SN/T 0331-2013
基本信息
标准号： SN/T 0331-2013
中文名称：出口畜产品中炭疽杆菌检验方法
标准类别：商检行业标准(SN)
标准状态：现行
出版语种：简体中文
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标准分类号
关联标准
出版信息
相关单位信息
标准简介
SN/T 0331-2013 出口畜产品中炭疽杆菌检验方法
SN/T0331-2013
标准压缩包解压密码：www.bzxz.net
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标准内容
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 0331—2013
代替SN0331-1994
出口畜产品中炭疽杆菌检验方法Method for the inspection of bacillus anthrax in animal by-products for export2013-11-06发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2014-06-01实施
本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准代替SN0331-—1994《出口畜产品中炭疽杆菌检验方法》。本标准与SN0331一1994相比，主要技术性变化如下：删除了大豆凝集素吸收实验、噬菌体裂解试验，申珠实验和动物实验：一增加了莱膜染色、Ascoli反应和聚合酵链反应（PCR）试验本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国内蒙古出人境检验检疫局。本标准主要起草人：王海艳、散威华、赵治国、赵林立、郭铁筝、冯永胜。本标准所代替标准的历次版本发布情况为：SN0331-1994。
SN/T0331-2013
1范围
出口畜产品中炭疽杆菌检验方法本标准规定了出口畜产品中炭疽杆菌的检验。SN/T0331-2013
本标准适用于出口繁、毛、绒、野生动物毛皮、生骨粒及其他畜产品中炭疽杆菌的检验。2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB19489实验室生物安全通用要求3生物安全
炭疽为人畜共患病，试验环境和防护要求按照GB19489执行。4培养基和试剂
无菌脱纤绵羊血（或马血）。
炭疽沉淀素标准抗原。
炭疽沉淀素阳性血清。
炭疽沉淀素阴性血清。
0.7%碳酸氢钠营养琼脂平板：见附录A中A.1。4.6
普通营养肉汤：见A.2。
普通营养琼脂平板：见A.3。
戊烷咪多粘菌素琼脂平板：见A.4。PLET琼脂平板：见A.5。
碱性美蓝染色液：见A.6。
革兰氏染色液：见A.7。
洗样液：见A.8。
0.5%石炭酸生理盐水：见A.9。
电泳级琼脂糖粉。
TagDNA聚合酶：5U/μL。
100bpDNAladderMarker（脱氧核糖核酸分子量标准）。10倍浓度TagDNA聚合酶缓冲液（10xTapBuffer）：15mmol/LMgCl。4.17
4.18dNTP混合物：脱氧腺三磷酸（dATP）、脱氟胸苷三磷酸（dTTP）、脱氧鸟苷三磷酸（dGTP）、脱氧胞皆三磷酸（dCTP）各2.5mmol/L。4.1950XTAE电泳缓冲液：见A.10。4.206×加样缓冲液：见A.11
SN/T0331-2013
漠化乙绽溶液：见A，12
5设备和材料
恒温培养箱
三氧化碳培养箱
恒温水浴箱，
生物显微镜
Ascoli反应管（小试管，内直径约o.5cm左右），5.5
高压火灭菌器。
微量加样器。
高速冷冻离心机。
水平凝胶电泳槽、
电泳仪。
凝胶成像系统。
6细菌学检测
6.1抽样
黎、毛、绒和生骨粒
按生产日期或原料来源划分批次，每批按30%开包（箱）抽样或在扎包（装箱）时由每包（箱）各取一份样品。无菌从每包（箱）的不同部位共抽样/3一5名，装进灭菌的棉布袋内，将袋口扎紧·作上批次标记。将样品装人塑料袋或铁简内，密封后送样6.1.2动物皮张
应逐张取样，用灭菌棉拭于涂擦样皮的真皮面，将棉拭子插人试管，塞紧棉塞。将试管逐支用纸包囊，装入铁简内，再用棉花或纸填充空隙，密封后送样。6.2样品处理
6.2.1聚、毛、绒和生骨粒
6.2.1.1可以根据样品多少，将适合数量的同批样品（最多不超过10份）合编为一个检验样品单位，作好记录。从合编为一个检验样品单位的每个样品袋中各取1g～2g样品，一起放人一个适当大小的灭菌三角瓶中
6.2.1.2加样品量30~40倍（质量体积）的预冷洗样液于三角瓶中用灭菌瓶塞将瓶口塞严，将三角瓶冰水浴或0~4℃箱内，间或摇动约1h6.2.1.3将瓶中洗样被倒人500mL灭菌离心管中，盖住管口，以3000/min高心20min弃去上清液，加少许灭菌水，使沉淀均匀悬浮。将离心管静置5min10min，待杂质下沉后，将上悬液移人另一支灭菌试管内，于65℃恒温水浴加热30min6.2.1.4加洗样液后的样品于热处理前如不能及时检验，应贮存于0℃～4℃冰箱内.以防芽孢发芽。2
