SN/T 1135.11-2013
基本信息
标准号： SN/T 1135.11-2013
中文名称：马铃薯皮斑病菌检疫鉴定方法
标准类别：商检行业标准(SN)
标准状态：现行
出版语种：简体中文
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标准简介
SN/T 1135.11-2013 马铃薯皮斑病菌检疫鉴定方法
SN/T1135.11-2013
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标准内容
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T1135.11—2013
马铃薯皮斑病菌检疫鉴定方法
Detection and identification of Polyscytalum pustulans (M.N.Owen et Wakef.)M.B.Ellis
2013-11-06发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2014-06-01实施
本部分按照GB/T1.12009给出的规则起草。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位：中国检验检疫科学研究院。本部分起草人：昊品珊、杜洪忠、严进、张秋娥。SN/T1135.11—2013
1范围
马铃薯皮斑病菌检疫鉴定方法
SN/T1135的本部分规定了马铃薯皮斑病菌的检疫鉴定方法。本部分适用于马铃薯块茎上马铃薯皮斑病菌的检疫和鉴定。2病菌的基本信息
中文名：马铃薯皮斑病菌
英文名：Skinspotofpotato
学名：Polyscytalumpustulans(M.N.Owen etWakef.M.B.Ellis异名：OosporapustulansM.N.Oyen&.Wakef.SN/T1135.11—2013
分类地位：真菌界（Fungi），有丝分裂孢子真菌（Mitosporiefung蛇孢霉属（Polyscytalum）。传插播途径：病菌的初侵染源是块鉴，病菌孢子可以通过雨水、灌溉近距离传播，远距离通过种薯或带病土壤进行传播。
马铃薯皮斑病菌的其他信息参见附录A。3方法原理
以马铃薯皮斑病菌形态学特征和分子生物学特征为鉴定依据4仪器和用具
4.1仪器
生物显微镜（具测量功能），体视显微镜超净工作台，生物培养箱，天平，高压灭菌锅，台式高速离心机，pH计，水浴箱，实时荧光PCR扩增仪4.2用具
烧杯，三角瓶，量筒，试管，培养皿，酒精灯，镊子，剪刀，解剖刀，接种针，载玻片，盖玻片，塑料研杆，移液器，移液器吸头，离心管，液氮罐。5试剂和培养基
5.1试剂
葡萄糖，琼脂粉，液氮，Tris-HCl.MgClHCl,EDTA，NaOH,NaOAC，KCl,Tris，CTAB,TAE，无水乙醇（Ethanol），SYBRGreenI核酸染料，氯仿（Chloroform），异丙醇（Isopropanol），异戊醇（Isoamylalcohol)，蛋白酶K，TagDNA聚合酶，dNTP，通用引物ITS5和ITS4，实时荧光PCR特异性引物PpustF1、PpustR2及探针PpustPrl1
SN/T1135.11-2013
5.2培养基
马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）。具体配方参见附录A6实验室检疫wwW.bzxz.Net
6.1症状检查
观察马铃薯块茎上是否具有浅棕色的病斑以及紫黑色且略微凸起的病斑。挑选具类似病斑的马铃薯块茎进行分离及保湿培养。病害症状图参见附录A。6.2分离培养
取疑似症状病斑的病健交界处组织，用70%乙醇表面消毒1min.灭菌水冲洗3次，置于PDA培养基平皿中，20℃培养，培养3d～5d后开始观察。若发现白色或灰白色菌落，转接到新的PDA培养基平皿上，培养5d后开始观察病菌的菌落培养性状，同时在显微镜下观察记录分生孢子、产孢细胞的形状、大小等。
6.3保湿培养
将疑似症状的马铃薯块茎，置密闭塑料盒中15℃～20℃高湿度下培养5d，若病斑处长出病菌的子实体或菌丝体，用接种针挑子实体或菌丝体直接制片，置显微镜下观察，记录分生孢子、产孢细胞的形状、大小等。
6.4分子生物学检测
6.4.1DNA提取
按CTAB方法提取DNA参见附录B。6.4.2实时费光PCR检测
