SN/T 3724-2013 进出口食品中幽门螺杆菌的检验方法 SN/T3724-2013 标准压缩包解压密码：www.bzxz.net

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T3724—2013
出口食品中幽门螺杆菌的检验方法Determination of Helicobacter pylori in food for export2013-11-06发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2014-06-01实施
中华人民共和国出人境检验检疫行业标准
出口食品中幽门螺杆菌的检验方法SN/T3724—2013
中国标准出版社出版
北京市朝阳区和平里西街甲2号（100029）北京市西城区三里河北街16号（100045）总编室：（010）64275323
网址spc.net.cn
中国标准出版社秦皇岛印剧厂印刷开本880×12301/16
2014年4月第一版
字数18千字
2014年4月第一次印刷
印数1-1600
书号：155066·2-26880
定价16.00元
本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。SN/T3724-—2013
本标准起草单位：中华人民共和国江苏出人境检验检疫局、浙江疾病预防控制中心、南京农业大学南京工业大学、中国疾病预防控制中心传染病预防控制所、中华人民共和国上海出入境检验检疫局、福建医科大学、安徽农业大学、上海辉容生物科技有限公司起草本标准主要起草人：祝长青、王毅谦、易海华、金大智、黄明、孙芸、张舒亚、郭桂萍、蒋原、张建中、栾军、周阳、郭云昌、邵景东、曹瑞兵、李能、韩伟、牛雯、付瑞燕、李辉、刘国栋、吴福平。1范围
出口食品中幽门螺杆菌的检验方法本标准规定了食品中幽门螺杆菌HelicobacterPylori）的检验方法。本标准适用于食品中幽门螺杆菌的检验。2设备和材料
冰箱：2℃~8℃。
恒温培养箱：25℃±1℃.37℃±1℃，42℃±1℃。微需氧培养装置：提供微需氧条件（5%O2.10%CO，和85%N，）。拍击均质器。
电子天平：感量0.1g。
无菌培养：直径为90mm。
培养基和试剂
改良脑心浸出液肉汤（mBHIB)：见附录A中A.1。改良脑心浸出液血琼脂（mBHIA）：见A,2。氧化酶试剂：见A.3。
改良半固体培养基：见A.4。
尿素酶试剂：见A.5。
马尿酸水解的试剂：见A.6。
硝酸盐试剂：见A.7。
吲哚乙酸酯纸片：见A.8。
甘氨酸。
硝酸钾。
氯化钠。
3%过氧化氢溶液。
生化鉴定试剂盒。
4检验程序
食品中门螺杆菌的检验程序见图1。SN/T3724-2013
SN/T3724—2013
水色镜栓
5操作步骤
5.1增菌
机化试验
过氧化氧能试验
跟确试验
样品25g(mL)加入225mLmBHIB
37±1℃
微需氧条件，48h72h
接种mBHIA平板
371℃
微萄氧
生长试验
微需氧条件，48h~72b
有儿生长成装
幽门螺杆菌检验程序
蒙化钠生长
尿酸盐
无菌操作条件下取25g（mL）样品于225mL改良脑心浸出液肉汤中，在带有滤网的均质袋中拍打均质2min～3min，将滤过液进行培养，如使用无滤网的均质袋可用无菌纱布进行过滤。在微需氧条件下，滤过液37℃1C振荡培养48h72h5.2分离培养
将48h增菌液、72h增菌液划线接种于改良脑心浸出液血琼脂平板上微需氧条件下37℃土1℃培养48h~72h。
5.3可疑菌落的挑选
观察平板上的菌落形态，幽门螺杆菌在改良脑心浸没出液血琼脂的典型菌落为菌落细小、呈针尖状、透明湿润、不溶血。挑取mBHIA平板上至少5个（如少于5个则全部挑取）可疑菌落划线接种到无抗生素的脑心浸出液血平板上，微需氧条件下37C土1℃培养48h～72h，按照5.4.1～5.4.10进行鉴定，结果符合表1者的可菌落确定为幽门螺杆菌2
形态观察，镜检
氧化酶试验
过氧化氢酶试验
脲酶试验
微需氧条件下25℃±1℃生长试验有氧条件下37℃±1C生长实验
微需氧条件下42℃±I℃生长试验1%甘氨酸生长试验
硝酸盐还原试验
3.5%氯化钠生长试验
马尿酸盐水解试验
呵哚乙酸酯水解试验
