SN/T 3729.9-2013
基本信息
标准号： SN/T 3729.9-2013
中文名称：出口食品及饮料中常见水果品种的鉴定方法 第9部分桃成分检测 实时荧光PCR法
标准类别：商检行业标准(SN)
标准状态：现行
出版语种：简体中文
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相关标签： 出口 食品 饮料 常见 水果 品种 鉴定 方法 成分 检测 实时 荧光 PCR
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标准简介
SN/T 3729.9-2013 出口食品及饮料中常见水果品种的鉴定方法 第9部分桃成分检测 实时荧光PCR法
SN/T3729.9-2013
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标准内容
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T3729.9—2013
出口食品及饮料中常见水果品种的鉴定方法第9部分：桃成分检测
实时荧光PCR法
Identification of fruit species in export food and drink-Part 9:Detection of Prunus persica ingredient-Real-time PCR method2013-11-06发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2014-06-01实施
SN/T3729.9—2013
SN/T3729出口食品及饮料中常见水果品种的鉴定方法共分为以下10个部分第1部分：草莓成分检测PCR法；第2部分：杏成分检测
第3部分：梨成分检测
实时荧光PCR法：
实时荧光PCR法：
第4部分：芒果成分检测
第5部分：本瓜成分检测
第6部分：华果成分检测
一第7部分：葡萄成分检测
第8部分：山楂成分检测
实时荧光PCR法；
实时荧光PCR法；
实时荧光PCR法；
PCR法：
实时荧光PCR法；
第9部分：桃成分检测
实时荧光PCR法，
第10部分：香蕉成分检测实时荧光PCR法。本部分为SN/T3729的第9部分。
本部分按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国山东出人境检验检疫局、中华人民共和国上海出人境检验检疫局。
本部分主要起草人：黄文胜、吴亚君、韩建勋、陈题、高宏伟、李想、傅凯、王斌、孙敏1范围
出口食品及饮料中常见水果品种的鉴定方法第9部分：桃成分检测
实时荧光PCR法
SN/T3729.9—2013
SN/T3729的本部分规定了出中食品和饮料中桃成分的实时荧光PCR检测方法。本部分适用于果汁、果酱及其他以水果为原辅料的食品中桃成分的定性检测。本部分所规定方法的最低检出限（LOD）为1%（质量分数）2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的，凡是注且期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T27403实验室质量控制规范食品分子生物学检测3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件
桃Prunuspersica
普薇科梅属桃亚属植物，落叶小乔木。3.2
清汁clarifiedjuice
经过澄清工艺加工，没有浑浊和沉淀的果汁3.3
浊汁cloudyjuice
未经过澄清工艺加工，浑浊但未分层和沉淀的果汁。4缩略语
下列缩略语适用于本文件。
DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonuleicacid）dNTP：脱氧核苷酸三磷酸（deoxyribonuleosidetriphosphate）CTAB：十六烷基三甲基溴化铵（cetyltrithylammoniumbromide）Tris：三羟甲基氨基甲烷（tris(hydroxymethyl)aminomethane）EDTA：乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraaceticacid)Taq：水生栖热菌（Thermusaquaticus）SN/T3729.9-2013
