SN/T 3728-2013
基本信息
标准号： SN/T 3728-2013
中文名称：进出口食品中空肠弯曲菌快速检测方法 量子点免疫荧光法
标准类别：商检行业标准(SN)
标准状态：现行
出版语种：简体中文
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相关标签： 进出口 食品 空肠 弯曲 快速 检测 方法 量子
标准分类号
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标准简介
SN/T 3728-2013 进出口食品中空肠弯曲菌快速检测方法 量子点免疫荧光法
SN/T3728-2013
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标准内容
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T37282013
出口食品中空肠弯曲菌快速检测方法量子点免疫荧光法
Rapid determination of Camp ylobacter jejuni in food for export-Quantum dots immuno-fluorescence method2013-11-06发布
中华人民共和国
压家质量监督检验检疫总局
2014-06-01实施
本标准是按照GB/T1.1—2009给出的规则起草本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。SN/T3728—2013
本标准起草单位：中华人民共和国江苏出人境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院、合肥工业大学。
本标准主要起草人：薛峰、张睿、蒋原、曾德新、陈雷、陈颖、栾军、张鹏飞、陈伟。1范围
出口食品中空肠弯曲菌快速检测方法量子点免疫荧光法
本标准规定了出口食品中空肠弯曲菌的量子点免疫荧光检测方法。本标准适用于出口食品中空肠弯曲菌的快速检测2规范性引用文件
SN/T3728—2013
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T4789.9食品微生物学检验空肠弯曲菌检验GB19489实验室生物安全通用要求3生物安全措施
为了保护实验室人员的安全，应由具备资格的工作人员检测空肠弯曲菌，所有培养物和废弃物应参照GB19489中的有关规定执行
4技术概要
本标准采用量子点免疫荧光分析技术检测空肠弯曲菌，主要包含以下步骤：a2增菌，按照GB/T4789.9方法进行样品制备和增菌。b）以免疫磁珠为载体，将菌液中的空肠弯曲菌快速富集在磁珠表面。将荧光量子点标记的空肠弯曲菌抗体与免疫磁珠富集的空肠弯曲菌溶液相互作用，利用荧光c
显微镜检测磁珠复合物表面的荧光，结果判定。5试剂和材料
表面带羧基的水溶性量子点（浓度：5μmol/L）。5.1
5.2空肠弯曲菌单克隆抗体包被的免疫磁珠（浓度约10°个磁珠/mL）。5.3
空肠弯曲菌多克隆抗体（浓度约1mg/mL）。5.41-乙基-3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺（EDC)。5.5N-羟基琥珀酸亚胺（Sulfo-NHS)。5.6
超滤离心管（截留相对分子质量：10kDa）。透析袋（截流相对分子质量：14kDa，直径1cm）。5.7
单氨基聚乙二醇（PEG-NH2，相对分子质量：5kDa）5.8
SN/T3728-2013
载玻片。
盖玻片。