6.2.2动物皮张
SN/T0331-—2013
动物皮张的棉技子涂抹样品，如不能及时检验，应建存手0℃～4℃冰箱内，以防芽孢发芽。6.3检验方法
6.3.1平板接种
6.3.1.1、毛、绒和生骨粒
按6.2处理后的紫、毛、绒和生骨粒样品悬液，根据每管所包括样品份数之多少，各接种1～3个PLET琼脂平板或戊烷滕多粘菌素平板接种时用灭菌吸管吸取样品，滴加于平板表面，各O.1mL~0.3mL。如有剩余样品，可增接数个平板，直至将样品接种完用灭菌L型玻璃棒将滴加的样液涂布均匀。如样液较多，可将平板置于37℃温箱，微开Ⅲ盖，使样液迅速干燥。翻转平血，置于37℃恒温箱，培养48h~72h
6.3.1.2动物皮张
动物皮张的棉拭子涂抹样品，将棉拭子由试管内取出，各涂抹一个PLET琼脂平板或戊烷胖多粘菌素平板。翻转平Ⅲ.置于37℃恒温箱培养24h~48h。6.3.1.3菌落及菌形观察
炭疽杆菌菌落扁平、暗灰色、不透明、无光泽、表面粗糙、边缘不整齐。用放大镜观察，边缘卷发状用接种针接触，有粘滞感，挑之可拉起长丝。挑取可疑菌落按照6.3.2、6.3.3、6.3.4的方法进行鉴定。6.3.2营养肉汤培养
取琼脂平板上的典型菌落接种营养肉汤，于37℃培养5b12H。炭疽杆菌在肉汤中生长的初期特征是肉汤上部意清，无菌膜，下部有絮状沉淀，沉淀不易摇散6.3.3英膜诱导培养
取琼脂平板培养的典型菌落或营养肉汤培养物接种于含0.7%碳散氢钠的营养琼脂平板，置20%二氧化碳培养箱中培养18h～24h取菌落涂片火焰固定·备用。6.3.4染色镜检
6.3.4.1革兰氏染色
取琼脂平板上的典型菌落或肉汤培养物制备涂片，火焰固定。结晶紫染色1min，水洗，革兰氏碘液作用1min，水洗，95%酒精脱色30s.水洗·沙黄复染30s.水洗·干燥，镜检，炭拒杆菌为革兰氏阳性菌，多个菌纵可连成长链，少数散在，菌体呈两端平齐的大籽状有的茵体中英可见卵圆形不着色的芽孢，芽孢不使菌体膨大。
6.3.4.2美膜染色
取美膜诱导培养物制备涂片，火焰固定。满加一小满碱性美蓝染色液染色1min，水洗、晾干、镜检，炭痘杆菌在低倍镜皇短链状排列，在酒镜菌体粗天量竹节状排列，菌体量深蓝色或黑色，围体周围的英膜呈粉红色。
SN/T0331-2013
6.4结果判定
只有菌落形态、肉汤生长特性和细菌形态完全符合6.3.1.3.6.3.2和6.3.4.1时，才判为炭疽杆菌，若同时行合6.3，4.2，可以得到进一步确证其中有一项不付合6.3136.3.2和6.341时，则判为非炭瓶杆菌。
7Ascoli反应
7.1样品采集
被检皮张、原毛应存放于专用仓库和指定的地方，不同批次的皮张、原毛分开存放，每批放在一，每张皮张缩号，原毛独立包装缩号，在每张皮的腿部或腋下剪取样皮一块约2g原毛在各独立包装取样35，若无独立包装则在分散的20个以上不同点各取样38：样皮、样毛应装人专用的密封金属盒或耐高温防水样品袋中，并按原有号码编号。7.2样品消毒
将检验样本连同样品袋一起放人高压灭菌器，1.034×10°Pa消毒30min。冻皮、湿皮、鲜皮应在高压消毒前置室温48h
7.3被检样本制备
将经高压消毒的皮样去除脂肪，剪取皮样1cm或原毛数克放到浸样瓶中，井记录样品编号和相对应的授样瓶编号s接照质量：体积一15～110的比例加0.5%石炭酸生理盐水至没样瓶，放4C冰箱浸泡16h～24h后·用中性滤纸滤过波·其澄清液为披检样本抗原·待检7.4正式试验
7.4.1炭沉淀素阳性血清对照试验光将200演拍沉淀系阳性血清沿管壁徐徐加人斜置的AsCOi反应管中：然后吸取等量的标雅炭值抗原，治反应管的管壁慢慢注人到沉淀素性血清上面注意，不要发生气泡，不要播动），随即将置的反应管立起，15min内判定结果，7.4.2炭疽沉淀素阴性血清对照试验先将200uL炭宜沉淀素阴性血清沿管壁徐徐加入斜置的Ascoli反应管中，然后吸取等量的标准炭疽抗原，沿反应管的管整慢慢注人到沉淀素阳性血清上面（注意，不要发生气泡，不要摇动），随即将斜置的反应管立起，15min内判定结果。7.4.3空自对照试验
先将200uL炭宜沉淀素阳性血清沿管壁徐徐加人斜置的Ascoli反应管中，然后吸取等量的0.5头石炭酸生理盐水，沿反应管的管壁慢慢注人到洗淀系阳性血清上面（洋意，不要发生气泡，不要摇动），随即将斜置的反应管立起，15min内判定结果。7.4.4被检样品试验
每个样品准备两支ASCO反应管，将2O0产L值抗淀系阳性血清沿管壁徐徐加人其中一支料置的Ascoli反应管中同时按照同样方法，将炭疽沉淀素阴性血清加人另一支Ascoli反应管中，将等量4
SN/T0331-2013
的被检皮毛样抗原分别徐徐加入到炭疽沉淀素阳性血清反应管和炭疽沉淀素阴性血清对照反应管中，注意不要发生气泡，不要摇动。随即将斜置的反应管立起，15min内判定结果。7.5结果判定
7.5.1阳性血清对照试验
炭疽沉淀素阳性血清对照试验，两液接触面出现清晰、致密如线的白色沉淀环。7.5.2阴性血清对照试验
炭殖沉淀素阴性血清对照试验和空白对照试验，两界面无白色沉淀环出现。7.5.3被检样品试验
7.5.3.1阴性血清对照反应管：应呈阴性反应，两界面无白色沉淀环出现，当对照试验成立时，方可判定反应结果：
