SN/T 1611-2013
基本信息
标准号： SN/T 1611-2013
中文名称：南方菜豆花叶病毒血清学检测方法
标准类别：商检行业标准(SN)
标准状态：现行
出版语种：简体中文
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标准分类号
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标准简介
SN/T 1611-2013 南方菜豆花叶病毒血清学检测方法
SN/T1611-2013
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标准内容
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T1611-2013
代替SN/T1611-—2005
南方菜豆花叶病毒血清学检测方法Serological detection methods of Southern bean mosaic virus2013-11-06发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2014-06-01实施
本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准代替SN/T1611—2005南方菜豆花叶病毒血清学检测方法》。本标准与SN/T1611一2005相比，主要技术变化如下：一增加了免疫电镜检测方法；
增加了免疫捕获RT-PCR验证方法；增加了南方菜豆花叶病毒相关资料的附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国上海出人境检验检疫局。本标准主要起草人：于翠、杨翠云、胡培龙、陶庭典、印丽萍。本标准所代替标准的历次版本发布情况为：SN/T1611-—2005。
SN/T1611-2013
1范围
南方菜豆花叶病毒血清学检测方法SN/T1611—2013
本标准规定了植物检疫中南方菜豆花叶病毒基于血清学的DAS-ELISA、免疫电镜和免疫捕获RT-PCR等检测方法。
本标准适用于进出境豆科植物种子、苗木及传毒介体中南方菜豆花叶病毒的检测。2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。SN/T2122进出境植物及植物产品检疫抽样SN/T1840植物病毒免疫电镜检测方法3南方菜豆花叶病毒基本信息
中文名：南方菜豆花叶病毒
异名：菜豆花叶病毒4号Beanmosaicvirus4；南方菜豆花叶病毒1号Southernbeanmosaicvirusl：菜豆南方花叶病毒Bean southern mosaie virus。英文名.Southernbeanmosaigvirus缩写：SBMV
分类地位：南方菜豆花叶病毒属Sobemovirus传播途径：病毒可能以循环型方式由叶甲传播。菜豆种传机率1%~5%，虹豆种传机率为5%~～40%。实验中易于机械接种传播
该病毒的其他相关资料参见附录4原理
SBMV是直径约30nm的球状粒子，为有效的免疫源，可制备高效价的抗血清。在此基础上建立了DAS-ELISA和免疫电镜检测方法。病毒为单分体基因组，根据保守序列设计特异性引物，建立了免疫捕获RT-PCR验证方法。
5仪器设备和主要试剂
5.1仪器设备
PCR仪、酶标仪、洗板机、电子天平（感量1/1000g）、电泳仪、电泳槽、凝胶成像系统、电子透射显微镜、水浴锅、高速冷冻离心机、台式小型离心机、一80℃超低温冰箱、高压灭菌锅、制冰机、微波炉、旋涡振荡器。