空肠弯曲菌株参考菌株：CampylobacterATCC110902、ATCC110903.ATCC110904、ATCC110905PBS缓冲液：参见附录A中A.1。
PBST洗涤液：参见A.2。
MES缓冲液：参见A.3。
仪器和设备
6.1一次性手套。
6.2移液器：量程0.5μL~10μL.精度0.01μL；量程10μL~100μL，精度0.1μL；量程100μL~1000μL，精度1μ
灭菌移液器吸头。
1.5mL塑料离心管。
1.5mL离心管架。
1.5mL磁架。
高速台式离心机，转速不低于20000r/min，最大相对离心力不低于10000×g。恒温摇床，温度偏差不超过土1℃。涡旋混合器。
旋转混合器。
高压灭菌锅。
计时器。
荧光显微镜，配置有汞灯光源和600nm士20nm附近牵带滤光片。检测程序
食品中空肠弯曲菌量子点免疫荧光检测程序见图1。2
操作步骤
待测样品
选择性增菌液或待测菌株
免疫碰球富集空肠弯曲菌
然后用无菌缓冲液洗涤
磁珠重总在缓冲液中
酸基量子点活化
抗体共价偶联在量子点表面
SN/T3728-—2013
离心分离纯化量子点抗体复合物富集空肠弯曲菌的微殊与免疫量子点混合进行免疫识别反应磁性分商磁殊复合物，荧光显微镜下观察结果阴性
传统方法确认
食品中空肠弯曲菌量子点免疫荧光检测程序8.1样品制备、增菌培养
按照GB/T4789.9方法进行样品制备和增菌。8.2免疫磁珠富集
8.2.1免疫磁珠富集条件
免疫磁珠富集应该在增菌6h后进行，必要时也可以继续培养12h～18h后再分离一次。8.2.2磁珠高集病菌的操作步骤
操作过程要无菌环境下进行，避免任何外部的污染和产生气溶胶。对于8.1获得的增菌液：a)
直接取该增菌液1mL加到1.5mL无菌离心管中。分别取20μL单抗包被的免疫磁珠，1mL增菌液上清，在1.5mL无菌离心管中混合。b）
在旋转混合器上混合上述混合液，室温下，以12r/min~20r/min的速度混合30min，进行磁性免疫识别反应，
SN/T3728—2013
8.2.3分离磁珠的操作步骤
分离磁珠的操作步骤如下：
a）将8.2.1得到的磁珠悬浮液放在磁架上，轻轻动磁架，使免疫磁珠聚集到磁极b）小心打开离心管盖子，然后用移液器慢慢吸取清液，注意避免带走聚集在磁极上的免疫磁珠。然后向离心管内加人1mL灭菌的洗涤液，将离心管在涡旋混合仪上涡旋混合30s，使磁珠均c)
勾分散在洗液中，再在旋转混合器上12r/min~20r/min的速度混合10min。d）将洗涤后的珠悬浮液放在磁架上，轻轻动磁架·使免疫磁珠聚集到磁极上，然后小心打开离心管盖子，用移液器慢慢吸取上清，注意避免带走聚集在磁极上的免疫磁珠。e>
再重复上述c)、d)步骤两次
将洗涤后的免疫磁珠分散在100L灭首的洗液中，重悬磁珠-细菌复合物。f）
8.3量子点标记抗体
8.3.1量子点的选择要求
使用的量子点可以是商业产品，或者自已合成，表面只有羧基官能团，荧光发射峰在600nm左右8.3.2活化羧基量子点的具体操作步骤活化羧基量子点的操作步骤如下将10μL浓度为5μmol/L的量子点溶液，分散在100μL的MES缓冲液中，分别加人1μLa)
10mmol/L的EDC和1μL10mmol/L的Sulfo-NHS水溶液，然后30℃摇床上，200r/min见动反应30min。
将反应后的量子点溶液用PBS缓冲液稀释至500L然后用截流相对分子质量100kDa的超b)
滤离心管，2000r/min离心超滤10min超滤浓缩后的溶液中，再加人500μLPBS缓冲液，超声1min分散量子点溶液，然后重复b）c