7.5.3.2阴性反应：反应管中阳性血清与被检样品浸泡液间界面清晰，并且没有出现白色沉淀环7.5.3.3阳性反应：反应管中阳性血清与被检样品浸泡液间界面清断：并且出现清晰，致密如线的白色沉淀环。
7.5.3.4可疑：当反应管中阳性血清与被检样品浸泡液间界面清晰，并且出现模糊疏松，不明显的白色沉淀环时，则可初步判定反应结果为可疑。出现可疑结果时，应对被检测样本进行第二次试验，第二次试验如出现阴性或阳性反应时.则可判定反应结果为阴性或阳性，如结果再次可凝，则可确定反应结果为阳性。
8毒力鉴定-聚合酶链反应（PCR）8.1引物序列
以下引物用于证实毒素质粒pX01和英膜质粒pX02的存在，引物序列见表1。表1PCR引物序列
靶基因
保护性抗原
C位于pXO1
质粒）
（位于pX02
质粒）
8.2模板DNA制备
引物名称
引物序列
5TCCTAACACTAACGAAGTCG3
5-GAGGTAGAAGGATATACGGT-3
5-GTGAGCCATTAATCGATATG3
5'-TCCCACTTACGTAATCTGAG-3
PCR产物大小
用灭菌的接种环从琼脂平板上挑取一环新鲜炭疽杆菌菌落，加人到盛有25L灭菌去离子水或蒸5
SN/T0331-2013
罐水的1.5mL小离心管中制成菌悬液，于95C作用2min后于冰浴中冷却至4℃左右，12000r/min离10min，取上清液用作PCR反应模板。或者用市售等效DNA提取试剂盒进行提取。8.3PCR扩增体系(50L)及反应条件8.3.1PCR扩增体系（50μL）
模板DNA5pμLTaDNA聚合酶（5U/μL)0.25uL,10XTaqBuffer5μL.dNTP混合物（各2.5mmol/L)4μL，引物PA5(或1234)(25pmol/μl)1L，引物PA8（或1301)(25pmol/μL)1μL火菌水33.75μL
8.3.2循环参数
95C预变件5min.95变性30s.55@退火30s.72证电30s.30个循环.再72C延伸5min4℃保温。
8.4质控对照
用已知含有保护性抗原和荧膜抗原的炭宜杆菌强毒株（或用分别含有保护性抗原stern殊和美膜抗原的炭疽杆菌pasteui株）作为阳性对照，用非致病性的枯草芽孢杆菌或蜡样芽胞杆菌作为阴性对照，用去子水作为空白对照，按照8.2和83的步骤进行PCR反应8.5PCR扩增产物的检测
用1×TAE电泳缓冲波配制2%的琼脂糖凝胶，在摄胶未凝固时加人漠化乙锭染料使其终浓度为0.5μg/mL，待胶凝固后加人PCR扩增产物进行电泳，并用100bpDNALadderMarker作对照，电泳完毕后用凝胶成像系统观察、记录结果。8.6结果判断
阴性对照和空白对照未扩增出的片段，阳性对照同时护增出597bp和847bp目的片段（序列见附录B)，试验成立，进行结果判定毒素质粒PX01和美膜质粒PX02同时阳性的菌株为强毒淡疽杆菌，毒素质粒PX0I或美膜质粒PX02任何一个阴性或同时阴性的菌株为无毒或弱毒炭疽杆菌，6
A.10.7%的碳酸氧钠营养琼脂平板牛肉膏
蛋白陈
氮化钠
琼脂粉
碳酸氢钠
蒸馏水
附录A
（规范性附录）
培养基和试剂配制
15g~20g
1000ml
SN/T0331-2013
将以上除碳酸氢钠以外的其他各成分溶解于900ml蒸馏水中，调pH至7.2~7.4.加热煮沸溶解。于1.034×10°Pa高压灭菌15min.待冷至45℃50℃时.加入经过滤除菌的7%碳酸氢钠溶液100ml..混匀后倾注平板。
普通营养肉汤
牛肉膏
蛋白陈
氯化销
蒸馏水
1000ml
将以上各成分溶解于蒸偏水中，调pH至7.2~7.4，加热煮洲溶解。于1.034×10Pa高压灭菌15min
A.3普通营养琼脂平板
牛肉膏
蛋白陈
氯化钠
琼脂粉
蒸馏水
15g~20g
1000mL
将以上各成分溶解于蒸留水中，调pH至7.2~7.4.加热煮沸溶解。于1.034×10°Pa高压灭菌15mim，待冷至45℃~50℃时倾注平板，A.4戊烷滕多粘菌素琼脂平板
基础培养基
牛肉膏
蛋白陈
SN/T0331-2013
氯化钠
琼脂粉
蒸馏水
15g~20g
1000mL
将以上各成分溶解于蒸增水中，调pH至7.2~7.4加热煮沸溶解，于1.034×10Pa高压灭菌15min，放于45℃~50℃恒温水浴内保温。A.4.2
戊烷滕稀释液
称取戊烷0.1g，溶于4mL灭菌蒸馏水中：贮存于α℃～4℃冰箱内备用。A.4.3
多粘菌素稀释液
取多粘菌素B一瓶，加灭菌蒸馏水使其溶解，再用灭菌蒸馏水将其稀释为3.0001U/mL，贮存于0℃～4℃冰箱内备用。
A.4.4完全培养基
基础培养基（45℃~50℃）
戊烧滕稀释液
多粘菌素稀释液
脱纤维羊血（或马血）
A.5PLET琼脂平板
心浸液琼脂
乙酸亚铊
多粘菌素
溶葡酶
1000mL
25mg/mL~30mg/mL液10ml
4mg/mL溶液10mL
30000IU
300000IU
除心浸液琼脂外，其他各成分用灭菌蒸留水配成适当贴备液，按以上量加人冷至50℃～55℃的灭菌心没液琼脂内，混匀后倾注平板。6碱性美蓝染色液
95%乙醇
0.01%氢氧化钾溶液
将美蓝溶解于乙醇中，再和氧氧化钾溶液混合。A.7