5.2试剂
除有特殊说明外，所有实验用试剂均为分析纯。南方菜豆花叶病毒血清学检测试剂盒、RNA反转1
SN/T1611—2013
录酵、PCR缓冲液、dNTPs（dATP、dTTP、dCTP、dGTP）、TaqDNA聚合酶、DNA分子标记、溴化乙锭、琼脂糖、溴酚蓝等。试剂配制见附录B。6检测鉴定方法
6.1样品制备
6.1.1待测样品为小苗时，挑选有疑似症状的植物的不同部位研磨后加人抽提缓冲液，离心取上清待用。没有症状或无法观察症状的植物产品，应按比例取样。抽样比例及方法见SN/T2122，症状描述参见附录A。
6.1.2待检测的样品为种子时，挑选表皮皱缩、变小的种子研磨器打碎后加人样品抽提缓冲液，充分浸泡后高心取上清待用。
2双抗体酶联免疫吸附测定方法（DAS-ELISA）6.2
6.1制备的上清液用于DAS-ELISA检测。同时，设置阴性对照、阳性对照和空白对照，阴性对照(如种子或叶片)应尽量与所检测样品类型相一致。具体操作过程见附录C。3免疫捕获RT-PCR检测(IC-RT-PCR）6.3
PCR管包被南方菜豆花叶病毒抗血清后，加入6.1制备的上清液，进行免疫捕获。IC-RT-PCR具体操作步骤见附录D。
6.4免疫电镜检测
按照SN/T1840中的方法进行电镜观察。如观察到直径为30nm的球状病毒粒子，即可判定免疫电镜结果阳性。
7结果判定
7.1样品经DAS-ELISA检测为阴性，判定样品不携带南方菜豆花叶病毒。7.2样品经DAS-ELISA检测结果为阳性，可经免疫电镜、IC-RT-PCR进行复验，若其中之一结果为阳性，可判定样品携带南方菜豆花叶病毒。8样品与记录结果保存
8.1样品经登记和经手人签字后妥善保存。经检测确定携带南方菜豆花叶病毒的样品应保存在适合的条件下以备复核。如种子保存在干燥条件下，种苗等样品保存在一20冰箱中，有条件的保存在一80冰箱中。做好登记和标记工作。8.2记录包括：样品来源、种类、取样人员、实验的时间、地点、方法和结果、检验检疫员的签字等。酶联免疫吸附测定法检测应有酶联板反应的数值，免疫电镜应有病毒粒子的照片，PCR检测应有电泳结果照片及序列测定分析数据等。
A.1分布
附录A
（资料性附录）
南方菜豆花叶病毒相关资料
SN/T1611-2013
SBMV多发生在美洲的热带、温带地区，如美国（加州、佛罗里达，乔治亚州、路易斯安那，马里兰）、墨西哥，哥斯达黎加等，非洲的贝宁湾、加纳、尼日利亚、塞内加尔、多哥也有发生。法国和巴西有报道SBMV侵染菜豆，印度报道SBMV感染黑绿豆。A.2寄主范围
寄主范围窄，除于日红（Gomphrenaglobosa）外，只有豆科植物是易感寄主。能自然侵染菜豆（Phaseolusuulgaris）虹豆（Vignaunguiculata）、黑吉豆（V.mungo）和大豆（Glycinema）等。A,3为害症状
菜豆：B株系和M株系引发局部褪绿斑或局部坏死，有些可系统侵染，有些不能系统侵染。菜豆上的系统侵染根据奇主的不同变种，其症状有轻重。轻者引起微弱花叶，重者造成严重花叶甚至新叶畸变。G株系通常诱发无症状表现的系统侵染。C株系通常不侵染莱豆。棉豆（Phaseoluslunatus）：B株系诱发产生小坏死斑。其他株系不撤感。大豆：许多株系可引起症状较弱的系统斑驳。绿豆（Vignaradiata）：株系G引起局部小坏死斑，有些分离物引起系统花叶。虹豆：株系C和株系G在某些过敏品种引起局部枯斑，株系C偶尔引起系统侵染。系统症状表现为明脉，花叶，畸叶。