OD光度密度（opticaldensity）5方法提要
提取DNA，以DNA为模板，分别采用桃的特异性检测引物和探针进行实时荧光PCR扩增.观察实时荧光PCR的增幅现象，进行食品及饮料中桃成分的检测鉴定·其中以桃果肉DNA为阳性对照，以非桃来源的DNA为阴性对照，无菌水作为空白对照。6试剂和材料
除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂。实验用水符合GB/T6682的要求。所有试剂均用无DNA酶污染的容器分装。
6.1检测用引物和探针：见表1。表1引物探针序列
引物/探针
内参照5端引物
内参照3端引物
桃5'端引物
桃3°端引物
桃探针
引物/探针序列（5-+3'）
CTTGATTTTACCAAAGATGATGA
TTCTTCGCATGTACCCGCAG
GAATTGCGCCAAGGA AATTG
GAGAGCCGAGATATCCGTTG
FAM-CGGCGTCGTCATCTTCAAATATGTAMAR扩增片段长度
靶基因
植物核酮糖-1.5-二磷
酸羧化酶/加氧酶基因
桃核糖体ITSI
5.8S-ITS2基因
6.2CTAB提取缓冲液.20g/LCTAB.1.4mol/LNaCl.0.1mol/LTris-HCl.0.02mol/LNa,EDTA，pH8.0。
6.3CTAB沉淀液：5g/LCTAB，40mmol/LNaCl6.4
三氯甲烷（氯仿）。
异丙醇。
70%乙醇（体积分数）。
NaCI溶液（1.2mol/L)
10×PCR缓冲液：氯化钾100mol/L，硫酸铵160mmol/L，硫酸镁20mmol/L，Tris-HClkpH8.8）6.8
200mmol/L,TritonX-1001%,BSA1mg/ml.。6.9
氟化镁溶液：2.5mmol/L。
dNTP溶液（dGTP、dCTP、dATP、dTTP或dUTP)：各2.5mmol/L。Taq酶（5U/μL)。
UNG（尿嘧啶-N-糖基化酶）。
仪器设备
实时荧光PCR仪。
7.2核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。7.3恒温水浴锅。
7.4离心机：离心力≥12000g。
SN/T3729.9—2013
微量移液器:0.5μL10μL.10pL~100μL.20μL~200μL,200μL~1000μ。7.5行
研钵及粉碎装置。
涡旋振荡器。
7.8pH计。
量筒：感量50ml。
7.10真空冷冻干燥机。
8检测步骤
8.1DNA提取
8.1.1清汁
将果汁样品上下颠倒均勾。取约30mL果汁至一洁净培养皿中，抽真空冻干：称取0.2g冷冻干物质至一洁净50mL离心管中，然后加人5mLCTAB裂解液，65℃孵育1h，间期不断混勾几次：8000g离心15min，取1mL上清液至1只洁净2.0mL离心管中。然后加人700μL三氟甲烷，剧烈混匀30s.14500g离心10min，取650μL上清液至洁净2.0mL离心管中，加入1300μlCTAB沉淀液，剧烈混匀30s，室温静置1h：14500g离心20min，弃上清液，加人350μl1.2mol/LNaCl.剧烈振荡30s.再加入350μL三氯甲烷，剧烈混勾30s，14500g离心10min；分别取上清液320μL.加入0.8倍体积异丙醇，混勾后，一20℃1h，14500g离心20min弃上清液，加人500μl，70%乙醇，混匀后，14500g离心20min，弃上清液，晾至风干，加30μL双蒸水溶解，一20℃贴存备用。8.1.2浊汁
将果汁样品上下颠倒均勾。取约30mL果汁至一洁净离心管中，8000g离心10min，去上清，加人5mLCTAB裂解液，65℃孵育1h，其余步骤同8.1.1。8.1.3固体样品
称取样品500mg于50mL离心管中，加人5mLCTAB裂解液.65℃孵育1h，其余步骤同8.1.1。8.2DNA浓度和纯度的测定
使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计分别检测260nm和280nm处的吸光值A26和A28。DNA的浓度按照式(1)计算。当A/A比值在1.7～1.9之间时，适宜于PCR扩增。c=AXNX50/1000
式中：
DNA浓度，单位为微克每微升（μg/μL)；A—260nm处的吸光值；
N核酸稀释倍数。
常规PCR扩增
8.3.1常规PCR反应体系
见表2。
SN/T3729.9-2013
10XPCR缓冲液
常规PCR反应体系（25ML）
反应体系中的终浓度
