SN/T 3729.2-2013 出口食品及饮料中常见水果品种的鉴定方法 第2部分杏成分检测 实时荧光PCR法 SN/T3729.2-2013 标准压缩包解压密码：www.bzxz.net

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T3729.2—2013
出口食品及饮料中常见水果品种的鉴定方法
第2部分：否成分检测
实时荧光PCR法
Identification of fruit species in export food and drink-Part 2:Detection of Prunus armeniaca ingredient-Real-time PCR method2013-11-06发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2014-06-01实施
SN/T3729.2—2013
SN/T3729《出口食品及饮料中常见水果品种的鉴定方法》共分为以下10个部分：PCR法：
第1部分：草成分检测
第2部分：杏成分检测
第3部分：梨成分检测
实时荧光PCR法；
实时荧光PCR法：
第4部分：芒果成分检测
第5部分：木瓜成分检测
第6部分：苹果成分检测
一第7部分：葡葡成分检测
第8部分：山楂成分检测
实时荧光PCR法：
实时荧光PCR法；
实时荧光PCR法；
PCR法；
实时荧光PCR法；
第9部分：桃成分检测实时荧光PCR法：第10部分：香蕉成分检测实时荧光PCR法。本部分为SN/T3729的第2部分。
本部分按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国辽宁出人境检验检疫局、宝生物工程（大连）有限公司。
本部分主要起草人：郑秋月、李晶泉、刘再、张浩、徐君怡、封雪、赵昕、韩建勋。1范围
出口食品及饮料中常见水果品种的鉴定方法第2部分：查成分检测
实时荧光PCR法
SN/T3729.2—2013
SN/T3729的本部分规定了出口食品和饮料中查成分的实时荧光PCR检测方法本部分适用于果汁、果酱及其他以水果为原辅料的食品中杏成分的定性检测。本部分所规定方法的最低检出限（LOD)为1%（质量分数）。2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T27403实验室质量控制规范食品分子生物学检测3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件
杏Prunus armeniaca
蓄薇目、蓄薇科、梅亚科，李属、李亚属植物。杏原产中国，遍植于中亚、东南亚及南欧和北非的部分地区。本部分中否成分即指否特异性DNA片段。3.2
清汁clarifiedjuice
经过澄清工艺加工，没有浑浊和沉淀的果汁。3.3
油汁cloudyjuice
未经过澄清工艺加工，浑浊但未分层和沉淀的果汁。4缩略语
下列缩略语适用于本文件。
DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonuleicacid）dNTP：脱氧核苷酸三磷酸（deoxyribonuleosidetriphosphate）CTAB：十六烷基三甲基溴化铵（cetyltrithylammoniumbramide）Tris：三羟甲基氨基甲烷[tris（hydroxymethyl）aminomethane]EDTA：乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraaceticacid）SN/T3729.2—2013
ErTagHS:高效热启动DNA聚合酶
OD：光度密度（opticaldensity）5方法提要
提取DNA，以DNA为模版，分别采用杏的特异性检测引物和探针进行实时荧光PCR扩增，观察实时荧光PCR的增幅现象，进行食品及饮料中杏成分的检测鉴定，其中以查果肉DNA为阳性对照，以非查来源的DNA为阴性对照，无菌水作为空白对照。6试剂和材料
除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂。实验用水符合GB/T6682的要求，所有试剂均用无DNA酶污染的容器分装。
6.1检测用引物和探针：见表1。表引物探针序列
内参照5*端引物
内参照3端引物
内参照探针
否5°端引物
查3'引物
杏探针
序列（5-31）
TCTGCCCTATCAACTTTCGATGGTA
AATTTGCGCGCCTGCTGCCTTCCTT
FAM-CCGTTTCTCAGGCTCCCTCTCCGGAATCGAACC-EelipseCGTCATCTTCAAATATGTCAA
GGGATTCTGCAATICACA
FAM-CTCTCGGCAACGGATATCTCGG-Eclips目的基因
