。对于黑头呆鱼：已有的经验表月，一些内分论活性化学物质可能最初诱发以下外部特往的变化：体色(明或暗），着色模式(垂直带的存在)和体形(头部和胸部区或），因此在测试期司及测试结求时，需对鱼的物理外观进行观察。8.4.4繁殖力
衔天定量观测产助量，并基于重复样做记录。产卵量应记录为基于重复样的产所数量/存活的斓性/每天，每天从试验容器中移出卵，产卵基板应放在试验容器中，以便黑头朵崔和斑马鱼能够在正常条件下产卵。阴件给出了对丁斑马鱼和熙头呆鱼厚的产卵苯板的详绍信息。目本言不要求提供产卵基板。bzxZ.net
8.4.5鱼的人道处死
在第2l d,良1在暴露结束时，鱼,用适量的三卡因「三卡因中洗碘酸，Mctacain,MS-222(CA3号 886-86-2)实拖安乐死，l0cmg/L~500m/1,采月300mg/LNal1C0，缓洲(小办打，CAS号144-55-8)，以减少黏膜刺激;取血或绰织进行卵黄蛋台原检测，如附录A所示，8.2.6第二性特征的观察
些内分泌活性化学物质可诱发特定的第二性征的变化（雄性黑头果鱼垫的数日，雄性育乳头状突起)。侦得注意的是，特定作用模式的化学物质可能会导致动物异性的异常的第一性特征的发生，例如雄激素受体激活剂，如去甲雄三烯醇,甲睾酮和双氛晕酮,可能会导致雌性黑头呆位形成明显的婚垫或性育鳞形成乳头状突起(F二67「21和_22])），另有报道，碟激受体激活剂会减少婚垫数口和成年雄烂颈背背垫的尺（「27和287)，总体的形态学观察可以提供有用的定正和定量信息，告知浩在的在未来对鱼的测试要求。黑头吴鱼婚垫的数量和尺寸大小以及青的乳头状突起以百接量化或更切实的保存标木。黑头呆鱼和青的第二性特征评价雄荐程，见附录B，8.4.7卵黄蛋白原(VG)
8.4.7、1采用肛素钠润洗的微显血细胞比容毛细管或替代的差射器心脏穿刺技不,从尾动脉/静脉坡让。根据鱼的人小,对丁黑头呆鱼每条鱼收渠的血积--殷在5 ul～60 μL,斑马每条5 μ～15 μL：血浆从血液中通过离心分离，与蛋卢悔制齐一起在一80中储存，直至邪黄蛋卢原分析时。或者对下背可采用肝脏群品斑马鱼叫采用头/尾浆液，作为卵黄蛋白原测定的组织来源见附录A，VTC6
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的训量应基于已验证的相应的 ELISA方法,采用应的VIG标准和相应的抗体，推荐采用能够检测ng/mL血浆（或ng/mL组织）的VTG水平的方法，为这是术添露维鱼的本底水平8.4.7.2卵黄蛋白原分析的质量控制道过使用标准品，空白利至少重复分析样来达到。对驾～ELISA方法，都应进行基质效应试验（样品稀整效应）以确定最低样品稀释了：册来迹行VTC分析的ELTSA板包活一列质量控制样品：至少6个校准标准品，其浓度范围酒盖预期的卵黄蛋自原浓度·至少一个非特异生结含分析测试空样（一式芮份）。这些空白样的及光度应小于最高校准称准吸收的5%，至少对每个样品稀释液的两个笋份（重复祥）过行分析，重复样如朱差异大上20为，需晏童新分析，
8.4.7.3校准由线的相关系数（R）应人=3.99，但是，较高的析关性并不足以保证作所有范围内对浓支的准确预测。了有足够高的标准出线的相关性，从校准止线计算高来的每个标准的浓,女，成在标称浓度的7℃%～120%内。如果你称浓变趋势远离校谁回归线的追势（如：在低浓度），可能需要将校雅曲线分为低浓变和高浓度范用，或者采州非直线损型认充分拟合吸收数据。如果吨线分为两段，存没也线的R9.9
8.4.7.4检测限(1.OD)的定义为最低分析标准品的浓度.定量限（LOQ)的定义为最低分析标准品的淡度乘以最低稀释圈子
8.4.7.5每天进行别黄蛋广原的测试来用分析法问参比标准制最的骊样出成进行分析，弱录F。预期浓度与测盘浓度的比值将与当大逊行的每组测试结乐一起授告。8.4.8性腺组织病理学评价
蓝管部门可能要求进行性腺组织病理学议价，以研究花学品暴露后H轴的月标器写。必此性腺通过全身固冠或逛部后固定：当要求做病理组欲学评价时，特定的科腺内分泌相关的响应将作为测试物质内分泌活性的评古。这些诊断的响应基不上包括辈丸的母纪跑的存性，茎丸间质纪跑曾牛，降低的形度，增加精原细胞和滤泡增牛：具他性腺方面的损伤.如羽母细胞闭锁.晕丸性腹病变变形和阶段的变化，可能白不同的原因形。对鱼类性豚织病绿学的洋细反骤的指商将用上解部、固定、切片和腺组织病理学评价L231。
9数据和报告
9.1采用方差分析(ANOVA)对生物标志物响应进行评价在确定化学物质的潜在内分活生时，采用力差分析（ANOVA)对受试组和对照组之间的响应进行比较。如果使用了溶剂对照，对二衔个终点.在稀释水和溶剂对照之间进行逅当的统计检验，在随后的统计分析中，如何处理稀释水和对照溶剂的数据,相关指南可参见OED文件_2}二：所有的生物学响乐数据应按性别分开·分分析和报告。如果态数方法所要求的假设不能满足非正态分布（妇ShapiroWik’s测试)或多样性差异（Bartletts测试或l.eve:ne:s测试）,应考患在进行AVA前将数据转化为均一化差异，或逆行[权ANVA。多肃比较I>urnets测试（参数）或Maln-Whilney校正的131erro:测试(非参数可用于非单调剂最响应，如巢剂量-响应大致是单调的,可使用,H他统计检验（如JorcsheereTerpstra测诚或Williams测试）。录（提供了统计流程图.以帮尚确定使用的最适当的统计划试。额外的信息也可参见（EC工）关于当前生态毒性数抛统计分析方法的文件！29。9.2测试结果报告
测试设备：
2）负费人员及其研究责：
b）每个实验室应体现凹熟练使用各种代表性化学物质的能力：
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