A.4粒体形态
病毒粒子为等轴对称的二十面体（T=3），无包膜，直径约为30nm，有180个蛋白亚基。A.5基因组
单分体基因组，病毒RNA的3端既无Poly(A)也无类似tRNA结构，其5端有一个VPg，可能是侵染所必需的。病毒的RNA有4个ORF，分别编码21kDa蛋白、105kDa蛋白（推测为聚合酶）、18kDa蛋白和30kDa蛋白。
SN/T1611—2013
B.110×PBST缓冲液（pH7.4)
氯化（NaCI）
磷酸二氢钾（KHPO,）
磷酸氢二钠（Na.HPO.）
氯化钾（KCD
吐温20（Tween-20）
附录B
（规范性附录）
试剂配制
溶于900mL的蒸馏水中，用浓盐酸（HCI)调节pH至7.4，并定容至1000mL。样品抽提缓冲液（pH7.4）
亚硫酸纳（NazSO:）
聚乙烯基吡咯烷酮（PVP）
叠氮化钠（NaN）
吐温20（Tween-20）
溶于900mL的1×PBST中，用HC调节pH至7.4.定容至1000mL。包被抗体缓冲液（pH9.6）
碳酸钠（NaCO）
碳酸氢钠（NaHCO：）
溶解于900mL蒸馏水中，用浓盐酸（HCl)调节pH至9.6.并定容至1000mL。酶标抗体缓冲液（PH7.4）
1XPBST缓冲液
牛血清白蛋白（BSA)
聚乙烯基吡略烷酮（PVP）
用1XPBST缓冲液定容至1000mL。底物（pNPP)缓冲液（pH9.8）
二乙醇胺
叠氨化钠（NaNa）
溶解于600mL的无菌蒸馈水中，用浓盐酸（HCI)调节pH至9.8.然后用蒸馏水定容至1000mL。4
反应终止液
氢氧化钠（NaOH）120g溶于1000mL的无菌蒸馏水中，浓度3mol/L。电泳缓冲液TAE（50×）
三羟甲基氨基甲烷（Tris）
冰乙酸
o.5mol/L乙二胺四乙酸钠（EDTA)）用时加蒸馏水稀释至1XTAE。
SN/T1611—2013
SN/T1611-2013
C.1检测
附录C
（规范性附录）
双抗体酶联免疫吸附测定方法（DAS-ELISA）C.1.1根据检测需要将适量的孔条放于酶联板架上，包括2个阳性对照孔，2个阴性对照孔，2个空白对照孔和多个待检测样品孔。待测样品孔重复两次。C.1.2每孔加人100μL的SBMV的包被抗体溶液，封口膜包好，37孵育2h～4h（或4℃冰箱过）。
C.1.3将酶联板孔中溶液控干，用200μL的1×PBST洗涤液洗涤酶联板3次，每次3min，然后在干净毛巾或滤纸上扣干。
C.1.4将100μL制备的待测样品溶液加人到设计的待检测孔中，对照孔中也各加人100μL相应的阴性对照、阳性对照和空白对照。封口膜包好，37℃孵育2h～3h（或4℃冰箱过夜）。C.1.5洗涤，步骤同C.1.3
C.1.6用酶标抗体稀释缓冲液按照要求稀释碱性磷酸酶标记的抗体，每孔加人100L，射口膜包好，并于37℃孵育2h~4h。
C.1.7洗涤，步同C.1.3
C.1.8将pNPP溶于底物缓冲液中，使最终浓度为1mg/mL。每孔加人100μL配好的底物溶液，室温孵育0.5h~2h。必要时每孔加人50μL的3mol/L氢氧化钠溶液终止反应。9酶标仪405nm波长下检测各孔的吸收值并记录。C.1.9
2质量控制和结果判定
C.2.1质量控制要求
缓冲液孔和阴性对照孔的ODos值小于0.15，阴性对照孔的ODos值小于0.05时，按0.05计算。阳性对照有明显的颠色反应，孔的重复性以样品OD值的平行允许率控制，按服式（C.1）进行计算：OD-OD
P=(OD:+OD)×1/2
2×100%
式中：
—平行允许率；
OD，——重复样品1；
OD重复样品2。
....(C.)
