SN/T 3729.4-2013
基本信息
标准号： SN/T 3729.4-2013
中文名称：出口食品及饮料中常见水果品种的鉴定方法 第4部分芒果成分检测 实时荧光PCR法
标准类别：商检行业标准(SN)
标准状态：现行
出版语种：简体中文
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相关标签： 出口 食品 饮料 常见 水果 品种 鉴定 方法 芒果 成分 检测 实时 荧光 PCR
标准分类号
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出版信息
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标准简介
SN/T 3729.4-2013 出口食品及饮料中常见水果品种的鉴定方法 第4部分芒果成分检测 实时荧光PCR法
SN/T3729.4-2013
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标准内容
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T3729.4—-2013
出口食品及饮料中常见水果品种的鉴定方法第4部分：芒果成分检测实时荧光PCR法
Identification of fruit species in export food and drink-Part 4:Detection of mango ingredientReal-time PCR method2013-11-06发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2014-06-01实施
SN/T3729.4—2013
SN/T3729《出口食品及饮料中常见水果品种的鉴定方法》共分为以下10个部分：第1部分：草莓成分检测
PCR法：
第2部分：杏成分检测实时荧光PCR法；一第3部分：梨成分检测
实时荧光PCR法；
第4部分：芒果成分检测
第5部分：木瓜成分检测
第6部分：苹果成分检测
一第7部分：葡萄成分检测
第8部分：山楂成分检测
实时荧光PCR法：
实时荧光PCR法；
实时荧光PCR法：
PCR法；
实时荧光PCR法：
一第9部分：桃成分检测实时荧光PCR法；第10部分：香蕉成分检测
实时荧光PCR法。
本部分为SN/T3729的第4部分。
本部分按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国山东出入境检验检疫局、中华人民共和国厦门出人境检验检疫局。
本部分主要起草人：刘彩霞、高宏伟、孙敏、林超、甘琴华、陈颖、吴亚君、韩建勋、黄文胜、邓婷婷。1范围
出口食品及饮料中常见水果品种的鉴定方法第4部分：芒果成分检测实时荧光PCR法
SN/T3729.4—2013
SN/T3729的本部分规定了出口食品和饮料中芒果成分的实时荧光PCR检测方法。本部分适用于果汁、果酱及其他以水果为原辅料的食品中芒果成分的定性检测。本部分所规定方法的最低检出限（LOD)为0.01%（质量分数）。2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T27025检测和校准实验室能力的通用要求GB/T27403实验室质量控制规范食品分子生物学检测3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。3.1
芒果mango
别称庵罗果、檬果、蜜望子、香盖属漆树科CAnacardiaceae)芒果属。3.2
清汁clarifiedjuice
经过澄清工艺加工，没有浑浊和淀的果汁。3.3
浊汁cloudyjuice
未经过澄清工艺加工，浑浊但未分层和沉淀的果汁。4缩略语
下列缩略语适用于本文件。
DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonuleicacid）dNTP：脱氧核苷酸三磷酸（deoxyribonuleosidetriphosphate）CTAB：十六烷基三甲基漠化铵（cetyltrithylammoniumbromide）Tris：三羟甲基氨基甲烷tris（hydroxymethyl)aminomethaneEDTA：Z胺四Z酸（ethylenediaminetetraaceticacid)SN/T3729.4-2013