实时荧光PCR引物序列为PpustF1：5-AGCGCCCCACAGAAGCC-3，PpustR2.5\-GACCGAACTTCTCCGAGAGGT-3，TaqMan探针PpustPrl：5'-FAM-CGGCTCTAAACCCTACCGAAGTAGGGTAGC-BHQ-3\。探针5'踏标记的荧光报告基团为FAM，3°端标记的荧光猝灭基团为BHQ-1。
25μL反应体系中含：样品DNA1μL.10XPCRbuffer2.5μL.25mMMgCl，2μL，2.5mMdNTps2μL,10μMPrimers个1μL,10μM探针PpustPrl1.5μL,5U/μLTaqDNApolymerase0.5μLddHO12.5μL。同时要设置空白对照，以Tris-EDTA缓冲液代替DNA样品。反应循环为94℃10min-94℃15s、56℃60s循环40次。6.4.3ITS序列比对
利用真通用引物ITS5（5*-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3）和ITS4（5*-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3\)进行扩增
25μL反应体系中含：样品DNA1μL.10×PCRbuffer2.5μL.25mMMgClz2μL.2.5mMdNTps2μL,10μMPrimers各1μL.5U/μLTaqDNApol.ymerase0.3μL.ddHO15.2μL。同时要设置空白对照，以Tris-EDTA缓冲液代替DNA样品。PCR反应条件为：预变性94℃4min-变性，95C1min.退火56℃30$.72℃455，35个循环-2
72℃10min-4℃保存。
SN/T1135.11-2013
PCR产物的检测，在1XTAE电泳缓冲液中，1.5%琼脂糖（含SYBRGreenI核酸染料）凝胶电泳，5V/cm，凝胶成像仪分析结果。如有1000bp左右大小的单带出现，将扩增产物进行序列测定。将测序获得的序列与GenBank中公开发表的Polyscytalumpustulans的序列进行同源性比对分析。
鉴定特征
7.1培养性状
马铃薯皮斑病菌在PDA培养基上的菌落白色至灰白色。有些菌株在15℃下培养1～2个月后可以形成菌核，直径60pm~1000μm。7.2形态特征
马铃薯皮斑病菌的分生孢子梗具分枝，宽2μm~4μm，最长达140um，下部淡褐色，基部偶粗大；分生孢子透明，平滑，卵圆形至圆柱形，带有圆形的断点，大多数情况下是单细胞，有时会形成用隔膜分开的多细胞结构，大小为（6μm~8m）×（2μm~3μm），可以形成具分枝的分生孢子链，易断裂。分生孢子产生需要较高的相对湿度（>85%RH)。马铃薯皮斑病菌形态图参见附录C。7.3实时荧光PCR检测
若空白对照的Ct值大于或等于40，供试菌Ct值小于36，可判定检测结果为阳性。7.4序列比对
序列比对结果与GenBank中公开发表的Polyscytalumpustulans的序列99%～100%同源，则判定为阳性。
8结果判定
病菌的培养性状和形态特征与7.1和7.2的描述一致，且实时荧光PCR检测结果呈阳性，可判定为马铃薯皮斑病菌。
病菌的培养性状和形态特征与7.1和7.2的描述一致，按照6.4.3的方法进行测序比对，判定为阳性，可判定为马铃薯皮斑病菌。9
样品保存与处理
样品经登记和经手人签字后妥善保存。对检出马铃薯皮斑病菌的样品应保存于4℃冰箱中，以备复核。该类样品保存期满后应经高压灭菌后方可处理。10菌株保存与处理
从检测样品中分离并鉴定为马铃著皮斑病菌的菌株，应妥善保存。将菌株接种于PDA培养基斜面上，20℃培养5d，4℃8℃黑暗条件下保存，定期（60d）转接防止病菌死亡，至少保存6个月。必要时用病菌的分生跑子作冻干菌种保存。保存期满后高压灭菌灭活处理。3
SN/T1135.11—2013
11结果记录与资料保存
完整的实验记录包括：样品的来源、种类、时间，实验的时间、地点、方法和结果等，并要有实验人员和审核人员签字。
A.1症状特征
附录A
（资料性附录）
马铃薯皮斑病菌的其他信息
SN/T1135.11—2013
马铃薯受P.pustulans为害一般会在储藏期潜伏1～2个月发病，发病后块茎上有紫黑色、略微凸起的斑点形成。症状如图A.1所示。这类紫黑色突起斑点可以聚集在芽眼和损坏的表皮周围产生，病斑可深入表皮1mm2mm，也可在受感染块茎的表面上随机分布。芽眼中的幼芽可能会被杀死，块茎会失去繁殖能力。在块茎表面如果先前有表皮损坏，有时会形成较大的坏死区域。如果种植了带有受损幼的马铃馨块茎，植株的发育会延退，分布也不均匀图A.1马铃薯块茎受害症状（引自StuartCarnegie）A.2寄主范围