步骤，将量子点溶波浓缩在100μL。8.3.3量子点抗体偶联的具体操作步骤量子点抗体偶联的操作步骤如下a）空肠弯曲菌多克隆抗体100μL1mg/ml，用截流相对分子质量14kDa的透析袋在PBS缓冲液中，4℃透析24h。
将透析后的抗体溶液加人步骤8.3.1得到的活化后的量子点溶液中，然后30℃摇床上，200z/b)
min晃动反应1h。
向反应体系中加人10μL质量分数为1%的PEG-NH，水溶液，继续30℃摇床上，200r/minc
晃动反应1h。
8.3.4分离纯化量子点-抗体复合物的具体操作步骤分高纯化量子点-抗体复合物的操作步骤如下：a）将步骤8.3.2得到的混合物，在1.5mL的灭菌离心管中，4℃下20000r/min离心20min，离心机停止后，用移液器小心吸取上清液，得到量子点-抗体复合物沉淀。在量子点-抗体复合物沉淀中，加人1mL的PBST洗涤液·然后超声分散1min，量子点均勺b)bZxz.net
分散。
c）4℃下20000r/min离心20min，离心机停止后，用移液器小心吸取上清液，得到量子点-抗体4
复合物沉淀。
d）再重复上述离心洗涤b)、c)步骤2次。e）将量子点-抗体复合物分散在100μLPBST洗涤液中。8.4免疫荧光杂交的具体操作步骤免疫荧光杂交的操作步骤如下：SN/T3728-—2013
8）将步骤8.2获得的富集了空肠弯曲菌的免疫磁珠100L和8.3获得的量子点-抗体复合物10uL溶液混合+室温无菌条件下，在旋转混合器上混合上述混合液.以12r/min～20r/min的速度混合反应1h。
b）将磁珠悬浮液放在磁架上，轻轻晃动磁架，使免疫磁珠复合物聚集到磁极。小心打开离心管盖子，然后用移液器慢慢吸取清滴，注章避免带走聚集在磁极上的免疫磁珠复合物c
然后回离心管内加人200灭菌的洗液，将离心管在涡旋温合仪上涡旅混合30，使磁珠均分散在洗液中，再在旋转混合器上以12r/min~20r/min的速度混合10min。d）将洗涤后的磁珠悬浮液放在磁架上，轻轻晃动磁架，使免疫磁珠复合物聚集到磁极上，然后小心打开离心管盖子，用移液器慢慢吸取上清，注意避免带走聚集在磁极上的免疫磁珠复合物。再重复上述c)、d)步骤两次。
将洗涤后的免疫磁珠复合物分散在100叫L灭菌的洗涤液中，重悬磁珠。8.5质量控制
每次反应应设置阴性对照、空自对照和阳性对照各二个：a）空白对照：使用水替代增菌液；阴性对照：使用大肠杆菌等非空肠弯曲菌替代增菌液：b)
阳性对照制备：将空肠弯曲菌标准菌株接种于营养肉汤中42℃培养过夜.用无菌生理盐水稀c
释至约麦氏浊度0.4。
8.6结果观察
将步骤8.4获得的免疫杂交后的磁珠复合物涡旋分散均匀，取10加在洁净的载玻片上，盖上盖玻片，封片。在荧光显微镜下观察磁珠复合物首先在明场下调焦，清楚观察到磁珠，然后暗场下，在紫外光激发下观察磁珠复合物，观察视眼2~3个，滤波片的选择600nm左右。8.7结果判定
在空白对照和阴性对照荧光显微镜下观察磁珠复合物表面无荧光，阳性对照荧光显微镜下观察磁珠复合物表面有红色荧光：
a）待检样品反应后磁珠表面有红色荧光，该样品结果为空肠弯曲菌初筛阳性，并将免疫杂交后的磁珠复合物直接划平板，用生化方法进行确认后报告结果。b2
特检样品反应后磁珠复合物表面红色无荧光，则可报告空肠弯曲菌检验结果为阴性c）若与上述条件不符，则本次检测结果无效，应更换试剂按本方法重新检测。5
SN/T3728—2013
A.1PBS缓冲液(pH值为7.4)
氯化钠（NaCI)
氯化钾（KCI)
磷酸氢二钠（Na,HPO。）
磷酸二氢钾(KHPO)
附录A
（资料性附录）
试剂的配制
加800mL蒸馏水溶解，用稀盐酸调pH值至7.4，再加蒸馏水至1000mL，121℃±2℃.20min高压蒸汽灭菌，室温保存。