草兰氏染色液
结晶紫染色液
结晶紫
95%乙醇
1%草胶铵水溶液
将结晶紫落解手乙醇中，然后与草酸铵水溶波混合。8
A.7.2革兰氏碘液
碘化钾
蒸馏水
SN/T0331—2013
将碘与碘化钾先进行混合，加人蒸罐水少许，待完全溶解后·再加蒸馏水至300ml。A.7.3
沙黄复染液
95%乙醇
蒸馏水
将沙黄溶解于乙醇中，再加蒸馏水至100mL。3洗样液
吐温-20
蒸馏水
1000ml
将吐温-20加于蒸馏水中，充分搅匀，装于三角瓶内或试剂瓶内：1.034×10+Pa高压灭菌。贮存于4℃冰箱备用。
0.5%石炭酸生理盐水
将苯酚50℃~70℃水浴溶解后.称取3g~5g，溶解于500ml~800mL38℃~45℃的温水中，另取8.5g氯化钠溶解于少量蒸馏水加入，加至1000.mL，室温保存。注：盐渍皮样浸液不加入就化钠。A.10
50XTAE电泳缓冲液
Tris碱
冰乙酸
0.5mol/LEDTA(pH8.0)
将以上各成分混合，再加蒸留水至1000mL。A.11
6×加样缓冲液
聚糖体
溴甲酚绿
三甲苯青
2澳化乙锭溶液
300mmol/1
6mmol/L
18%（m/V）
0.15%(m/V)
0.25%(m/V)
将1名溴化乙锭加入到100mL蒸增水中，磁力搅拌器搅拌数小时直至其完全溶解，避光保存备用。9
SN/T0331-2013
B.1保护性抗原（PA）扩增序列（597bp）GAGGTAGAAG
ACCATGGATT
CATCTCCTGA
AAGGTTACAG
CCTTGTGGCA
TCTCAAAAAA
ACAATAAGTA
TGGAAATGCA
CTGCAGGATT
CTATCTCTAG
CGCTGATACA
CGGCTCCAAT
GATATACGGT
TCTAATATTC
AAAATGGAGO
GACGGATTGA
GCTTATCCGA
TGAGGATCAA
AAAATACTTC
GAAGTGCATG
TAGTAATTCG
CAGGGGAAAG
GCAAGATTAA
CTACAACGTG
英膜扩增序列（847bp）
CTGAGCCATT
GCAAAAGTGA
ATTGCATTAG
AGGTATTTTA
TTAATCAGCC
TATGTAATCG
TAGAAAATTT
TTGATTATTG
ATTGGAGTTA
GTTACCATTA
CAATCATGAA
AATTGACATT
AAAAATCCTC
AATAGCTGCG
ATCGTGAGAA
GGACGTCACG
TCGTCATGTT
AATCGATATG
TTTAAGTGGA
TATTAGGAGT
CCTGCAGGT
CGTATTTATG
TTACGTATGG
GCGGCAACGC
TTATCCTGTT
TTGTTCCAGG
ACAATTGGAA
TATTTATTAC
TCAAGAAAAG
GTTATGTAGC
ACATGGGTAC
CGAAAAATTG
TAAAAGAGAT
TCGCCATATT
附录B
（规范性附录）
基因序列
TGATGTCAAA
ATGAAAAGAAbzxZ.net
ACGGCTTCTG
TAAGAATGTA
TTGTACATGT
TCCACACAGA
TACAAGTAGG
CGTCGTTCTT
AATTCAAGTA
AACTTGGGCT
ATGCCAATAT
TTACCAACGA
ATTATGGAAG
GGGACAGCAA
TACACTGAGC
TAGTTGTACC
TTGGTTGTTT
TGTTTCAAGA
TAATTACAGG
ATGCCATTTG
ATTAATTGCA
CTACAATTTT
TTATTTTAAG
TTACTGATCT
AATCGTATTA
AACGTACAGA
ACGATGACGA
TGTTAATCGT
TAAAAAACTC
AATAAAAGAA
AGGATTAACC
ATCCGTACAG
TCACCAGAGG
AGATATGGAG
ATACTGATAG
VACACATACTA
TGATATTGGT
CGGTCGCAAT
GAAACAATGG
TAGATATGTA
CTTCGTTAGT
AACAAATTGG
TGTTTGGATC
CTTATTTTTA
TGGTTATTTA
TATTTATCAG
TTCATGATTT
TATITGTTTA
BAGATTTTTGA
AATACAATTC
GTTAAGTGGT
GTGAGGTAGA
TTATTAAGAA
CCTCTTATCG
AGCAGTAGCA
TGGTTGGTGA
TACGGTACAG
AGATTACGTA
CTTTTCTTTC
AAATATAAAT
TGATTTCGAA
CAAGACACCC
AATATTATTC
TCAAACGAGA
GTGAAGTACA
GGGAGTGTAT
TGATCATTCA
GTTTAAATAC
AATACTGGGA
GTTAGGA
CAAAAAGCAA
AGATTTATAT
CAGAAAGAAC
GCACTCGTTT
TATTTTAACA
TATATGGCCG
AAACTTTTAT
ATTCCGTGGT
AAAGACAAGG
GCAACATTTG
ATGAGACGAA
AACCAAGAAA
CAGTTATATT
CCAGTAAAAC