主要寄主马铃薯（Solanumtuberosum），次要寄主茄属植物（SolanumL.）。A.3地理分布
爱沙尼亚、德国、爱尔兰、立陶宛、南斯拉夫、挪威、罗马尼亚、俄罗斯、英国、南非、加拿大、美国、澳大利亚、新西兰。
A.4培养基
马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）：去皮马铃薯200g：切碎，加适量蒸馏水煮沸20min左右.双层纱布过滤，在滤汁中加人葡萄糖20g、琼脂18g·继续煮至琼脂完全溶化后，加蒸馏水补足1000mL，121℃，高压灭菌20min。
SN/T1135.11—2013
附录B
（资料性附录）
DNA提取方法
将分离获得的真菌，收集菌丝放入1,5mL浸在液氮里的离心管中，用塑料杆碾碎待用。离心管加人300mL~500μLCTAB缓冲液（其中含0.1g蛋白酶K）混匀，65℃水浴1h13000g离心5min~10min，保留上清液；加500μL三氯甲烷：异戊醇（体积比为24：1）混勾，13000g离心5min~10min，保留上清液；再加500μL三氯甲烷：异戊醇（体积比为241）混，13000g离心5min~10min，保留上清液，加人1mL异丙醇混，-70℃下放置1h，或-20℃过夜：13000g离心30min，可见DNA沉淀；70%乙醇洗DNA沉淀，室温干燥：用30mL~50μLTris-EDTA缓冲液溶解DNA，待用。
附录C
（规范性附录）
马铃薯皮斑病菌形态图
分生孢子和分生孢子链（杜洪忠拍摄）SN/T1135.11—2013
SN/T1135.11—2013
参考文献
[1]CompendiumofPatatoDiseases.SecondEdition2o01.[2] Hide G.A.,Ibrahim L..Infection of potato stem bases,stolons and tubers by Polyscytalumpustulans(Owen &.Wakef.)Ellis and development of sclerotie.Potato-Research.1994,37(1):35-42.[3]Carnegie S.F.,Cameron A.M..Occurrence of Polyscytalim pustulans,Phoma foveata andFu.sarium solani var.coeruleumin fieldsoilsin Scotland.PlantPathology.1990,39(3).517-523Carnegie S.F.,Cameron A.M..Contamination of healthy seed tubers by Polyscytalum pus-［4]
tulans and Phoma erigua var.foveata in potato stores,Potato Research.1987,30.l,79-88.[5]
QuarantinePestsforEurope.SecondEdition,1997.CABI.CropProtectionCompendium2007.Vico I.,KrsticB.,StojanovicG..THEOCCURRENCE OFPOLYSCITALUMPUSPULANSONPOTATOESINYUGOSLAVIA.ISHSActaHorticulturae.462:339-343.[8]
Carnegie S.F.,Cameron A.M..Oceurrence of Polyscytalum pustulans,Phoma foueata andFusarium solani var.coeraleum in field soils in Scotland.Plantpathology.1990,39,517-523.[9]Hide G.A.,Hirst J.M..Stedman O.J..Effects of skin spot(Oospora pustulans) on potatos.Ann.appl.biol.197373:151-162.[1o]Lees A.K.,Sullivan L..Cullen D.W..A QuantitativePolymerase Chain Reaction Assay forthe Detection of Polyscytalum pustulans,the Cause of Skin Spot Disease of Potato.J.Phytopathol.2009,157(3)：154-158.