PBST洗涤液
100mLPBS(pH值为7.2)加人100μLTween20A.3MES缓冲液
2-（N-鸣咻代）乙磺酸（MES）
加50mL蒸馏水溶解，用稀NaOH溶液调pH值至6.0，再加蒸馏水至100mL，121C土2℃，20min高压蒸汽灭菌·室温保存。6
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出口食品中空肠弯曲菌快速检测方法量子点免疫荧光法
Rapid determination of Camp ylobacter jejuni in food for export-Quantum dots immuno-fluorescence method2013-11-06发布
中华人民共和国
压家质量监督检验检疫总局
2014-06-01实施
本标准是按照GB/T1.1—2009给出的规则起草本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。SN/T3728—2013
本标准起草单位：中华人民共和国江苏出人境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院、合肥工业大学。
本标准主要起草人：薛峰、张睿、蒋原、曾德新、陈雷、陈颖、栾军、张鹏飞、陈伟。1范围
出口食品中空肠弯曲菌快速检测方法量子点免疫荧光法
本标准规定了出口食品中空肠弯曲菌的量子点免疫荧光检测方法。本标准适用于出口食品中空肠弯曲菌的快速检测2规范性引用文件
SN/T3728—2013
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T4789.9食品微生物学检验空肠弯曲菌检验GB19489实验室生物安全通用要求3生物安全措施
为了保护实验室人员的安全，应由具备资格的工作人员检测空肠弯曲菌，所有培养物和废弃物应参照GB19489中的有关规定执行
4技术概要
本标准采用量子点免疫荧光分析技术检测空肠弯曲菌，主要包含以下步骤：a2增菌，按照GB/T4789.9方法进行样品制备和增菌。b）以免疫磁珠为载体，将菌液中的空肠弯曲菌快速富集在磁珠表面。将荧光量子点标记的空肠弯曲菌抗体与免疫磁珠富集的空肠弯曲菌溶液相互作用，利用荧光c
显微镜检测磁珠复合物表面的荧光，结果判定。5试剂和材料
表面带羧基的水溶性量子点（浓度：5μmol/L）。5.1
5.2空肠弯曲菌单克隆抗体包被的免疫磁珠（浓度约10°个磁珠/mL）。5.3
空肠弯曲菌多克隆抗体（浓度约1mg/mL）。5.41-乙基-3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺（EDC)。5.5N-羟基琥珀酸亚胺（Sulfo-NHS)。5.6
超滤离心管（截留相对分子质量：10kDa）。透析袋（截流相对分子质量：14kDa，直径1cm）。5.7
单氨基聚乙二醇（PEG-NH2，相对分子质量：5kDa）5.8
SN/T3728-2013
载玻片。
盖玻片。
空肠弯曲菌株参考菌株：CampylobacterATCC110902、ATCC110903.ATCC110904、ATCC110905PBS缓冲液：参见附录A中A.1。
PBST洗涤液：参见A.2。
MES缓冲液：参见A.3。
仪器和设备
6.1一次性手套。
6.2移液器：量程0.5μL~10μL.精度0.01μL；量程10μL~100μL，精度0.1μL；量程100μL~1000μL，精度1μ
灭菌移液器吸头。
1.5mL塑料离心管。