dATP：脱氧腺苷三磷酸（deoxyadenosinetriphosphate）dCTP：脱氧胞苷三磷酸（deoxycytidinetriphosphate）dGTP：脱氧鸟苷三磷酸（deoxyguanosinetriphosphate）dTTP：脱氧胸苷三磷酸（deoxythymidinetriphosphate）dUTP：脱氧尿苷三磷酸（deoxyuridinetriphosphate）Taq：水生栖热菌（Thermusaquaticu）FAM：羧基荧光素（carboxyfluorescein）TAMRA：羧基四甲基罗丹明（carboxy-tetramethyl-rhodamine）UNG酶：尿嘧啶-N-糖基化酶（uracil-N-glycosylase）OD：光密度值（opticaldensity）5方法提要
提取DNA，以DNA为模版·分别采用芒果的特异性检测引物和探针进行实时荧光PCR扩增.观察实时荧光PCR的增幅现象，进行食品及饮料中芒果成分的检测鉴定，其中以芒果果肉DNA为阳性对照，以非芒果来源的DNA为阴性对照，无菌水作为空白对照。6试剂和材料
除另有规定外，所有实验使用的试剂等级应为不含DNA和DNase的分析纯或生化试剂。条件许可的情况下推荐使用优级纯试剂。试剂的选购、验收，贮存应符合GB/T27025的规定。实验用水符合GB/T6682中一级水的规格。所有试剂均用无DNA酶污染的容器分装。6.1检测用引物和探针：见表1
表1引物探针序列
引物/探针
内参照F
内参照R
内参照P
老果F
芒果R
芒果P
引物/操针序列（5-3*）
TCTGCCCTATCAACTTTCGATGGTA
AATTTGCGCGCCTGCTGCCTTCCTT
FAM-CCGTTTCTCAGGCTCCCTCTCCGGAATCGAACC-TAMRATCTGAGTTCTCGGTGACGCTTTC
CCGGTCTCTAGGGTCGAAGAGC
FAM-ATCCTGTCGTGCGGTTGCGTTCTCC-TAMRA扩增片段长度
靶基因
真核生物
18SrRNA基固
芒果核糖体
ITSI-5.8S-ITS2
CTAB提取缓冲液:20g/LCTAB,1.4mol/LNaCl,0.1mol/LTris-HCl.0.02mol/LNazEDTA，pH8.0。
6.3CTAB沉淀液.5g/LCTAB.0.04mol/LNaCl.pH8.0三氯甲烷（氯仿）。
6.5异丙醇。
6.670%乙醇（体积分数）。
6.7NaCI溶液(1.2mol/L)。
10×PCR缓冲液：氯化钾100mmol/L，硫酸铵160mmol/L.硫酸镁20mmol/L，Tris-HCl(pH8.8)200mmol/L,TritonX-1001%.BSA1mg/mL。2
6.9氯化镁溶液：2.5mmol/L。
6.10dNTP溶液（dGTP、dCTP、dATPdTTP或dUTP）：各2.5mmol/L6.11
Taq酶(5U/μL)
UNG酶（尿嘧啶-N-糖基化酶》。仪器设备
实时荧光PCR仪。
核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。7.3
恒温水浴锅。
7.4离心机：离心力≥12000g。
SN/T3729.4—2013
微量移液器：0.5μ~10μ10μ~100μ，20μ~200μ，200μ~1000。7.6
研钵及粉碎装置。
涡旋振荡器。
7.8pH计。
7.9量筒：感量50ml
真空冷冻干燥机。
检测步骤
DNA提取
8.1.1清汁
将果汁样品上下颠倒均勾。取约30mL果汁至一洁净培养Ⅲ中，抽真空冻干+称取02g冷冻干物质至一洁净50mL离心管中，然后加人5mLCTAB裂解液，65℃孵育1h，间期不断混勾儿次：8000g离心15min，取1mL上清液至1只洁净2.0mL离心管中。然后加入700μL三氯甲烷，剧烈混匀30s，14500g离心10min取650μL上清液至洁净2.0mL离心管中，加入1300μLCTAB沉淀液，剧烈混匀30s，室温静置1h14500g离心20min，弃上清液，加人350μL1.2mol/LNaCl.剧烈振荡30s，再加人350μl三氯甲烷，剧烈混匀305.14500g离心10min：分别取上清液320L，加人0.8倍体积异内醇，混匀后，一20℃1h，14500g离心20mim，弃上清液，加入500μl70%乙醇，混后，14500g离心20min，弃上清液，晾至风干，加入50μl双蒸水溶解，一20℃贮存备用。8.1.2油汁