书号：155066：2-26930
SN/T1135.11-2013
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马铃薯皮斑病菌检疫鉴定方法
Detection and identification of Polyscytalum pustulans (M.N.Owen et Wakef.)M.B.Ellis
2013-11-06发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2014-06-01实施
本部分按照GB/T1.12009给出的规则起草。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位：中国检验检疫科学研究院。本部分起草人：昊品珊、杜洪忠、严进、张秋娥。SN/T1135.11—2013
1范围
马铃薯皮斑病菌检疫鉴定方法
SN/T1135的本部分规定了马铃薯皮斑病菌的检疫鉴定方法。本部分适用于马铃薯块茎上马铃薯皮斑病菌的检疫和鉴定。2病菌的基本信息
中文名：马铃薯皮斑病菌
英文名：Skinspotofpotato
学名：Polyscytalumpustulans(M.N.Owen etWakef.M.B.Ellis异名：OosporapustulansM.N.Oyen&.Wakef.SN/T1135.11—2013
分类地位：真菌界（Fungi），有丝分裂孢子真菌（Mitosporiefung蛇孢霉属（Polyscytalum）。传插播途径：病菌的初侵染源是块鉴，病菌孢子可以通过雨水、灌溉近距离传播，远距离通过种薯或带病土壤进行传播。
马铃薯皮斑病菌的其他信息参见附录A。3方法原理
以马铃薯皮斑病菌形态学特征和分子生物学特征为鉴定依据4仪器和用具
4.1仪器
生物显微镜（具测量功能），体视显微镜超净工作台，生物培养箱，天平，高压灭菌锅，台式高速离心机，pH计，水浴箱，实时荧光PCR扩增仪4.2用具
烧杯，三角瓶，量筒，试管，培养皿，酒精灯，镊子，剪刀，解剖刀，接种针，载玻片，盖玻片，塑料研杆，移液器，移液器吸头，离心管，液氮罐。5试剂和培养基
5.1试剂
葡萄糖，琼脂粉，液氮，Tris-HCl.MgClHCl,EDTA，NaOH,NaOAC，KCl,Tris，CTAB,TAE，无水乙醇（Ethanol），SYBRGreenI核酸染料，氯仿（Chloroform），异丙醇（Isopropanol），异戊醇（Isoamylalcohol)，蛋白酶K，TagDNA聚合酶，dNTP，通用引物ITS5和ITS4，实时荧光PCR特异性引物PpustF1、PpustR2及探针PpustPrl1
SN/T1135.11-2013
5.2培养基
马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）。具体配方参见附录A6实验室检疫wwW.bzxz.Net
6.1症状检查
观察马铃薯块茎上是否具有浅棕色的病斑以及紫黑色且略微凸起的病斑。挑选具类似病斑的马铃薯块茎进行分离及保湿培养。病害症状图参见附录A。6.2分离培养
取疑似症状病斑的病健交界处组织，用70%乙醇表面消毒1min.灭菌水冲洗3次，置于PDA培养基平皿中，20℃培养，培养3d～5d后开始观察。若发现白色或灰白色菌落，转接到新的PDA培养基平皿上，培养5d后开始观察病菌的菌落培养性状，同时在显微镜下观察记录分生孢子、产孢细胞的形状、大小等。
6.3保湿培养
将疑似症状的马铃薯块茎，置密闭塑料盒中15℃～20℃高湿度下培养5d，若病斑处长出病菌的子实体或菌丝体，用接种针挑子实体或菌丝体直接制片，置显微镜下观察，记录分生孢子、产孢细胞的形状、大小等。
6.4分子生物学检测
6.4.1DNA提取
按CTAB方法提取DNA参见附录B。6.4.2实时费光PCR检测
实时荧光PCR引物序列为PpustF1：5-AGCGCCCCACAGAAGCC-3，PpustR2.5\-GACCGAACTTCTCCGAGAGGT-3，TaqMan探针PpustPrl：5'-FAM-CGGCTCTAAACCCTACCGAAGTAGGGTAGC-BHQ-3\。探针5'踏标记的荧光报告基团为FAM，3°端标记的荧光猝灭基团为BHQ-1。
