SN/T 1632.3-2013
基本信息
标准号： SN/T 1632.3-2013
中文名称：出口奶粉中阪崎肠杆菌(克罗诺杆菌属)检验方法 第3部分:荧光PCR方法
标准类别：商检行业标准(SN)
标准状态：现行
出版语种：简体中文
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标准分类号
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出版信息
相关单位信息
标准简介
SN/T 1632.3-2013 出口奶粉中阪崎肠杆菌(克罗诺杆菌属)检验方法 第3部分:荧光PCR方法
SN/T1632.3-2013
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标准内容
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 1632.3—2013
代替SN/T1632.3—2005
出口奶粉中阪崎肠杆菌（克罗诺杆菌属）检验方法第3部分：荧光PCR方法Determination of Enterobacter sakazakii(Cronobacter spp.)from dehydratedpowdered milk for export-Part 3: Real-time PCR method2013-11-06发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2014-06-01实施
SN/T 1632.3—2013
SN/T1632《出口奶粉中阪崎肠杆菌（克罗诺杆菌属）检验方法》共分为3个部分：第1部分：分离与计数；
第2部分：PCR方法；
第3部分：荧光PCR方法。
本部分为SN/T1632的第3部分。
本部分依照GB/T1.12009给出的规则起草。本部分代替SN/T1632.3—2005《奶粉中阪崎肠杆菌检验方法第3部分：荧光PCR方法》。本部分与SN/T1632.3一2005相比，除编辑性修改外，主要技术变化如下：修改了标准的中英文名称；
修改了引物和探针；
删除了定义、术语和缩略语；
增加了克罗诺杆菌属内种的分型鉴别方法的资料性附录。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国深圳出入境检验检疫局、中华人民共和国天津出人境检验检疫局。
本部分主要起草人：赵贵明、王、吕敬章、陈颖、杨海荣、赵勇胜、高旗利、张霞、刘培。本部分所代替标准的历次版本发布情况为：SN/T1632.3—2005。
1范围
出口奶粉中阪崎肠杆菌（克罗诺杆菌属）检验方法第3部分：荧光PCR方法SN/T1632.3—2013
SN/T1632的本部分规定了奶粉中阪崎肠杆菌（克罗诺杆菌属）的荧光PCR检测方法。本部分适用手奶粉中版崎肠杆菌（克罗诺杆菌属）的快速定性检测，其他食品可参照执行2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。SN/T1632.1出口奶粉中阪崎肠杆菌（克罗诺杆菌属）检验方法：第1部分：分离与计数SN/T1632.22013出口奶粉中阪崎肠杆菌（克罗诺杆菌属）检验方法第2部分：PCR方法3测定方法
3.1方法提要
奶粉经增菌后，取增菌液1mL加到1.5mL无菌离心管中，以8000r/min的转速离心5min，轻轻倒去上清液，倒置于吸水纸上，吸干液体，不同样品应在吸水纸不同地方吸干；加入50μILDNA提取液（使用前室温解冻并充分混匀，快速吸取），混勾后沸水浴5min，以12000r/min的转速离心5min，取上清液作为模板进行荧光PCR扩增·观察荧光PCR仪的实时曲线，从而对奶粉中的阪崎肠杆菌（克罗诺杆菌属)进行快速检测。