将果汁样品上下颠倒均匀。取约30mL果汁至一洁净离心管中，8000g离心10min，去上清，加人5mLCTAB裂解液，65℃孵育1h，其余步骤同8.1.1。8.1.3固体样品
称取样品500mg于50mL离心管中，加人5mLCTAB裂解液，65℃孵育1h，其余步骤同8.11。8.2DNA浓度和纯度的测定
使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计分别检测260nm和280nm处的吸光值A%和A280。DNA的浓度按照式（1)计算。当A/A比值在1.7～1.9之间时，适宜于PCR扩增。c-AXNX50/1000
SN/T3729.4—2013
-DNA浓度，单位为微克每微升（μg/μL)：A——260nm处的吸光值；
N核酸稀释倍数。
实时荧光PCR扩增
实时荧光PCR反应体系
见表2。
表2实时荧光PCR反应体系
10×PCR缓冲液（不含氟化镁）
Mg+溶液（25mmol/L）
dNTP溶液（各2.5mmol/L）
UNG醉
正向引物（20μmol/L）
反向引物（20μmol/）
探针（10μmol/L）
Tag腾<5U/μL)
DNA模板（20ng/μL~100.ng/μL）补水至
反应体系中的终浓度
2.5mmol/L
各0.2mmol/L
0.2μmol/L
0.2μmol/L
0.1μmol/L
注，实验室如果采用UNG醛作为防止污染的措施何以在每次PCR反应的体系中以dUTP代替dTTP并加入UNG酶，否则，反应体累中不必加UNG，ANTP溶液为dATPdCTP、dGTP和dTTP的混合物。反应体系中各试剂的量可以根据反应体系的总体积进行适当调整：实时费光PCR反应程序
95℃预变性3min，95℃15s60C30s.45个循环（在加UNG酶的情况下，在反应程序前使用去污染程序50℃，2min）。
质量控制
9.1空白对照：无荧光对数增长，相应的Ct值≥40。9.2bzxZ.net
阴性对照：无荧光对数增长，相应的Ct值≥40阳性对照：有荧光对数增长，且荧光通道出现典型的扩增曲线，相应的Ct值≤36。内参照：有荧光对数增长，且荧光通道出现典型的扩增曲线，相应的Ct值≤36。结果判断与表述
结果判定
待测基固检测结果36SN/T3729.4—2013
正常，此时可以判断阳性；再次检测结果Ct值≥40，同时各种实验对照结果正常，此时可以判断为阴性。10.1.2待测基因检测结果Ct值≥40，则判定被检样品阴性。10.1.3
待测基因检测结果Ct值≤36，并出现典型的扩增曲线此时可以判定被检样品阳性。10.2
结果表述
样品阳性，表述为“检出芒果成分”。10.2.1
样品阴性，表述为未检出芒果成分”检测过程中防止交叉污染的措施检测过程中防止交叉污染的措施按照GB/T27403的规定执行。5
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出口食品及饮料中常见水果品种的鉴定方法第4部分：芒果成分检测实时荧光PCR法
Identification of fruit species in export food and drink-Part 4:Detection of mango ingredientReal-time PCR method2013-11-06发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2014-06-01实施
SN/T3729.4—2013
SN/T3729《出口食品及饮料中常见水果品种的鉴定方法》共分为以下10个部分：第1部分：草莓成分检测
PCR法：
第2部分：杏成分检测实时荧光PCR法；一第3部分：梨成分检测
实时荧光PCR法；
第4部分：芒果成分检测
第5部分：木瓜成分检测
第6部分：苹果成分检测
一第7部分：葡萄成分检测
第8部分：山楂成分检测
实时荧光PCR法：
实时荧光PCR法；
实时荧光PCR法：
PCR法；
实时荧光PCR法：
一第9部分：桃成分检测实时荧光PCR法；第10部分：香蕉成分检测
实时荧光PCR法。
本部分为SN/T3729的第4部分。
本部分按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国山东出入境检验检疫局、中华人民共和国厦门出人境检验检疫局。
本部分主要起草人：刘彩霞、高宏伟、孙敏、林超、甘琴华、陈颖、吴亚君、韩建勋、黄文胜、邓婷婷。1范围
出口食品及饮料中常见水果品种的鉴定方法第4部分：芒果成分检测实时荧光PCR法