25μL反应体系中含：样品DNA1μL.10XPCRbuffer2.5μL.25mMMgCl，2μL，2.5mMdNTps2μL,10μMPrimers个1μL,10μM探针PpustPrl1.5μL,5U/μLTaqDNApolymerase0.5μLddHO12.5μL。同时要设置空白对照，以Tris-EDTA缓冲液代替DNA样品。反应循环为94℃10min-94℃15s、56℃60s循环40次。6.4.3ITS序列比对
利用真通用引物ITS5（5*-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3）和ITS4（5*-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3\)进行扩增
25μL反应体系中含：样品DNA1μL.10×PCRbuffer2.5μL.25mMMgClz2μL.2.5mMdNTps2μL,10μMPrimers各1μL.5U/μLTaqDNApol.ymerase0.3μL.ddHO15.2μL。同时要设置空白对照，以Tris-EDTA缓冲液代替DNA样品。PCR反应条件为：预变性94℃4min-变性，95C1min.退火56℃30$.72℃455，35个循环-2
72℃10min-4℃保存。
SN/T1135.11-2013
PCR产物的检测，在1XTAE电泳缓冲液中，1.5%琼脂糖（含SYBRGreenI核酸染料）凝胶电泳，5V/cm，凝胶成像仪分析结果。如有1000bp左右大小的单带出现，将扩增产物进行序列测定。将测序获得的序列与GenBank中公开发表的Polyscytalumpustulans的序列进行同源性比对分析。
鉴定特征
7.1培养性状
马铃薯皮斑病菌在PDA培养基上的菌落白色至灰白色。有些菌株在15℃下培养1～2个月后可以形成菌核，直径60pm~1000μm。7.2形态特征
马铃薯皮斑病菌的分生孢子梗具分枝，宽2μm~4μm，最长达140um，下部淡褐色，基部偶粗大；分生孢子透明，平滑，卵圆形至圆柱形，带有圆形的断点，大多数情况下是单细胞，有时会形成用隔膜分开的多细胞结构，大小为（6μm~8m）×（2μm~3μm），可以形成具分枝的分生孢子链，易断裂。分生孢子产生需要较高的相对湿度（>85%RH)。马铃薯皮斑病菌形态图参见附录C。7.3实时荧光PCR检测
若空白对照的Ct值大于或等于40，供试菌Ct值小于36，可判定检测结果为阳性。7.4序列比对
序列比对结果与GenBank中公开发表的Polyscytalumpustulans的序列99%～100%同源，则判定为阳性。
8结果判定
病菌的培养性状和形态特征与7.1和7.2的描述一致，且实时荧光PCR检测结果呈阳性，可判定为马铃薯皮斑病菌。
病菌的培养性状和形态特征与7.1和7.2的描述一致，按照6.4.3的方法进行测序比对，判定为阳性，可判定为马铃薯皮斑病菌。9
样品保存与处理
样品经登记和经手人签字后妥善保存。对检出马铃薯皮斑病菌的样品应保存于4℃冰箱中，以备复核。该类样品保存期满后应经高压灭菌后方可处理。10菌株保存与处理
从检测样品中分离并鉴定为马铃著皮斑病菌的菌株，应妥善保存。将菌株接种于PDA培养基斜面上，20℃培养5d，4℃8℃黑暗条件下保存，定期（60d）转接防止病菌死亡，至少保存6个月。必要时用病菌的分生跑子作冻干菌种保存。保存期满后高压灭菌灭活处理。3
SN/T1135.11—2013
11结果记录与资料保存
完整的实验记录包括：样品的来源、种类、时间，实验的时间、地点、方法和结果等，并要有实验人员和审核人员签字。
A.1症状特征
附录A
（资料性附录）
马铃薯皮斑病菌的其他信息
SN/T1135.11—2013
马铃薯受P.pustulans为害一般会在储藏期潜伏1～2个月发病，发病后块茎上有紫黑色、略微凸起的斑点形成。症状如图A.1所示。这类紫黑色突起斑点可以聚集在芽眼和损坏的表皮周围产生，病斑可深入表皮1mm2mm，也可在受感染块茎的表面上随机分布。芽眼中的幼芽可能会被杀死，块茎会失去繁殖能力。在块茎表面如果先前有表皮损坏，有时会形成较大的坏死区域。如果种植了带有受损幼的马铃馨块茎，植株的发育会延退，分布也不均匀图A.1马铃薯块茎受害症状（引自StuartCarnegie）A.2寄主范围
主要寄主马铃薯（Solanumtuberosum），次要寄主茄属植物（SolanumL.）。A.3地理分布
爱沙尼亚、德国、爱尔兰、立陶宛、南斯拉夫、挪威、罗马尼亚、俄罗斯、英国、南非、加拿大、美国、澳大利亚、新西兰。
A.4培养基