3.2试剂和材料
见SN/T1632.1。除另有规定外，试剂为分析纯或生化试剂.水为灭菌双蒸水3.2.1引物：
5'-GGCGAGCGGCGAATATTAT-3
5-CGGGTTTTCCCAGTTGAGATC-3
3.2.2探针：
5'-FAM-CACCAGTTTTCGGTGCGCCAGC-BHQ-3'3.2.3EaTaqDNA聚合酶。
3.2.4dNTPs:dATP、dTTP、dCTP、dGTP。3.2.5DNA提取试剂：0.1%Chelex100（螯合树脂）水溶液。3.2.610×PCR缓冲液：200mmol/LTris-HCl(pH8.4），200mmol/L氯化钾，15mmol/L氯化镁。FastSartUniversalProbeMaster(2X)。3.2.7
阪崎肠杆菌（克罗诺杆菌属）质控菌株：ATCC29544，或等效菌株。3.2.9免费标准下载网bzxz
仪器和设备。
荧光PCR仪。
SN/T 1632.3—2013
离心机：20000r/min。
3.2.12移液器：10μL、100μL、200μL、1000μL3.2.13水浴锅。
3.3操作步骤（流程见附录A）
3.3.1前增菌和增菌
取检样100g加人已预热至45℃装有900mL灭菌水的锥形瓶中，振摇使样品充分溶解，36℃士1℃C培养18h～22h。移取1mL转种于10mL改良月桂基硫酸盐胰蛋白陈肉汤中（MLST，见SN/T1632.22013中A.1).36C±1℃培养18h22h。3.3.2模板DNA准备
每瓶培养的MLST分别取1mL加到1.5mL无菌离心管中，8000r/min离心5min，轻轻倒去上清液，倒置于吸水纸上，吸干液体，不同样品应在吸水纸不同地方吸干；加人50uLDNA提取液（使用前室温解冻并充分混匀.快速吸取）.混匀后沸水浴5min，12000r/min离心5min，取上清液以待检验（如不能及时检验，可将上清液于一20℃保存）。也可使用其他经验证的DNA提取方法。3.3.3荧光PCR检测
反应体系总体积为25μL.其中含：上游引物和下游引物（10μmol/L）各0.4μL、FastSartUniversalProbeMaster（2X）12.5μL、探针（10μmol/L）0.2μL、模板DNA2μL.ddH,O补齐至25μL。反应步骤：反应步骤一，95℃10min；反应步骤二，95℃5s，55℃退火20s，同时收集荧光信号.共进行40个循环。反应产物可在4℃保存。检测过程中要设阳性对照、阴性对照和空白对照。分别接种阪崎肠杆菌和大肠杆菌到10mLNB中，36℃土1℃过夜培养，各取1.5mL增菌液，离心.提取DNA模板。阪崎肠杆菌DNA模板作阳性对照，大肠杆菌DNA模板作阴性对照，空白对照以无菌水作为模板，加样量与样品加样量一致。
4结果与报告
4.1检测样本C，值小于或等于35.0时.报告阪崎肠杆菌（克罗诺杆菌属）筛选阳性；检测样本C值大于35.0且小于40.0时，重复一次，如果C，值仍小于40.0，且曲线有明显的对数增长期.可报告阪崎肠杆菌（克罗诺杆菌属）筛选阳性，否则报告阪崎肠杆菌（克罗诺杆菌属）未检出；样本检测不到C.值时，报告阪崎肠杆菌（克罗诺杆菌属）未检出。4.2筛选阳性的样本按SN/T1632.1进行确证，必要时参考附录B方法，进一步区分到种4.3报告每100g样品中检出或未检出阪崎肠杆菌（克罗诺杆菌属）。2
附录A
（规范性附录）
荧光PCR检测方法程序
样1001菌然罐水00mm.