当重复检测样品OD值平行允许率(P)小于20%时，判定检测结果有效。C.2.2
结果判定
若满足不了C.2.1的质量要求，则不能进行结果判定、在满足了C.2.1的质量要求后，则按如下原则作出判定样品OD4s/阴性对照ODs值明显大于2.结果判定为阳性样品OD4s/阴性对照OD40s值在阔值附近，判为可疑样品，需重做一次或者用其他方法进行验证，样品OD40s/阴性对照OD40s值明显小于2，判为阴性。6
引物序列
附录D
（规范性附录）
免疫捕获RT-PCR检测方法
SBMV-F1:5-ACTTGTCTGAGGGCAAGTG-3SBMV-RI.5-GTGTCAGCCATATCATATTGG-3扩增片段大小为580bp。
2抗体吸附
SN/T1611—2013
将SBMV抗体用包被缓冲液做适量稀释，吸取100uL包被PCR管，37℃孵育2h；用PBST洗3次，取样品50mg，加人样品抽提缓冲液进行研磨，吸取100μL包被PCR管，4℃过夜（或37℃，孵育2h），PBST洗3次，RNase-freeddH,O洗1次，短暂离心后吸去管底余液。3反转录
直接在吸附了病毒的PCR管中进行反转录。反转录体系总体积为20μL，其中1μL反向引物(20μmol/L）4μL5XAMV酶缓冲液，2μLdNTP（10mmol/L），1lμLRNasefreeddH，O，稍离心混匀后，置85℃变性5min，迅速置冰上2min~3min，然后加人1μLAMV反转录酶（5U/μL），1μLRNA酶抑制剂(40U/μL），42℃反应1h。D.4
PCR扩增
PCR反应体系见表D.1，每个样品设2个平行处理。反应体系中各试剂的量可根据具体情况或不同的反应总体积进行适当调整。检测时以含南方菜豆花叶病毒材料的cDNA或含有南方菜豆花叶病毒目标片断的质粒作为阳性对照，以健康植物材料作为阴性对照，以水代替模板作为空白对照。PCR反应条件：94℃4min；94℃30s，55℃45s，72℃45s35个循环；72℃10min延伸。表D.1PCR反应体系
组成成分
PCR缓冲液
上游引物
下游引物
Taq酶
无菌水
总体积
储存渡浓度
2.5mmol/LbzxZ.net
10μmol/L
10μmol/L
终浓度
200μmol/L
0.2μmol/L
0.2μmol/L
0.05U/μL
加样量
SN/T1611—2013
SPCR扩增产物的电泳检测
用电泳缓冲液配制1.5%的琼脂糖凝胶（55℃～60℃时加人漠化乙链至终浓度为0.5μg/mL，也可在电泳后进行染色）。在电泳槽中加人电泳缓冲液，使液面刚刚没过凝胶。将9μLPCR扩增产物，加1uL10×上样缓冲液上样。恒压5V/cm~6V/cm电泳40min~50min。凝胶成像系统中观察电泳结果，拍照并记录结果。
结果判定
D.6.1如果阴性对照和空白对照未出现条带，阳性对照出现预期大小的条带，样品未出现预期大小的条带，则IC-RT-PCR结果阴性
D.6.2如果阴性对照和空白对照正确，待测样品出现与阳性对照一致的预期大小的扩增条带，则ICRT-PCR检测结果阳性。若需要，可通过测序分析对阳性结果进一步确证。1
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代替SN/T1611-—2005
南方菜豆花叶病毒血清学检测方法Serological detection methods of Southern bean mosaic virus2013-11-06发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2014-06-01实施
本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准代替SN/T1611—2005南方菜豆花叶病毒血清学检测方法》。本标准与SN/T1611一2005相比，主要技术变化如下：一增加了免疫电镜检测方法；
增加了免疫捕获RT-PCR验证方法；增加了南方菜豆花叶病毒相关资料的附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国上海出人境检验检疫局。本标准主要起草人：于翠、杨翠云、胡培龙、陶庭典、印丽萍。本标准所代替标准的历次版本发布情况为：SN/T1611-—2005。
SN/T1611-2013
1范围