5.4幽门螺杆菌的鉴定
形态观察
幽门螺杆菌的鉴定
鉴定特性
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革兰氏染色阴性短杆状、弯曲状和海鸥展翅状阳性
不生长
不生长
不生长
不生长
不生长
挑取可疑菌落进行革兰氏染色，镜检。显微镜下可见革兰氏染色阴性细菌，呈螺旋状，逗点状或海鸥展翅状等，
氧化酶试验
用铂/铱接种环或玻璃棒挑取可疑菌落至氧化酶试剂润湿的滤纸上如果在10$内出现深蓝或黑色反应者为阳性。
5.4.3过氧化氢酶试验
在载玻片上滴加1滴3%过氧化氢溶液，刮取一环可疑菌落置人后，半分钟内发生气泡者判为阳性。
5.4.4脲酶试验
取2%尿素溶液和酚红磷酸缓冲液各3滴，刮取较多个菌落，混勾后置25℃士1℃水浴中温育4h，观察颜色的变化。呈红色者为阳性。5.4.5微需氧条件下25℃生长试验挑取可疑菌落，接种到无抗生素的脑心浸出液血平板上，微需氧条件下25℃土1℃培养44h士4h，观察细菌生长情况。
5.4.6有氧条件下37℃生长试验
挑取可疑菌落，接种到无抗生素的脑心浸出液血平板上，有氧条件下37℃±1℃培养44h土4h，观察细菌生长情况。
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5.4.7微需氧条件下42℃生长试验挑取可疑菌落，接种到无抗生素的脑心浸出液血平板上，微需氧条件下42℃士1℃培养44h土4h，观察细菌生长情况。
5.4.8改良半固体培养基中生长情况在添加有以下生化试剂的改良半固体培养基表面接种0.1mL菌悬液，微需氧下37℃士1℃培养3d，硝酸盐培养基培养5d。若有生长，应是仅在培养基表面形成狭窄条带状生长，反应情况如下a）：1%甘氨酸：有菌落生长为阳性；6）3.5%氯化钠：有函落生长为阳性：硝酸盐还原试验：培养5d后向培养基中加入硝酸盐试剂A和B，呈现红色为阳性反应c
马尿酸盐水解试验
挑取菌落，加到盛有0.4mL1%马尿酸钠的试管中制成菌悬液。混合均匀后在37℃土1℃水浴中温育2h或37℃土1℃培养箱中温育4h。沿着试管壁缓缓加入0.2mL节三酮溶液，不要振荡，在37℃土1℃的水浴或培养箱中再温育10min后判读结果。若出现深紫色则为阳性；若出现淡紫色或没有颜色变化则为阴性。
5.4.10哚乙酸酯水解试验
挑取菌落至哚乙酸酯纸片上，再滴加1滴灭菌蒸馏水。如果吲哚乙酸酯水解，则在5min一10min内出现深蓝色，若无颜色变化则表示没有发生水解。对于可疑菌落，也可使用生化鉴定试剂盒来替代5.4.1～5.4.10的鉴定，具体操作接照产品说明书进行。6结果报告
按照上述鉴定结果，报告25g(mL)样品中检出和/或未检出幽门螺杆菌。4
附录A
（规范性附录）
培养基与试剂
改良脑心漫出液肉汤（modifiedBrainHeartInfusionBroth，mBHIBA.1.1
基础培养基
牛脑浸出液：12.5g：
牛心漫出液：5.0g；
蛋白陈：10.0g；
葡葡糖：2.0g：
氯化钠：5.0g：
磷酸氢二钠：2.5g。
2制法
SN/T3724—2013
取37.0g.加1L蒸馏水，混匀、加热至溶解完全，分装到合适的容器里，将pH调至6.5士0.2，121℃灭菌15min。
无菌裂解脱纤维绵羊血
对无菌脱纤维绵羊血通过多次反复冻融进行裂解。A.1.3
抗生素溶液
A.1.3.1成分
万古霉素（vancomyein）：10mg/L：三甲氧胺嘧啶乳酸盐（trimethoprimlactate）：0.005mg/L；两性霉素B(amphotercinB)：10mg/L:多粘菌素B(polymyxinB）：0.005mg/LeA.1.3.2制法
将上述成分溶解于艺醇/灭菌水混合溶波中。4完全培养基
A.1.4.1成分
基础培养基(A,1.1)：1000mL；
无菌裂解脱纤维绵羊血（A.1.2）：50ml；抗生素溶液（A,1.3）：5mL。
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A.1.4.2制法
当基础培养基的温度约为45℃时，无菌加人绵羊血和抗生素溶液，混匀，将培养基无菌分装至合适的试管或锥形瓶中备用。配制的增菌液在常温下放置不得超过4h，或在4℃左右避光保存不得超过7d。