36 '±17:,18 h--22 h
[1ml.+10ml.改良月杜苯硫腰盐胰蛋白陈肉激(M-1l.ST肉汤]36c11 t, 18 h --22 h
荧光PC:R检测
克罗诺朴菌显件培养芽
SN/T1632.3—2013
36±,t8h--22h
化人豆蛋琼脂-板(TS.4)
25 : =1,48 h-72 h
氧化悔试验，芊兰氏染件，牛化鉴延程序图
SN/T1632.3-—2013
附录B
（资料性附录）
克罗诺杆菌属内种的分型鉴别方法B.1测试样品基因组DNA的制备
实验菌株纯培养物经36℃24h增菌后，取增菌液1mL加到1.5mL无菌离心管中，以8000r/min的转速离心5min，轻轻倒去上清液，倒置于吸水纸上，吸干液体，不同样品应在吸水纸不同地方吸干：加入50LDNA提取液（使用前室温解冻并充分混匀，快速吸取），混匀后沸水浴5min，以12000r/min的转速离心5min，取上清液作为模板。B.2引物
引物见表B.1。
表B.1克罗诺杆菌recN基因引物
基因名称
B.3聚合酶链式反应
引物序列（5-3°）
F:CTGGCACAATTAACCATCAGTAA
R:TGGGTAACGCACATCACCTGAGT
扩增片段长度/bp
采用表B.1中的引物对检测样品DNA进行PCR扩增。25μLPCR反应体系中，10XPCRbuffen（含Mg+）2.5μLdNTPs(各2.5mol/L)1.0μL，ExTaqDNApolymerase(5U/μL）0.2μL.上下游引物（10μmol/L）各0.5μL，DNA模板2.0μL，加灭菌ddH，O至25μL。PCR循环反应参数为.95℃预变性5min，95℃变性30s，55℃30s.72℃延伸2min30个循环；循环完成后72℃.10min充分延伸，4℃保存。
B.4产物鉴定及测序
配制2%琼脂糖凝胶，取5uμLPCR产物加溴酚蓝混匀，加人合适的DNA分子量标记物，根据电泳槽的长度设定合适的电压进行电泳。凝胶经GelRed染色后，用凝胶成像系统成像，分析PCR反应结果.然后将阳性PCR产物纯化，送至上海生工进行克隆测序。B.5聚类分析
将测序结果拼接后，选取其中的1662bp进行多序列比对，用Mega4.0进行聚类分析。同时以GeneBank上已经公布的克罗诺杆菌属不同种的renN基因序列作为阳性参考：C.dublinensis(EU569474),C.genomospecies1（EU569479)，C.muytjensii（EU569492),C.turicensis（EU569523)C.sakazakii（EU569522）、C.malonaticus（EU569491）。4
B.6结果判定
SN/T1632.3—2013
聚类分析中，将测序结果拼接后，用Lasergene软件选择其中最长的一个ORF1662bp（从起始密码子ATG开始到终止密码子结束），或与参考序列C.dublinensis（EU569474）等比对，截取等长的片段1662bp，与GeneBank中的参考序列进行blast比对，同源性天于97%时，可判断为同一种菌。5
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代替SN/T1632.3—2005
出口奶粉中阪崎肠杆菌（克罗诺杆菌属）检验方法第3部分：荧光PCR方法Determination of Enterobacter sakazakii(Cronobacter spp.)from dehydratedpowdered milk for export-Part 3: Real-time PCR method2013-11-06发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2014-06-01实施
SN/T 1632.3—2013
SN/T1632《出口奶粉中阪崎肠杆菌（克罗诺杆菌属）检验方法》共分为3个部分：第1部分：分离与计数；
第2部分：PCR方法；
第3部分：荧光PCR方法。
本部分为SN/T1632的第3部分。
本部分依照GB/T1.12009给出的规则起草。本部分代替SN/T1632.3—2005《奶粉中阪崎肠杆菌检验方法第3部分：荧光PCR方法》。本部分与SN/T1632.3一2005相比，除编辑性修改外，主要技术变化如下：修改了标准的中英文名称；
修改了引物和探针；
删除了定义、术语和缩略语；
增加了克罗诺杆菌属内种的分型鉴别方法的资料性附录。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国深圳出入境检验检疫局、中华人民共和国天津出人境检验检疫局。