南方菜豆花叶病毒血清学检测方法SN/T1611—2013
本标准规定了植物检疫中南方菜豆花叶病毒基于血清学的DAS-ELISA、免疫电镜和免疫捕获RT-PCR等检测方法。
本标准适用于进出境豆科植物种子、苗木及传毒介体中南方菜豆花叶病毒的检测。2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。SN/T2122进出境植物及植物产品检疫抽样SN/T1840植物病毒免疫电镜检测方法3南方菜豆花叶病毒基本信息
中文名：南方菜豆花叶病毒
异名：菜豆花叶病毒4号Beanmosaicvirus4；南方菜豆花叶病毒1号Southernbeanmosaicvirusl：菜豆南方花叶病毒Bean southern mosaie virus。英文名.Southernbeanmosaigvirus缩写：SBMV
分类地位：南方菜豆花叶病毒属Sobemovirus传播途径：病毒可能以循环型方式由叶甲传播。菜豆种传机率1%~5%，虹豆种传机率为5%~～40%。实验中易于机械接种传播
该病毒的其他相关资料参见附录4原理
SBMV是直径约30nm的球状粒子，为有效的免疫源，可制备高效价的抗血清。在此基础上建立了DAS-ELISA和免疫电镜检测方法。病毒为单分体基因组，根据保守序列设计特异性引物，建立了免疫捕获RT-PCR验证方法。
5仪器设备和主要试剂
5.1仪器设备
PCR仪、酶标仪、洗板机、电子天平（感量1/1000g）、电泳仪、电泳槽、凝胶成像系统、电子透射显微镜、水浴锅、高速冷冻离心机、台式小型离心机、一80℃超低温冰箱、高压灭菌锅、制冰机、微波炉、旋涡振荡器。
5.2试剂
除有特殊说明外，所有实验用试剂均为分析纯。南方菜豆花叶病毒血清学检测试剂盒、RNA反转1
SN/T1611—2013
录酵、PCR缓冲液、dNTPs（dATP、dTTP、dCTP、dGTP）、TaqDNA聚合酶、DNA分子标记、溴化乙锭、琼脂糖、溴酚蓝等。试剂配制见附录B。6检测鉴定方法
6.1样品制备
6.1.1待测样品为小苗时，挑选有疑似症状的植物的不同部位研磨后加人抽提缓冲液，离心取上清待用。没有症状或无法观察症状的植物产品，应按比例取样。抽样比例及方法见SN/T2122，症状描述参见附录A。
6.1.2待检测的样品为种子时，挑选表皮皱缩、变小的种子研磨器打碎后加人样品抽提缓冲液，充分浸泡后高心取上清待用。
2双抗体酶联免疫吸附测定方法（DAS-ELISA）6.2
6.1制备的上清液用于DAS-ELISA检测。同时，设置阴性对照、阳性对照和空白对照，阴性对照(如种子或叶片)应尽量与所检测样品类型相一致。具体操作过程见附录C。3免疫捕获RT-PCR检测(IC-RT-PCR）6.3
PCR管包被南方菜豆花叶病毒抗血清后，加入6.1制备的上清液，进行免疫捕获。IC-RT-PCR具体操作步骤见附录D。
6.4免疫电镜检测
按照SN/T1840中的方法进行电镜观察。如观察到直径为30nm的球状病毒粒子，即可判定免疫电镜结果阳性。
7结果判定
7.1样品经DAS-ELISA检测为阴性，判定样品不携带南方菜豆花叶病毒。7.2样品经DAS-ELISA检测结果为阳性，可经免疫电镜、IC-RT-PCR进行复验，若其中之一结果为阳性，可判定样品携带南方菜豆花叶病毒。8样品与记录结果保存
8.1样品经登记和经手人签字后妥善保存。经检测确定携带南方菜豆花叶病毒的样品应保存在适合的条件下以备复核。如种子保存在干燥条件下，种苗等样品保存在一20冰箱中，有条件的保存在一80冰箱中。做好登记和标记工作。8.2记录包括：样品来源、种类、取样人员、实验的时间、地点、方法和结果、检验检疫员的签字等。酶联免疫吸附测定法检测应有酶联板反应的数值，免疫电镜应有病毒粒子的照片，PCR检测应有电泳结果照片及序列测定分析数据等。
A.1分布
附录A
（资料性附录）
南方菜豆花叶病毒相关资料
SN/T1611-2013
SBMV多发生在美洲的热带、温带地区，如美国（加州、佛罗里达，乔治亚州、路易斯安那，马里兰）、墨西哥，哥斯达黎加等，非洲的贝宁湾、加纳、尼日利亚、塞内加尔、多哥也有发生。法国和巴西有报道SBMV侵染菜豆，印度报道SBMV感染黑绿豆。A.2寄主范围
寄主范围窄，除于日红（Gomphrenaglobosa）外，只有豆科植物是易感寄主。能自然侵染菜豆（Phaseolusuulgaris）虹豆（Vignaunguiculata）、黑吉豆（V.mungo）和大豆（Glycinema）等。A,3为害症状