CATTATGATG
ATTATGTTTT
AGTGGGA
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代替SN0331-1994
出口畜产品中炭疽杆菌检验方法Method for the inspection of bacillus anthrax in animal by-products for export2013-11-06发布
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本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准代替SN0331-—1994《出口畜产品中炭疽杆菌检验方法》。本标准与SN0331一1994相比，主要技术性变化如下：删除了大豆凝集素吸收实验、噬菌体裂解试验，申珠实验和动物实验：一增加了莱膜染色、Ascoli反应和聚合酵链反应（PCR）试验本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国内蒙古出人境检验检疫局。本标准主要起草人：王海艳、散威华、赵治国、赵林立、郭铁筝、冯永胜。本标准所代替标准的历次版本发布情况为：SN0331-1994。
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1范围
出口畜产品中炭疽杆菌检验方法本标准规定了出口畜产品中炭疽杆菌的检验。SN/T0331-2013
本标准适用于出口繁、毛、绒、野生动物毛皮、生骨粒及其他畜产品中炭疽杆菌的检验。2规范性引用文件
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炭疽为人畜共患病，试验环境和防护要求按照GB19489执行。4培养基和试剂
无菌脱纤绵羊血（或马血）。
炭疽沉淀素标准抗原。
炭疽沉淀素阳性血清。
炭疽沉淀素阴性血清。
0.7%碳酸氢钠营养琼脂平板：见附录A中A.1。4.6
普通营养肉汤：见A.2。
普通营养琼脂平板：见A.3。
戊烷咪多粘菌素琼脂平板：见A.4。PLET琼脂平板：见A.5。
碱性美蓝染色液：见A.6。
革兰氏染色液：见A.7。
洗样液：见A.8。
0.5%石炭酸生理盐水：见A.9。
电泳级琼脂糖粉。
TagDNA聚合酶：5U/μL。
100bpDNAladderMarker（脱氧核糖核酸分子量标准）。10倍浓度TagDNA聚合酶缓冲液（10xTapBuffer）：15mmol/LMgCl。4.17
4.18dNTP混合物：脱氧腺三磷酸（dATP）、脱氟胸苷三磷酸（dTTP）、脱氧鸟苷三磷酸（dGTP）、脱氧胞皆三磷酸（dCTP）各2.5mmol/L。4.1950XTAE电泳缓冲液：见A.10。4.206×加样缓冲液：见A.11
SN/T0331-2013
漠化乙绽溶液：见A，12
5设备和材料
恒温培养箱
三氧化碳培养箱
恒温水浴箱，
生物显微镜
Ascoli反应管（小试管，内直径约o.5cm左右），5.5
高压火灭菌器。
微量加样器。
高速冷冻离心机。
水平凝胶电泳槽、
电泳仪。
凝胶成像系统。
6细菌学检测
6.1抽样
黎、毛、绒和生骨粒
按生产日期或原料来源划分批次，每批按30%开包（箱）抽样或在扎包（装箱）时由每包（箱）各取一份样品。无菌从每包（箱）的不同部位共抽样/3一5名，装进灭菌的棉布袋内，将袋口扎紧·作上批次标记。将样品装人塑料袋或铁简内，密封后送样6.1.2动物皮张
应逐张取样，用灭菌棉拭于涂擦样皮的真皮面，将棉拭子插人试管，塞紧棉塞。将试管逐支用纸包囊，装入铁简内，再用棉花或纸填充空隙，密封后送样。6.2样品处理
6.2.1聚、毛、绒和生骨粒
6.2.1.1可以根据样品多少，将适合数量的同批样品（最多不超过10份）合编为一个检验样品单位，作好记录。从合编为一个检验样品单位的每个样品袋中各取1g～2g样品，一起放人一个适当大小的灭菌三角瓶中
6.2.1.2加样品量30~40倍（质量体积）的预冷洗样液于三角瓶中用灭菌瓶塞将瓶口塞严，将三角瓶冰水浴或0~4℃箱内，间或摇动约1h6.2.1.3将瓶中洗样被倒人500mL灭菌离心管中，盖住管口，以3000/min高心20min弃去上清液，加少许灭菌水，使沉淀均匀悬浮。将离心管静置5min10min，待杂质下沉后，将上悬液移人另一支灭菌试管内，于65℃恒温水浴加热30min6.2.1.4加洗样液后的样品于热处理前如不能及时检验，应贮存于0℃～4℃冰箱内.以防芽孢发芽。2
6.2.2动物皮张
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动物皮张的棉技子涂抹样品，如不能及时检验，应建存手0℃～4℃冰箱内，以防芽孢发芽。6.3检验方法
6.3.1平板接种
6.3.1.1、毛、绒和生骨粒
按6.2处理后的紫、毛、绒和生骨粒样品悬液，根据每管所包括样品份数之多少，各接种1～3个PLET琼脂平板或戊烷滕多粘菌素平板接种时用灭菌吸管吸取样品，滴加于平板表面，各O.1mL~0.3mL。如有剩余样品，可增接数个平板，直至将样品接种完用灭菌L型玻璃棒将滴加的样液涂布均匀。如样液较多，可将平板置于37℃温箱，微开Ⅲ盖，使样液迅速干燥。翻转平血，置于37℃恒温箱，培养48h~72h