1.5mL离心管架。
1.5mL磁架。
高速台式离心机，转速不低于20000r/min，最大相对离心力不低于10000×g。恒温摇床，温度偏差不超过土1℃。涡旋混合器。
旋转混合器。
高压灭菌锅。
计时器。
荧光显微镜，配置有汞灯光源和600nm士20nm附近牵带滤光片。检测程序
食品中空肠弯曲菌量子点免疫荧光检测程序见图1。2
操作步骤
待测样品
选择性增菌液或待测菌株
免疫碰球富集空肠弯曲菌
然后用无菌缓冲液洗涤
磁珠重总在缓冲液中
酸基量子点活化
抗体共价偶联在量子点表面
SN/T3728-—2013
离心分离纯化量子点抗体复合物富集空肠弯曲菌的微殊与免疫量子点混合进行免疫识别反应磁性分商磁殊复合物，荧光显微镜下观察结果阴性
传统方法确认
食品中空肠弯曲菌量子点免疫荧光检测程序8.1样品制备、增菌培养
按照GB/T4789.9方法进行样品制备和增菌。8.2免疫磁珠富集
8.2.1免疫磁珠富集条件
免疫磁珠富集应该在增菌6h后进行，必要时也可以继续培养12h～18h后再分离一次。8.2.2磁珠高集病菌的操作步骤
操作过程要无菌环境下进行，避免任何外部的污染和产生气溶胶。对于8.1获得的增菌液：a)
直接取该增菌液1mL加到1.5mL无菌离心管中。分别取20μL单抗包被的免疫磁珠，1mL增菌液上清，在1.5mL无菌离心管中混合。b）
在旋转混合器上混合上述混合液，室温下，以12r/min~20r/min的速度混合30min，进行磁性免疫识别反应，
SN/T3728—2013
8.2.3分离磁珠的操作步骤
分离磁珠的操作步骤如下：
a）将8.2.1得到的磁珠悬浮液放在磁架上，轻轻动磁架，使免疫磁珠聚集到磁极b）小心打开离心管盖子，然后用移液器慢慢吸取清液，注意避免带走聚集在磁极上的免疫磁珠。然后向离心管内加人1mL灭菌的洗涤液，将离心管在涡旋混合仪上涡旋混合30s，使磁珠均c)
勾分散在洗液中，再在旋转混合器上12r/min~20r/min的速度混合10min。d）将洗涤后的珠悬浮液放在磁架上，轻轻动磁架·使免疫磁珠聚集到磁极上，然后小心打开离心管盖子，用移液器慢慢吸取上清，注意避免带走聚集在磁极上的免疫磁珠。e>
再重复上述c)、d)步骤两次
将洗涤后的免疫磁珠分散在100L灭首的洗液中，重悬磁珠-细菌复合物。f）
8.3量子点标记抗体
8.3.1量子点的选择要求
使用的量子点可以是商业产品，或者自已合成，表面只有羧基官能团，荧光发射峰在600nm左右8.3.2活化羧基量子点的具体操作步骤活化羧基量子点的操作步骤如下将10μL浓度为5μmol/L的量子点溶液，分散在100μL的MES缓冲液中，分别加人1μLa)
10mmol/L的EDC和1μL10mmol/L的Sulfo-NHS水溶液，然后30℃摇床上，200r/min见动反应30min。
将反应后的量子点溶液用PBS缓冲液稀释至500L然后用截流相对分子质量100kDa的超b)
滤离心管，2000r/min离心超滤10min超滤浓缩后的溶液中，再加人500μLPBS缓冲液，超声1min分散量子点溶液，然后重复b）c
步骤，将量子点溶波浓缩在100μL。8.3.3量子点抗体偶联的具体操作步骤量子点抗体偶联的操作步骤如下a）空肠弯曲菌多克隆抗体100μL1mg/ml，用截流相对分子质量14kDa的透析袋在PBS缓冲液中，4℃透析24h。
将透析后的抗体溶液加人步骤8.3.1得到的活化后的量子点溶液中，然后30℃摇床上，200z/b)
min晃动反应1h。
向反应体系中加人10μL质量分数为1%的PEG-NH，水溶液，继续30℃摇床上，200r/minc
晃动反应1h。