菜豆：B株系和M株系引发局部褪绿斑或局部坏死，有些可系统侵染，有些不能系统侵染。菜豆上的系统侵染根据奇主的不同变种，其症状有轻重。轻者引起微弱花叶，重者造成严重花叶甚至新叶畸变。G株系通常诱发无症状表现的系统侵染。C株系通常不侵染莱豆。棉豆（Phaseoluslunatus）：B株系诱发产生小坏死斑。其他株系不撤感。大豆：许多株系可引起症状较弱的系统斑驳。绿豆（Vignaradiata）：株系G引起局部小坏死斑，有些分离物引起系统花叶。虹豆：株系C和株系G在某些过敏品种引起局部枯斑，株系C偶尔引起系统侵染。系统症状表现为明脉，花叶，畸叶。
A.4粒体形态
病毒粒子为等轴对称的二十面体（T=3），无包膜，直径约为30nm，有180个蛋白亚基。A.5基因组
单分体基因组，病毒RNA的3端既无Poly(A)也无类似tRNA结构，其5端有一个VPg，可能是侵染所必需的。病毒的RNA有4个ORF，分别编码21kDa蛋白、105kDa蛋白（推测为聚合酶）、18kDa蛋白和30kDa蛋白。
SN/T1611—2013
B.110×PBST缓冲液（pH7.4)
氯化（NaCI）
磷酸二氢钾（KHPO,）
磷酸氢二钠（Na.HPO.）
氯化钾（KCD
吐温20（Tween-20）
附录B
（规范性附录）
试剂配制
溶于900mL的蒸馏水中，用浓盐酸（HCI)调节pH至7.4，并定容至1000mL。样品抽提缓冲液（pH7.4）
亚硫酸纳（NazSO:）
聚乙烯基吡咯烷酮（PVP）
叠氮化钠（NaN）
吐温20（Tween-20）
溶于900mL的1×PBST中，用HC调节pH至7.4.定容至1000mL。包被抗体缓冲液（pH9.6）
碳酸钠（NaCO）
碳酸氢钠（NaHCO：）
溶解于900mL蒸馏水中，用浓盐酸（HCl)调节pH至9.6.并定容至1000mL。酶标抗体缓冲液（PH7.4）
1XPBST缓冲液
牛血清白蛋白（BSA)
聚乙烯基吡略烷酮（PVP）
用1XPBST缓冲液定容至1000mL。底物（pNPP)缓冲液（pH9.8）
二乙醇胺
叠氨化钠（NaNa）
溶解于600mL的无菌蒸馈水中，用浓盐酸（HCI)调节pH至9.8.然后用蒸馏水定容至1000mL。4
反应终止液
氢氧化钠（NaOH）120g溶于1000mL的无菌蒸馏水中，浓度3mol/L。电泳缓冲液TAE（50×）
三羟甲基氨基甲烷（Tris）
冰乙酸
o.5mol/L乙二胺四乙酸钠（EDTA)）用时加蒸馏水稀释至1XTAE。
SN/T1611—2013
SN/T1611-2013
C.1检测
附录C
（规范性附录）
双抗体酶联免疫吸附测定方法（DAS-ELISA）C.1.1根据检测需要将适量的孔条放于酶联板架上，包括2个阳性对照孔，2个阴性对照孔，2个空白对照孔和多个待检测样品孔。待测样品孔重复两次。C.1.2每孔加人100μL的SBMV的包被抗体溶液，封口膜包好，37孵育2h～4h（或4℃冰箱过）。
C.1.3将酶联板孔中溶液控干，用200μL的1×PBST洗涤液洗涤酶联板3次，每次3min，然后在干净毛巾或滤纸上扣干。
C.1.4将100μL制备的待测样品溶液加人到设计的待检测孔中，对照孔中也各加人100μL相应的阴性对照、阳性对照和空白对照。封口膜包好，37℃孵育2h～3h（或4℃冰箱过夜）。C.1.5洗涤，步骤同C.1.3
C.1.6用酶标抗体稀释缓冲液按照要求稀释碱性磷酸酶标记的抗体，每孔加人100L，射口膜包好，并于37℃孵育2h~4h。
C.1.7洗涤，步同C.1.3
C.1.8将pNPP溶于底物缓冲液中，使最终浓度为1mg/mL。每孔加人100μL配好的底物溶液，室温孵育0.5h~2h。必要时每孔加人50μL的3mol/L氢氧化钠溶液终止反应。9酶标仪405nm波长下检测各孔的吸收值并记录。C.1.9
2质量控制和结果判定
C.2.1质量控制要求
缓冲液孔和阴性对照孔的ODos值小于0.15，阴性对照孔的ODos值小于0.05时，按0.05计算。阳性对照有明显的颠色反应，孔的重复性以样品OD值的平行允许率控制，按服式（C.1）进行计算：OD-OD
P=(OD:+OD)×1/2
2×100%
式中：
—平行允许率；
OD，——重复样品1；
OD重复样品2。
....(C.)