6.3.1.2动物皮张
动物皮张的棉拭子涂抹样品，将棉拭子由试管内取出，各涂抹一个PLET琼脂平板或戊烷胖多粘菌素平板。翻转平Ⅲ.置于37℃恒温箱培养24h~48h。6.3.1.3菌落及菌形观察
炭疽杆菌菌落扁平、暗灰色、不透明、无光泽、表面粗糙、边缘不整齐。用放大镜观察，边缘卷发状用接种针接触，有粘滞感，挑之可拉起长丝。挑取可疑菌落按照6.3.2、6.3.3、6.3.4的方法进行鉴定。6.3.2营养肉汤培养
取琼脂平板上的典型菌落接种营养肉汤，于37℃培养5b12H。炭疽杆菌在肉汤中生长的初期特征是肉汤上部意清，无菌膜，下部有絮状沉淀，沉淀不易摇散6.3.3英膜诱导培养
取琼脂平板培养的典型菌落或营养肉汤培养物接种于含0.7%碳散氢钠的营养琼脂平板，置20%二氧化碳培养箱中培养18h～24h取菌落涂片火焰固定·备用。6.3.4染色镜检
6.3.4.1革兰氏染色
取琼脂平板上的典型菌落或肉汤培养物制备涂片，火焰固定。结晶紫染色1min，水洗，革兰氏碘液作用1min，水洗，95%酒精脱色30s.水洗·沙黄复染30s.水洗·干燥，镜检，炭拒杆菌为革兰氏阳性菌，多个菌纵可连成长链，少数散在，菌体呈两端平齐的大籽状有的茵体中英可见卵圆形不着色的芽孢，芽孢不使菌体膨大。
6.3.4.2美膜染色
取美膜诱导培养物制备涂片，火焰固定。满加一小满碱性美蓝染色液染色1min，水洗、晾干、镜检，炭痘杆菌在低倍镜皇短链状排列，在酒镜菌体粗天量竹节状排列，菌体量深蓝色或黑色，围体周围的英膜呈粉红色。
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6.4结果判定
只有菌落形态、肉汤生长特性和细菌形态完全符合6.3.1.3.6.3.2和6.3.4.1时，才判为炭疽杆菌，若同时行合6.3，4.2，可以得到进一步确证其中有一项不付合6.3136.3.2和6.341时，则判为非炭瓶杆菌。
7Ascoli反应
7.1样品采集
被检皮张、原毛应存放于专用仓库和指定的地方，不同批次的皮张、原毛分开存放，每批放在一，每张皮张缩号，原毛独立包装缩号，在每张皮的腿部或腋下剪取样皮一块约2g原毛在各独立包装取样35，若无独立包装则在分散的20个以上不同点各取样38：样皮、样毛应装人专用的密封金属盒或耐高温防水样品袋中，并按原有号码编号。7.2样品消毒
将检验样本连同样品袋一起放人高压灭菌器，1.034×10°Pa消毒30min。冻皮、湿皮、鲜皮应在高压消毒前置室温48h
7.3被检样本制备
将经高压消毒的皮样去除脂肪，剪取皮样1cm或原毛数克放到浸样瓶中，井记录样品编号和相对应的授样瓶编号s接照质量：体积一15～110的比例加0.5%石炭酸生理盐水至没样瓶，放4C冰箱浸泡16h～24h后·用中性滤纸滤过波·其澄清液为披检样本抗原·待检7.4正式试验
7.4.1炭沉淀素阳性血清对照试验光将200演拍沉淀系阳性血清沿管壁徐徐加人斜置的AsCOi反应管中：然后吸取等量的标雅炭值抗原，治反应管的管壁慢慢注人到沉淀素性血清上面注意，不要发生气泡，不要播动），随即将置的反应管立起，15min内判定结果，7.4.2炭疽沉淀素阴性血清对照试验先将200uL炭宜沉淀素阴性血清沿管壁徐徐加入斜置的Ascoli反应管中，然后吸取等量的标准炭疽抗原，沿反应管的管整慢慢注人到沉淀素阳性血清上面（注意，不要发生气泡，不要摇动），随即将斜置的反应管立起，15min内判定结果。7.4.3空自对照试验
先将200uL炭宜沉淀素阳性血清沿管壁徐徐加人斜置的Ascoli反应管中，然后吸取等量的0.5头石炭酸生理盐水，沿反应管的管壁慢慢注人到洗淀系阳性血清上面（洋意，不要发生气泡，不要摇动），随即将斜置的反应管立起，15min内判定结果。7.4.4被检样品试验
每个样品准备两支ASCO反应管，将2O0产L值抗淀系阳性血清沿管壁徐徐加人其中一支料置的Ascoli反应管中同时按照同样方法，将炭疽沉淀素阴性血清加人另一支Ascoli反应管中，将等量4
SN/T0331-2013
的被检皮毛样抗原分别徐徐加入到炭疽沉淀素阳性血清反应管和炭疽沉淀素阴性血清对照反应管中，注意不要发生气泡，不要摇动。随即将斜置的反应管立起，15min内判定结果。7.5结果判定
7.5.1阳性血清对照试验
炭疽沉淀素阳性血清对照试验，两液接触面出现清晰、致密如线的白色沉淀环。7.5.2阴性血清对照试验
炭殖沉淀素阴性血清对照试验和空白对照试验，两界面无白色沉淀环出现。7.5.3被检样品试验
7.5.3.1阴性血清对照反应管：应呈阴性反应，两界面无白色沉淀环出现，当对照试验成立时，方可判定反应结果：
7.5.3.2阴性反应：反应管中阳性血清与被检样品浸泡液间界面清晰，并且没有出现白色沉淀环7.5.3.3阳性反应：反应管中阳性血清与被检样品浸泡液间界面清断：并且出现清晰，致密如线的白色沉淀环。
7.5.3.4可疑：当反应管中阳性血清与被检样品浸泡液间界面清晰，并且出现模糊疏松，不明显的白色沉淀环时，则可初步判定反应结果为可疑。出现可疑结果时，应对被检测样本进行第二次试验，第二次试验如出现阴性或阳性反应时.则可判定反应结果为阴性或阳性，如结果再次可凝，则可确定反应结果为阳性。