SN/T3729.4—2013
SN/T3729的本部分规定了出口食品和饮料中芒果成分的实时荧光PCR检测方法。本部分适用于果汁、果酱及其他以水果为原辅料的食品中芒果成分的定性检测。本部分所规定方法的最低检出限（LOD)为0.01%（质量分数）。2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T27025检测和校准实验室能力的通用要求GB/T27403实验室质量控制规范食品分子生物学检测3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。3.1
芒果mango
别称庵罗果、檬果、蜜望子、香盖属漆树科CAnacardiaceae)芒果属。3.2
清汁clarifiedjuice
经过澄清工艺加工，没有浑浊和淀的果汁。3.3
浊汁cloudyjuice
未经过澄清工艺加工，浑浊但未分层和沉淀的果汁。4缩略语
下列缩略语适用于本文件。
DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonuleicacid）dNTP：脱氧核苷酸三磷酸（deoxyribonuleosidetriphosphate）CTAB：十六烷基三甲基漠化铵（cetyltrithylammoniumbromide）Tris：三羟甲基氨基甲烷tris（hydroxymethyl)aminomethaneEDTA：Z胺四Z酸（ethylenediaminetetraaceticacid)SN/T3729.4-2013
dATP：脱氧腺苷三磷酸（deoxyadenosinetriphosphate）dCTP：脱氧胞苷三磷酸（deoxycytidinetriphosphate）dGTP：脱氧鸟苷三磷酸（deoxyguanosinetriphosphate）dTTP：脱氧胸苷三磷酸（deoxythymidinetriphosphate）dUTP：脱氧尿苷三磷酸（deoxyuridinetriphosphate）Taq：水生栖热菌（Thermusaquaticu）FAM：羧基荧光素（carboxyfluorescein）TAMRA：羧基四甲基罗丹明（carboxy-tetramethyl-rhodamine）UNG酶：尿嘧啶-N-糖基化酶（uracil-N-glycosylase）OD：光密度值（opticaldensity）5方法提要
提取DNA，以DNA为模版·分别采用芒果的特异性检测引物和探针进行实时荧光PCR扩增.观察实时荧光PCR的增幅现象，进行食品及饮料中芒果成分的检测鉴定，其中以芒果果肉DNA为阳性对照，以非芒果来源的DNA为阴性对照，无菌水作为空白对照。6试剂和材料
除另有规定外，所有实验使用的试剂等级应为不含DNA和DNase的分析纯或生化试剂。条件许可的情况下推荐使用优级纯试剂。试剂的选购、验收，贮存应符合GB/T27025的规定。实验用水符合GB/T6682中一级水的规格。所有试剂均用无DNA酶污染的容器分装。6.1检测用引物和探针：见表1
表1引物探针序列
引物/探针
内参照F
内参照R
内参照P
老果F
芒果R
芒果P
引物/操针序列（5-3*）
TCTGCCCTATCAACTTTCGATGGTA
AATTTGCGCGCCTGCTGCCTTCCTT
FAM-CCGTTTCTCAGGCTCCCTCTCCGGAATCGAACC-TAMRATCTGAGTTCTCGGTGACGCTTTC
CCGGTCTCTAGGGTCGAAGAGC
FAM-ATCCTGTCGTGCGGTTGCGTTCTCC-TAMRA扩增片段长度
靶基因
真核生物
18SrRNA基固
芒果核糖体
ITSI-5.8S-ITS2
CTAB提取缓冲液:20g/LCTAB,1.4mol/LNaCl,0.1mol/LTris-HCl.0.02mol/LNazEDTA，pH8.0。
6.3CTAB沉淀液.5g/LCTAB.0.04mol/LNaCl.pH8.0三氯甲烷（氯仿）。
6.5异丙醇。
6.670%乙醇（体积分数）。
6.7NaCI溶液(1.2mol/L)。
10×PCR缓冲液：氯化钾100mmol/L，硫酸铵160mmol/L.硫酸镁20mmol/L，Tris-HCl(pH8.8)200mmol/L,TritonX-1001%.BSA1mg/mL。2
6.9氯化镁溶液：2.5mmol/L。
6.10dNTP溶液（dGTP、dCTP、dATPdTTP或dUTP）：各2.5mmol/L6.11