当重复检测样品OD值平行允许率(P)小于20%时，判定检测结果有效。C.2.2
结果判定
若满足不了C.2.1的质量要求，则不能进行结果判定、在满足了C.2.1的质量要求后，则按如下原则作出判定样品OD4s/阴性对照ODs值明显大于2.结果判定为阳性样品OD4s/阴性对照OD40s值在阔值附近，判为可疑样品，需重做一次或者用其他方法进行验证，样品OD40s/阴性对照OD40s值明显小于2，判为阴性。6
引物序列
附录D
（规范性附录）
免疫捕获RT-PCR检测方法
SBMV-F1:5-ACTTGTCTGAGGGCAAGTG-3SBMV-RI.5-GTGTCAGCCATATCATATTGG-3扩增片段大小为580bp。
2抗体吸附
SN/T1611—2013
将SBMV抗体用包被缓冲液做适量稀释，吸取100uL包被PCR管，37℃孵育2h；用PBST洗3次，取样品50mg，加人样品抽提缓冲液进行研磨，吸取100μL包被PCR管，4℃过夜（或37℃，孵育2h），PBST洗3次，RNase-freeddH,O洗1次，短暂离心后吸去管底余液。3反转录
直接在吸附了病毒的PCR管中进行反转录。反转录体系总体积为20μL，其中1μL反向引物(20μmol/L）4μL5XAMV酶缓冲液，2μLdNTP（10mmol/L），1lμLRNasefreeddH，O，稍离心混匀后，置85℃变性5min，迅速置冰上2min~3min，然后加人1μLAMV反转录酶（5U/μL），1μLRNA酶抑制剂(40U/μL），42℃反应1h。D.4
PCR扩增
PCR反应体系见表D.1，每个样品设2个平行处理。反应体系中各试剂的量可根据具体情况或不同的反应总体积进行适当调整。检测时以含南方菜豆花叶病毒材料的cDNA或含有南方菜豆花叶病毒目标片断的质粒作为阳性对照，以健康植物材料作为阴性对照，以水代替模板作为空白对照。PCR反应条件：94℃4min；94℃30s，55℃45s，72℃45s35个循环；72℃10min延伸。表D.1PCR反应体系
组成成分
PCR缓冲液
上游引物
下游引物
Taq酶
无菌水
总体积
储存渡浓度
2.5mmol/LbzxZ.net
10μmol/L
10μmol/L
终浓度
200μmol/L
0.2μmol/L
0.2μmol/L
0.05U/μL
加样量
SN/T1611—2013
SPCR扩增产物的电泳检测
用电泳缓冲液配制1.5%的琼脂糖凝胶（55℃～60℃时加人漠化乙链至终浓度为0.5μg/mL，也可在电泳后进行染色）。在电泳槽中加人电泳缓冲液，使液面刚刚没过凝胶。将9μLPCR扩增产物，加1uL10×上样缓冲液上样。恒压5V/cm~6V/cm电泳40min~50min。凝胶成像系统中观察电泳结果，拍照并记录结果。
结果判定
D.6.1如果阴性对照和空白对照未出现条带，阳性对照出现预期大小的条带，样品未出现预期大小的条带，则IC-RT-PCR结果阴性
D.6.2如果阴性对照和空白对照正确，待测样品出现与阳性对照一致的预期大小的扩增条带，则ICRT-PCR检测结果阳性。若需要，可通过测序分析对阳性结果进一步确证。1
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