本部分主要起草人：赵贵明、王、吕敬章、陈颖、杨海荣、赵勇胜、高旗利、张霞、刘培。本部分所代替标准的历次版本发布情况为：SN/T1632.3—2005。
1范围
出口奶粉中阪崎肠杆菌（克罗诺杆菌属）检验方法第3部分：荧光PCR方法SN/T1632.3—2013
SN/T1632的本部分规定了奶粉中阪崎肠杆菌（克罗诺杆菌属）的荧光PCR检测方法。本部分适用手奶粉中版崎肠杆菌（克罗诺杆菌属）的快速定性检测，其他食品可参照执行2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。SN/T1632.1出口奶粉中阪崎肠杆菌（克罗诺杆菌属）检验方法：第1部分：分离与计数SN/T1632.22013出口奶粉中阪崎肠杆菌（克罗诺杆菌属）检验方法第2部分：PCR方法3测定方法
3.1方法提要
奶粉经增菌后，取增菌液1mL加到1.5mL无菌离心管中，以8000r/min的转速离心5min，轻轻倒去上清液，倒置于吸水纸上，吸干液体，不同样品应在吸水纸不同地方吸干；加入50μILDNA提取液（使用前室温解冻并充分混匀，快速吸取），混勾后沸水浴5min，以12000r/min的转速离心5min，取上清液作为模板进行荧光PCR扩增·观察荧光PCR仪的实时曲线，从而对奶粉中的阪崎肠杆菌（克罗诺杆菌属)进行快速检测。
3.2试剂和材料
见SN/T1632.1。除另有规定外，试剂为分析纯或生化试剂.水为灭菌双蒸水3.2.1引物：
5'-GGCGAGCGGCGAATATTAT-3
5-CGGGTTTTCCCAGTTGAGATC-3
3.2.2探针：
5'-FAM-CACCAGTTTTCGGTGCGCCAGC-BHQ-3'3.2.3EaTaqDNA聚合酶。
3.2.4dNTPs:dATP、dTTP、dCTP、dGTP。3.2.5DNA提取试剂：0.1%Chelex100（螯合树脂）水溶液。3.2.610×PCR缓冲液：200mmol/LTris-HCl(pH8.4），200mmol/L氯化钾，15mmol/L氯化镁。FastSartUniversalProbeMaster(2X)。3.2.7
阪崎肠杆菌（克罗诺杆菌属）质控菌株：ATCC29544，或等效菌株。3.2.9免费标准下载网bzxz
仪器和设备。
荧光PCR仪。
SN/T 1632.3—2013
离心机：20000r/min。
3.2.12移液器：10μL、100μL、200μL、1000μL3.2.13水浴锅。
3.3操作步骤（流程见附录A）
3.3.1前增菌和增菌
取检样100g加人已预热至45℃装有900mL灭菌水的锥形瓶中，振摇使样品充分溶解，36℃士1℃C培养18h～22h。移取1mL转种于10mL改良月桂基硫酸盐胰蛋白陈肉汤中（MLST，见SN/T1632.22013中A.1).36C±1℃培养18h22h。3.3.2模板DNA准备
每瓶培养的MLST分别取1mL加到1.5mL无菌离心管中，8000r/min离心5min，轻轻倒去上清液，倒置于吸水纸上，吸干液体，不同样品应在吸水纸不同地方吸干；加人50uLDNA提取液（使用前室温解冻并充分混匀.快速吸取）.混匀后沸水浴5min，12000r/min离心5min，取上清液以待检验（如不能及时检验，可将上清液于一20℃保存）。也可使用其他经验证的DNA提取方法。3.3.3荧光PCR检测
反应体系总体积为25μL.其中含：上游引物和下游引物（10μmol/L）各0.4μL、FastSartUniversalProbeMaster（2X）12.5μL、探针（10μmol/L）0.2μL、模板DNA2μL.ddH,O补齐至25μL。反应步骤：反应步骤一，95℃10min；反应步骤二，95℃5s，55℃退火20s，同时收集荧光信号.共进行40个循环。反应产物可在4℃保存。检测过程中要设阳性对照、阴性对照和空白对照。分别接种阪崎肠杆菌和大肠杆菌到10mLNB中，36℃土1℃过夜培养，各取1.5mL增菌液，离心.提取DNA模板。阪崎肠杆菌DNA模板作阳性对照，大肠杆菌DNA模板作阴性对照，空白对照以无菌水作为模板，加样量与样品加样量一致。
4结果与报告
4.1检测样本C，值小于或等于35.0时.报告阪崎肠杆菌（克罗诺杆菌属）筛选阳性；检测样本C值大于35.0且小于40.0时，重复一次，如果C，值仍小于40.0，且曲线有明显的对数增长期.可报告阪崎肠杆菌（克罗诺杆菌属）筛选阳性，否则报告阪崎肠杆菌（克罗诺杆菌属）未检出；样本检测不到C.值时，报告阪崎肠杆菌（克罗诺杆菌属）未检出。4.2筛选阳性的样本按SN/T1632.1进行确证，必要时参考附录B方法，进一步区分到种4.3报告每100g样品中检出或未检出阪崎肠杆菌（克罗诺杆菌属）。2
附录A
（规范性附录）
荧光PCR检测方法程序
样1001菌然罐水00mm.