Taq酶(5U/μL)
UNG酶（尿嘧啶-N-糖基化酶》。仪器设备
实时荧光PCR仪。
核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。7.3
恒温水浴锅。
7.4离心机：离心力≥12000g。
SN/T3729.4—2013
微量移液器：0.5μ~10μ10μ~100μ，20μ~200μ，200μ~1000。7.6
研钵及粉碎装置。
涡旋振荡器。
7.8pH计。
7.9量筒：感量50ml
真空冷冻干燥机。
检测步骤
DNA提取
8.1.1清汁
将果汁样品上下颠倒均勾。取约30mL果汁至一洁净培养Ⅲ中，抽真空冻干+称取02g冷冻干物质至一洁净50mL离心管中，然后加人5mLCTAB裂解液，65℃孵育1h，间期不断混勾儿次：8000g离心15min，取1mL上清液至1只洁净2.0mL离心管中。然后加入700μL三氯甲烷，剧烈混匀30s，14500g离心10min取650μL上清液至洁净2.0mL离心管中，加入1300μLCTAB沉淀液，剧烈混匀30s，室温静置1h14500g离心20min，弃上清液，加人350μL1.2mol/LNaCl.剧烈振荡30s，再加人350μl三氯甲烷，剧烈混匀305.14500g离心10min：分别取上清液320L，加人0.8倍体积异内醇，混匀后，一20℃1h，14500g离心20mim，弃上清液，加入500μl70%乙醇，混后，14500g离心20min，弃上清液，晾至风干，加入50μl双蒸水溶解，一20℃贮存备用。8.1.2油汁
将果汁样品上下颠倒均匀。取约30mL果汁至一洁净离心管中，8000g离心10min，去上清，加人5mLCTAB裂解液，65℃孵育1h，其余步骤同8.1.1。8.1.3固体样品
称取样品500mg于50mL离心管中，加人5mLCTAB裂解液，65℃孵育1h，其余步骤同8.11。8.2DNA浓度和纯度的测定
使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计分别检测260nm和280nm处的吸光值A%和A280。DNA的浓度按照式（1)计算。当A/A比值在1.7～1.9之间时，适宜于PCR扩增。c-AXNX50/1000
SN/T3729.4—2013
-DNA浓度，单位为微克每微升（μg/μL)：A——260nm处的吸光值；
N核酸稀释倍数。
实时荧光PCR扩增
实时荧光PCR反应体系
见表2。
表2实时荧光PCR反应体系
10×PCR缓冲液（不含氟化镁）
Mg+溶液（25mmol/L）
dNTP溶液（各2.5mmol/L）
UNG醉
正向引物（20μmol/L）
反向引物（20μmol/）
探针（10μmol/L）
Tag腾<5U/μL)
DNA模板（20ng/μL~100.ng/μL）补水至
反应体系中的终浓度
2.5mmol/L
各0.2mmol/L
0.2μmol/L
0.2μmol/L
0.1μmol/L
注，实验室如果采用UNG醛作为防止污染的措施何以在每次PCR反应的体系中以dUTP代替dTTP并加入UNG酶，否则，反应体累中不必加UNG，ANTP溶液为dATPdCTP、dGTP和dTTP的混合物。反应体系中各试剂的量可以根据反应体系的总体积进行适当调整：实时费光PCR反应程序
95℃预变性3min，95℃15s60C30s.45个循环（在加UNG酶的情况下，在反应程序前使用去污染程序50℃，2min）。
质量控制
9.1空白对照：无荧光对数增长，相应的Ct值≥40。9.2bzxZ.net
阴性对照：无荧光对数增长，相应的Ct值≥40阳性对照：有荧光对数增长，且荧光通道出现典型的扩增曲线，相应的Ct值≤36。内参照：有荧光对数增长，且荧光通道出现典型的扩增曲线，相应的Ct值≤36。结果判断与表述
结果判定
待测基固检测结果36
正常，此时可以判断阳性；再次检测结果Ct值≥40，同时各种实验对照结果正常，此时可以判断为阴性。10.1.2待测基因检测结果Ct值≥40，则判定被检样品阴性。10.1.3
待测基因检测结果Ct值≤36，并出现典型的扩增曲线此时可以判定被检样品阳性。10.2
结果表述
样品阳性，表述为“检出芒果成分”。10.2.1
样品阴性，表述为未检出芒果成分”检测过程中防止交叉污染的措施检测过程中防止交叉污染的措施按照GB/T27403的规定执行。5
小提示：此标准内容仅展示完整标准里的部分截取内容，若需要完整标准请到上方自行免费下载完整标准文档。