8毒力鉴定-聚合酶链反应（PCR）8.1引物序列
以下引物用于证实毒素质粒pX01和英膜质粒pX02的存在，引物序列见表1。表1PCR引物序列
靶基因
保护性抗原
C位于pXO1
质粒）
（位于pX02
质粒）
8.2模板DNA制备
引物名称
引物序列
5TCCTAACACTAACGAAGTCG3
5-GAGGTAGAAGGATATACGGT-3
5-GTGAGCCATTAATCGATATG3
5'-TCCCACTTACGTAATCTGAG-3
PCR产物大小
用灭菌的接种环从琼脂平板上挑取一环新鲜炭疽杆菌菌落，加人到盛有25L灭菌去离子水或蒸5
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罐水的1.5mL小离心管中制成菌悬液，于95C作用2min后于冰浴中冷却至4℃左右，12000r/min离10min，取上清液用作PCR反应模板。或者用市售等效DNA提取试剂盒进行提取。8.3PCR扩增体系(50L)及反应条件8.3.1PCR扩增体系（50μL）
模板DNA5pμLTaDNA聚合酶（5U/μL)0.25uL,10XTaqBuffer5μL.dNTP混合物（各2.5mmol/L)4μL，引物PA5(或1234)(25pmol/μl)1L，引物PA8（或1301)(25pmol/μL)1μL火菌水33.75μL
8.3.2循环参数
95C预变件5min.95变性30s.55@退火30s.72证电30s.30个循环.再72C延伸5min4℃保温。
8.4质控对照
用已知含有保护性抗原和荧膜抗原的炭宜杆菌强毒株（或用分别含有保护性抗原stern殊和美膜抗原的炭疽杆菌pasteui株）作为阳性对照，用非致病性的枯草芽孢杆菌或蜡样芽胞杆菌作为阴性对照，用去子水作为空白对照，按照8.2和83的步骤进行PCR反应8.5PCR扩增产物的检测
用1×TAE电泳缓冲波配制2%的琼脂糖凝胶，在摄胶未凝固时加人漠化乙锭染料使其终浓度为0.5μg/mL，待胶凝固后加人PCR扩增产物进行电泳，并用100bpDNALadderMarker作对照，电泳完毕后用凝胶成像系统观察、记录结果。8.6结果判断
阴性对照和空白对照未扩增出的片段，阳性对照同时护增出597bp和847bp目的片段（序列见附录B)，试验成立，进行结果判定毒素质粒PX01和美膜质粒PX02同时阳性的菌株为强毒淡疽杆菌，毒素质粒PX0I或美膜质粒PX02任何一个阴性或同时阴性的菌株为无毒或弱毒炭疽杆菌，6
A.10.7%的碳酸氧钠营养琼脂平板牛肉膏
蛋白陈
氮化钠
琼脂粉
碳酸氢钠
蒸馏水
附录A
（规范性附录）
培养基和试剂配制
15g~20g
1000ml
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将以上除碳酸氢钠以外的其他各成分溶解于900ml蒸馏水中，调pH至7.2~7.4.加热煮沸溶解。于1.034×10°Pa高压灭菌15min.待冷至45℃50℃时.加入经过滤除菌的7%碳酸氢钠溶液100ml..混匀后倾注平板。
普通营养肉汤
牛肉膏
蛋白陈
氯化销
蒸馏水
1000ml
将以上各成分溶解于蒸偏水中，调pH至7.2~7.4，加热煮洲溶解。于1.034×10Pa高压灭菌15min
A.3普通营养琼脂平板
牛肉膏
蛋白陈
氯化钠
琼脂粉
蒸馏水
15g~20g
1000mL
将以上各成分溶解于蒸留水中，调pH至7.2~7.4.加热煮沸溶解。于1.034×10°Pa高压灭菌15mim，待冷至45℃~50℃时倾注平板，A.4戊烷滕多粘菌素琼脂平板
基础培养基
牛肉膏
蛋白陈
SN/T0331-2013
氯化钠
琼脂粉
蒸馏水
15g~20g
1000mL
将以上各成分溶解于蒸增水中，调pH至7.2~7.4加热煮沸溶解，于1.034×10Pa高压灭菌15min，放于45℃~50℃恒温水浴内保温。A.4.2
戊烷滕稀释液
称取戊烷0.1g，溶于4mL灭菌蒸馏水中：贮存于α℃～4℃冰箱内备用。A.4.3
多粘菌素稀释液
取多粘菌素B一瓶，加灭菌蒸馏水使其溶解，再用灭菌蒸馏水将其稀释为3.0001U/mL，贮存于0℃～4℃冰箱内备用。
A.4.4完全培养基
基础培养基（45℃~50℃）
戊烧滕稀释液
多粘菌素稀释液
脱纤维羊血（或马血）
A.5PLET琼脂平板
心浸液琼脂
乙酸亚铊
多粘菌素
溶葡酶
1000mL
25mg/mL~30mg/mL液10ml
4mg/mL溶液10mL
30000IU
300000IU
除心浸液琼脂外，其他各成分用灭菌蒸留水配成适当贴备液，按以上量加人冷至50℃～55℃的灭菌心没液琼脂内，混匀后倾注平板。6碱性美蓝染色液
95%乙醇
0.01%氢氧化钾溶液
将美蓝溶解于乙醇中，再和氧氧化钾溶液混合。A.7
草兰氏染色液
结晶紫染色液
结晶紫
95%乙醇
1%草胶铵水溶液
将结晶紫落解手乙醇中，然后与草酸铵水溶波混合。8
A.7.2革兰氏碘液
碘化钾
蒸馏水