8.3.4分离纯化量子点-抗体复合物的具体操作步骤分高纯化量子点-抗体复合物的操作步骤如下：a）将步骤8.3.2得到的混合物，在1.5mL的灭菌离心管中，4℃下20000r/min离心20min，离心机停止后，用移液器小心吸取上清液，得到量子点-抗体复合物沉淀。在量子点-抗体复合物沉淀中，加人1mL的PBST洗涤液·然后超声分散1min，量子点均勺b)bZxz.net
分散。
c）4℃下20000r/min离心20min，离心机停止后，用移液器小心吸取上清液，得到量子点-抗体4
复合物沉淀。
d）再重复上述离心洗涤b)、c)步骤2次。e）将量子点-抗体复合物分散在100μLPBST洗涤液中。8.4免疫荧光杂交的具体操作步骤免疫荧光杂交的操作步骤如下：SN/T3728-—2013
8）将步骤8.2获得的富集了空肠弯曲菌的免疫磁珠100L和8.3获得的量子点-抗体复合物10uL溶液混合+室温无菌条件下，在旋转混合器上混合上述混合液.以12r/min～20r/min的速度混合反应1h。
b）将磁珠悬浮液放在磁架上，轻轻晃动磁架，使免疫磁珠复合物聚集到磁极。小心打开离心管盖子，然后用移液器慢慢吸取清滴，注章避免带走聚集在磁极上的免疫磁珠复合物c
然后回离心管内加人200灭菌的洗液，将离心管在涡旋温合仪上涡旅混合30，使磁珠均分散在洗液中，再在旋转混合器上以12r/min~20r/min的速度混合10min。d）将洗涤后的磁珠悬浮液放在磁架上，轻轻晃动磁架，使免疫磁珠复合物聚集到磁极上，然后小心打开离心管盖子，用移液器慢慢吸取上清，注意避免带走聚集在磁极上的免疫磁珠复合物。再重复上述c)、d)步骤两次。
将洗涤后的免疫磁珠复合物分散在100叫L灭菌的洗涤液中，重悬磁珠。8.5质量控制
每次反应应设置阴性对照、空自对照和阳性对照各二个：a）空白对照：使用水替代增菌液；阴性对照：使用大肠杆菌等非空肠弯曲菌替代增菌液：b)
阳性对照制备：将空肠弯曲菌标准菌株接种于营养肉汤中42℃培养过夜.用无菌生理盐水稀c
释至约麦氏浊度0.4。
8.6结果观察
将步骤8.4获得的免疫杂交后的磁珠复合物涡旋分散均匀，取10加在洁净的载玻片上，盖上盖玻片，封片。在荧光显微镜下观察磁珠复合物首先在明场下调焦，清楚观察到磁珠，然后暗场下，在紫外光激发下观察磁珠复合物，观察视眼2~3个，滤波片的选择600nm左右。8.7结果判定
在空白对照和阴性对照荧光显微镜下观察磁珠复合物表面无荧光，阳性对照荧光显微镜下观察磁珠复合物表面有红色荧光：
a）待检样品反应后磁珠表面有红色荧光，该样品结果为空肠弯曲菌初筛阳性，并将免疫杂交后的磁珠复合物直接划平板，用生化方法进行确认后报告结果。b2
特检样品反应后磁珠复合物表面红色无荧光，则可报告空肠弯曲菌检验结果为阴性c）若与上述条件不符，则本次检测结果无效，应更换试剂按本方法重新检测。5
SN/T3728—2013
A.1PBS缓冲液(pH值为7.4)
氯化钠（NaCI)
氯化钾（KCI)
磷酸氢二钠（Na,HPO。）
磷酸二氢钾(KHPO)
附录A
（资料性附录）
试剂的配制
加800mL蒸馏水溶解，用稀盐酸调pH值至7.4，再加蒸馏水至1000mL，121℃±2℃.20min高压蒸汽灭菌，室温保存。
PBST洗涤液
100mLPBS(pH值为7.2)加人100μLTween20A.3MES缓冲液
2-（N-鸣咻代）乙磺酸（MES）
加50mL蒸馏水溶解，用稀NaOH溶液调pH值至6.0，再加蒸馏水至100mL，121C土2℃，20min高压蒸汽灭菌·室温保存。6
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