马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）：去皮马铃薯200g：切碎，加适量蒸馏水煮沸20min左右.双层纱布过滤，在滤汁中加人葡萄糖20g、琼脂18g·继续煮至琼脂完全溶化后，加蒸馏水补足1000mL，121℃，高压灭菌20min。
SN/T1135.11—2013
附录B
（资料性附录）
DNA提取方法
将分离获得的真菌，收集菌丝放入1,5mL浸在液氮里的离心管中，用塑料杆碾碎待用。离心管加人300mL~500μLCTAB缓冲液（其中含0.1g蛋白酶K）混匀，65℃水浴1h13000g离心5min~10min，保留上清液；加500μL三氯甲烷：异戊醇（体积比为24：1）混勾，13000g离心5min~10min，保留上清液；再加500μL三氯甲烷：异戊醇（体积比为241）混，13000g离心5min~10min，保留上清液，加人1mL异丙醇混，-70℃下放置1h，或-20℃过夜：13000g离心30min，可见DNA沉淀；70%乙醇洗DNA沉淀，室温干燥：用30mL~50μLTris-EDTA缓冲液溶解DNA，待用。
附录C
（规范性附录）
马铃薯皮斑病菌形态图
分生孢子和分生孢子链（杜洪忠拍摄）SN/T1135.11—2013
SN/T1135.11—2013
参考文献
[1]CompendiumofPatatoDiseases.SecondEdition2o01.[2] Hide G.A.,Ibrahim L..Infection of potato stem bases,stolons and tubers by Polyscytalumpustulans(Owen &.Wakef.)Ellis and development of sclerotie.Potato-Research.1994,37(1):35-42.[3]Carnegie S.F.,Cameron A.M..Occurrence of Polyscytalim pustulans,Phoma foveata andFu.sarium solani var.coeruleumin fieldsoilsin Scotland.PlantPathology.1990,39(3).517-523Carnegie S.F.,Cameron A.M..Contamination of healthy seed tubers by Polyscytalum pus-［4]
tulans and Phoma erigua var.foveata in potato stores,Potato Research.1987,30.l,79-88.[5]
QuarantinePestsforEurope.SecondEdition,1997.CABI.CropProtectionCompendium2007.Vico I.,KrsticB.,StojanovicG..THEOCCURRENCE OFPOLYSCITALUMPUSPULANSONPOTATOESINYUGOSLAVIA.ISHSActaHorticulturae.462:339-343.[8]
Carnegie S.F.,Cameron A.M..Oceurrence of Polyscytalum pustulans,Phoma foueata andFusarium solani var.coeraleum in field soils in Scotland.Plantpathology.1990,39,517-523.[9]Hide G.A.,Hirst J.M..Stedman O.J..Effects of skin spot(Oospora pustulans) on potatos.Ann.appl.biol.197373:151-162.[1o]Lees A.K.,Sullivan L..Cullen D.W..A QuantitativePolymerase Chain Reaction Assay forthe Detection of Polyscytalum pustulans,the Cause of Skin Spot Disease of Potato.J.Phytopathol.2009,157(3)：154-158.
书号：155066：2-26930
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