真核生物
18SrRNA基固
rRNA基固
6.2CTAB提取缓冲液：20g/L/CTAB.1.4mel/LNael,0.1mol/LTris-HCl.0.02mol/LNaEDTA，pH8.0。
6.3CTAB沉淀液：5g/LCTAB.40mmol/LNaCl三氯甲烷（氯仿）。
异丙醇。
6.670%乙醇（体积分数）。
NaCl溶液(1.2mol/L)
10×PCR缓冲液：氟化钾100mmol/L，硫酸铵160mmol/1，硫酸镁20mmol/L，Tris-HCl(pH8.8)200mmol/L,TritonX-1001%,BSA1mg/ml。6.9ErTagHS聚合酶。
6.10PremixE>TagTM(2X）：ExTaqHS聚合酶（终浓度0.1U/μL)、dNTP（终浓度0.6mmol/L)、Mg+（终浓度6mmol/L）。
仪器设备
7.1实时荧光PCR仪
7.2核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。7.3恒温水浴。
7.4离心机：高心力12000g。
SN/T3729.2-—2013
7.5微量移液器：0.5L~10μL,10μL~100μl.20μL~200g.200μl~1000μl7.6研钵及粉碎装置。
7.7涡旋振荡器。
7.8pH计。
7.9量筒：感量50mlcg
真空冷冻干燥机。
8检测步骤
8.1DNA提取
8.1.1清汁
将果汁样品上下颠倒均勾。取约30mL果汁至一洁净培养Ⅲ中，抽真空冻干；称取0.2g冷冻干物质至一洁净50mL离心管中-然后加入5mLCTAB裂解液，65℃孵育1h，间期不断混勾几次；8000g离心15min，取1ml上清液至1只清净2.0mL离心管中。然后加人700μL三氟甲烷，剧烈混匀30s，14500g离心10min，取650μL上清液至洁净2.0ml离心管中，加1300μLCTAB沉淀液剧烈混匀30s，室温静置1h：14500g离心20min，弃上清液，加人350μL1.2mol/LNaCl，剧烈振荡30s.再加入350μL三氛甲烷，剧烈混匀305.14500g离心10min分别取上清液320ml.加入0.8信体积异丙醇，混勾后，一20℃1h，14500g离心20min，弃上清液，加入500μL70%乙醇，混匀后，14500g离心20min，弃上清液，晾至风干，加入30μL双蒸水溶解，一20℃贮存备用。8.1.2浊汁
将果汁样品上下倒均匀。取约30ml果汁至一洁净离心管中，8000g高心10min，去上清.加入5mLCTAB裂解液，65℃孵育1h，其余步骤同8.1.1。8.1.3固体样品
称取样品500mg于50mL离心管中，加入5mLCTAB裂解液，65℃孵育1h，其余步骤同8.1.1。8.2DNA浓度和纯度的测定
使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计分别检测260nm和280nm处的吸光值A2和Az8DNA的浓度按照式（1)计算。当A26/A%比值在1.7～1.9之间时.适宜于PCR扩增C-AXNX50/1000
式中：
DNA浓度，单位为微克每微升Cμg/μL）；C
A——260nm处的吸光值；
N核酸稀释倍数。
8.3实时荧光PCR扩增
实时荧光PCR反应体系
（1）
实时荧光PCR反应体系见表2，每个样品各做两个平行管。可先将反应试剂及引物预混成混合液形式。
SN/T3729.2—2013
试剂名称
PremixEaTaMc2x)bZxz.net
上下游引物（10xmol/L）
操针C5μmol/L）
DNA模板（10μg/ml~100μg/mL)补水至
表2实时荧光PCR反应体系
终浓度
400nmol/L
200nmol/L
真核生物内参照的反应体系同上，仅以真核生物引物对和探针替换查引物对和探针8.3.2
实时荧光PCR反应程序
95℃/10s，1个循环95℃/5s，52℃/10s.72℃/348，40个循环。质量控制
空白对照：无荧光对数增长，相应的Ct值≥40.0。阴性对照：无荧光对数增长，相应的Ct值40.0。阳性对照：有荧光对数增长，且荧光通道出现典型的扩增曲线，相应的Ct值<30.0。内参照：有荧光对数增长，且荧光通道出现典型的扩增曲线，相应的Ct值<30.0。结果判定与表述
结果判定
如Ct值≤35，则判定被检样品阳性。如Ct值≥40，则判定被检样品阴性。10.1.2
反应/μl
如35结果表述
样品阳性，表述为“检出查成分”10.2.1
10.2.2样品阴性，表述为“未检出查成分”11
检测过程中防止交叉污染的措施检测过程中防止交叉污染的措施按照GB/T27403的规定执行。书号：155066·2-26820
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