36 '±17:,18 h--22 h
[1ml.+10ml.改良月杜苯硫腰盐胰蛋白陈肉激(M-1l.ST肉汤]36c11 t, 18 h --22 h
荧光PC:R检测
克罗诺朴菌显件培养芽
SN/T1632.3—2013
36±,t8h--22h
化人豆蛋琼脂-板(TS.4)
25 : =1,48 h-72 h
氧化悔试验，芊兰氏染件，牛化鉴延程序图
SN/T1632.3-—2013
附录B
（资料性附录）
克罗诺杆菌属内种的分型鉴别方法B.1测试样品基因组DNA的制备
实验菌株纯培养物经36℃24h增菌后，取增菌液1mL加到1.5mL无菌离心管中，以8000r/min的转速离心5min，轻轻倒去上清液，倒置于吸水纸上，吸干液体，不同样品应在吸水纸不同地方吸干：加入50LDNA提取液（使用前室温解冻并充分混匀，快速吸取），混匀后沸水浴5min，以12000r/min的转速离心5min，取上清液作为模板。B.2引物
引物见表B.1。
表B.1克罗诺杆菌recN基因引物
基因名称
B.3聚合酶链式反应
引物序列（5-3°）
F:CTGGCACAATTAACCATCAGTAA
R:TGGGTAACGCACATCACCTGAGT
扩增片段长度/bp
采用表B.1中的引物对检测样品DNA进行PCR扩增。25μLPCR反应体系中，10XPCRbuffen（含Mg+）2.5μLdNTPs(各2.5mol/L)1.0μL，ExTaqDNApolymerase(5U/μL）0.2μL.上下游引物（10μmol/L）各0.5μL，DNA模板2.0μL，加灭菌ddH，O至25μL。PCR循环反应参数为.95℃预变性5min，95℃变性30s，55℃30s.72℃延伸2min30个循环；循环完成后72℃.10min充分延伸，4℃保存。
B.4产物鉴定及测序
配制2%琼脂糖凝胶，取5uμLPCR产物加溴酚蓝混匀，加人合适的DNA分子量标记物，根据电泳槽的长度设定合适的电压进行电泳。凝胶经GelRed染色后，用凝胶成像系统成像，分析PCR反应结果.然后将阳性PCR产物纯化，送至上海生工进行克隆测序。B.5聚类分析
将测序结果拼接后，选取其中的1662bp进行多序列比对，用Mega4.0进行聚类分析。同时以GeneBank上已经公布的克罗诺杆菌属不同种的renN基因序列作为阳性参考：C.dublinensis(EU569474),C.genomospecies1（EU569479)，C.muytjensii（EU569492),C.turicensis（EU569523)C.sakazakii（EU569522）、C.malonaticus（EU569491）。4
B.6结果判定
SN/T1632.3—2013
聚类分析中，将测序结果拼接后，用Lasergene软件选择其中最长的一个ORF1662bp（从起始密码子ATG开始到终止密码子结束），或与参考序列C.dublinensis（EU569474）等比对，截取等长的片段1662bp，与GeneBank中的参考序列进行blast比对，同源性天于97%时，可判断为同一种菌。5
小提示：此标准内容仅展示完整标准里的部分截取内容，若需要完整标准请到上方自行免费下载完整标准文档。