A.2改良脑心浸出液血琼脂（modifiedBrainHeatInfusionAgar，mBHIA）A.2.1
基础培养基
A.2.1.1成分
牛脑漫出液：12.5g；
牛心浸出液：5.0g；
蛋白陈：10.0g：www.bzxz.net
葡葡糖：2.0g：
氯化钠：5.0g；
磷酸氢二钠：2.5g
琼脂：10.0g。
A.2.1.2制法
称取47.0g.加1L蒸馏水，加热至溶解完全，分装到试管或容器里·pH调至6.5土0.2，121℃灭菌15min。
A.2.2无菌裂解脱纤维绵羊血
对无菌脱纤维绵美血通过多次反复冻融进行裂解A.2.3抗生素溶液
A.2.3.1成分
万古霉素（vancomyein）：1omg/L：三甲氧芋胺密啶乳酸盐（trimethoprimlactate)ro.oo5mg/两性霉素B(amphotercinB)：10mg/L:多粘菌素B(polymyxinB)：0.005mg/LsA.2.3.2制法
将上述成分溶解于乙醇/灭菌水混合溶液中。A.2.4完全培养基
A.2.4.1成分
基础培养基（A.2.1):1000mL；
无菌裂解脱纤维绵羊血（A.1.2）：50mL：抗生素溶液（A.1.3）：5mL。
A.2.4.2制法
SN/T3724-2013
当基础培养基的温度约为45℃时，无菌加入绵羊血和抗生素溶液，混匀后倒入无菌的培养Ⅲ中制备选择性血平板。配制的平板在常温下放置不得超过4h，或在4℃左右避光保存不得超过7d。A.3
氧化酶试剂（Reagentforthedetectionofoxidase）A.3.1成分
四甲基对苯二胺盐酸盐；1.0g:
蒸馏水：100ml。
A.3.2制法
使用前迅速将上述成分溶于水中。A.4
改良半固体培养基
无血和抗生素的脑心浸出液肉汤成分A.4.1
琼脂：37g：
生化试剂：1.8g。成分为：
硝酸钾（1%）：于250ml.半固体培养基中加人2.5g甘氨酸（1%）：于含有中性红的250ml.半固体培养基中加人2.5g：b)
氯化钠（3.5%）：于含有中性红的250mL半固体培养基中加人8.75g。A.4.2配制
煮沸基础培养基，250.0mL分装成两份。二份培养基中加人2.5mL中性红，再加人甘氨酸，氯化钠。另一份无中性红的培养基中加人硝酸钾。每份培养基调节pH值为6.00.2.分装于带螺旋帽的试管中，每支约10.0mL.121C灭菌15min。A.5
脉酶检测试剂
A.5.12%尿素溶液：称取2.0g尿素液于100mL无水乙醇中，过滤除菌。A.5.2酚红磷酸缓冲液：0.025mol/L的磷酸缓冲液100mL，加0.1%酚红水溶液0.2mL，A.6
马尿酸水解的检测试剂（Reagentsforthedetectionofhydrolysisofhippurate）A.6.1
马尿酸钠溶液
A.6.1.1成分
马尿酸钠：10.0g;
磷酸盐缓冲液(PBS)组分：
NaCl.8.5g;
NazHPO,·2H,O:8.98g;
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NaH,PO,H,O:2.71g:
蒸馏水：1000mL
A.6.1.2制法
将马尿酸钠溶于磷酸盐缓冲溶液中，过滤除菌。用合适的试管进行无菌分装，每管0.4mL，储存于-20℃。
A.6.23.5%（水合）三萌落液（质量/体积）A.6.2.1成分
（水合）节三酮Cninhydrin）：1.75g丙酮：25mL
丁醇：25mL。
A.6.2.2制备
将（水合）节三酮溶解于丙酮/丁醇混合液中。该溶液在避光冷藏时最多不超过一周。A.7
硝酸盐检测试剂
A.7.1试剂
试剂A：0.6%二甲基-α-萘胺。
试剂B0.8%对氨基苯磺酸。
将试剂A和试剂B溶于5mol/L乙酸中，A.8
吲哚Z酸酯纸片（Indoxylacetatedisc）A.8.1成分
吲噪乙酸酯：0.1g：
丙酮：1mL。
A.8.2制法
将吲哚乙酸酯溶于丙酮中吸取25μL~50ul溶液于空白纸片上（直径为0.6cm~1.2cm）。室温干燥，用带有硅胶塞的棕色试管/瓶于4℃保存。版权专有侵权必究
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