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将碘与碘化钾先进行混合，加人蒸罐水少许，待完全溶解后·再加蒸馏水至300ml。A.7.3
沙黄复染液
95%乙醇
蒸馏水
将沙黄溶解于乙醇中，再加蒸馏水至100mL。3洗样液
吐温-20
蒸馏水
1000ml
将吐温-20加于蒸馏水中，充分搅匀，装于三角瓶内或试剂瓶内：1.034×10+Pa高压灭菌。贮存于4℃冰箱备用。
0.5%石炭酸生理盐水
将苯酚50℃~70℃水浴溶解后.称取3g~5g，溶解于500ml~800mL38℃~45℃的温水中，另取8.5g氯化钠溶解于少量蒸馏水加入，加至1000.mL，室温保存。注：盐渍皮样浸液不加入就化钠。A.10
50XTAE电泳缓冲液
Tris碱
冰乙酸
0.5mol/LEDTA(pH8.0)
将以上各成分混合，再加蒸留水至1000mL。A.11
6×加样缓冲液
聚糖体
溴甲酚绿
三甲苯青
2澳化乙锭溶液
300mmol/1
6mmol/L
18%（m/V）
0.15%(m/V)
0.25%(m/V)
将1名溴化乙锭加入到100mL蒸增水中，磁力搅拌器搅拌数小时直至其完全溶解，避光保存备用。9
SN/T0331-2013
B.1保护性抗原（PA）扩增序列（597bp）GAGGTAGAAG
ACCATGGATT
CATCTCCTGA
AAGGTTACAG
CCTTGTGGCA
TCTCAAAAAA
ACAATAAGTA
TGGAAATGCA
CTGCAGGATT
CTATCTCTAG
CGCTGATACA
CGGCTCCAAT
GATATACGGT
TCTAATATTC
AAAATGGAGO
GACGGATTGA
GCTTATCCGA
TGAGGATCAA
AAAATACTTC
GAAGTGCATG
TAGTAATTCG
CAGGGGAAAG
GCAAGATTAA
CTACAACGTG
英膜扩增序列（847bp）
CTGAGCCATT
GCAAAAGTGA
ATTGCATTAG
AGGTATTTTA
TTAATCAGCC
TATGTAATCG
TAGAAAATTT
TTGATTATTG
ATTGGAGTTA
GTTACCATTA
CAATCATGAA
AATTGACATT
AAAAATCCTC
AATAGCTGCG
ATCGTGAGAA
GGACGTCACG
TCGTCATGTT
AATCGATATG
TTTAAGTGGA
TATTAGGAGT
CCTGCAGGT
CGTATTTATG
TTACGTATGG
GCGGCAACGC
TTATCCTGTT
TTGTTCCAGG
ACAATTGGAA
TATTTATTAC
TCAAGAAAAG
GTTATGTAGC
ACATGGGTAC
CGAAAAATTG
TAAAAGAGAT
TCGCCATATT
附录B
（规范性附录）
基因序列
TGATGTCAAA
ATGAAAAGAAbzxZ.net
ACGGCTTCTG
TAAGAATGTA
TTGTACATGT
TCCACACAGA
TACAAGTAGG
CGTCGTTCTT
AATTCAAGTA
AACTTGGGCT
ATGCCAATAT
TTACCAACGA
ATTATGGAAG
GGGACAGCAA
TACACTGAGC
TAGTTGTACC
TTGGTTGTTT
TGTTTCAAGA
TAATTACAGG
ATGCCATTTG
ATTAATTGCA
CTACAATTTT
TTATTTTAAG
TTACTGATCT
AATCGTATTA
AACGTACAGA
ACGATGACGA
TGTTAATCGT
TAAAAAACTC
AATAAAAGAA
AGGATTAACC
ATCCGTACAG
TCACCAGAGG
AGATATGGAG
ATACTGATAG
VACACATACTA
TGATATTGGT
CGGTCGCAAT
GAAACAATGG
TAGATATGTA
CTTCGTTAGT
AACAAATTGG
TGTTTGGATC
CTTATTTTTA
TGGTTATTTA
TATTTATCAG
TTCATGATTT
TATITGTTTA
BAGATTTTTGA
AATACAATTC
GTTAAGTGGT
GTGAGGTAGA
TTATTAAGAA
CCTCTTATCG
AGCAGTAGCA
TGGTTGGTGA
TACGGTACAG
AGATTACGTA
CTTTTCTTTC
AAATATAAAT
TGATTTCGAA
CAAGACACCC
AATATTATTC
TCAAACGAGA
GTGAAGTACA
GGGAGTGTAT
TGATCATTCA
GTTTAAATAC
AATACTGGGA
GTTAGGA
CAAAAAGCAA
AGATTTATAT
CAGAAAGAAC
GCACTCGTTT
TATTTTAACA
TATATGGCCG
AAACTTTTAT
ATTCCGTGGT
AAAGACAAGG
GCAACATTTG
ATGAGACGAA
AACCAAGAAA
CAGTTATATT
CCAGTAAAAC
CATTATGATG
ATTATGTTTT
AGTGGGA
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