dNTP溶液（各2.5mmol/L）
正向引物（20pmol/L）
反向引物（20pmol/L）
Taq酶（5U/μL)
DNA模板（20ng/μL~100ngL）
常规PCR反应程序
PCR反应程序随仪器不同反应程序略有改变。各0.2mmol/L
0.2μmol/L
0.2μmol/L
般的PCR反应程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，40个循环。72延伸5min。4℃保存。电泳
取2g琼脂糖，于100mL电冰线冲液中加热，充分熔化，加人膜化乙锭忙存液至终浓度为0.5g/mL，制胶，在电泳槽中加人电泳缓冲液，使液面刚刚没过凝胶。将5LμLPCR扩增产物分别和适量加样缓冲液混合，点样。9V/cm恒压电冰，直至漠酚蓝指示剂迁移室凝胶2/3。紫外检测仪下观察电泳结果并记录。
实时荧光PCR扩增
实时荧光PCR反应体系
见表3。
表3实时荧光PCR反应体系（25μL）试剂
10XPCR缓冲液
Mg*+溶液（25mmol/1.）
dNTP落液（各2.5mmol/L）
UNG酶
正向引物（20μmol/L）
反向引物（20imol/L）
探针（10μmol/L）
Ta醇（5U/μL)
DNA模板（20ng/μL~100ng/μL)8.4.2
实时荧光PCR反应程序
95℃预变性10min，95℃15s.60℃1min.50个循环。4
复应体系中的终浓度wwW.bzxz.Net
2.5mmol/L
各0.2mmol/L
0.2gmol/L
0.2 pμmol/L
0.1pmol/L
质量控制
空白对照：无荧光对数增长，相应的Ct值>50.0。阴性对照：无荧光对数增长，相应的C值>50.0，SN/T3729.9—2013
阳性对照：有荧光对数增长，且荧光通道出现典型的扩增曲线.相应的Ct值<40.0。内参照：有PCR扩增产物，条带大小为159bp。结果判定与表述
结果判定
如Ct值≤45，则判定被检样品阳性。如Ct值≥50.则判定被检样品阴性如45结果表述
样品阳性，表述为“检出桃成分”。样品阴性，表述为“未检出桃成分”11
检测过程中防止交叉污染的措施检测过程中防止交叉污染的措施按照GB/T27403的规定执行
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出口食品及饮料中常见水果品种的鉴定方法第9部分：桃成分检测
实时荧光PCR法
Identification of fruit species in export food and drink-Part 9:Detection of Prunus persica ingredient-Real-time PCR method2013-11-06发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2014-06-01实施
SN/T3729.9—2013
SN/T3729出口食品及饮料中常见水果品种的鉴定方法共分为以下10个部分第1部分：草莓成分检测PCR法；第2部分：杏成分检测
第3部分：梨成分检测
实时荧光PCR法：
实时荧光PCR法：
第4部分：芒果成分检测
第5部分：本瓜成分检测
第6部分：华果成分检测
一第7部分：葡萄成分检测
第8部分：山楂成分检测
实时荧光PCR法；
实时荧光PCR法；
实时荧光PCR法；
PCR法：
实时荧光PCR法；
第9部分：桃成分检测
实时荧光PCR法，
第10部分：香蕉成分检测实时荧光PCR法。本部分为SN/T3729的第9部分。
本部分按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国山东出人境检验检疫局、中华人民共和国上海出人境检验检疫局。
本部分主要起草人：黄文胜、吴亚君、韩建勋、陈题、高宏伟、李想、傅凯、王斌、孙敏1范围
出口食品及饮料中常见水果品种的鉴定方法第9部分：桃成分检测
实时荧光PCR法
SN/T3729.9—2013
SN/T3729的本部分规定了出中食品和饮料中桃成分的实时荧光PCR检测方法。本部分适用于果汁、果酱及其他以水果为原辅料的食品中桃成分的定性检测。本部分所规定方法的最低检出限（LOD）为1%（质量分数）2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的，凡是注且期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T27403实验室质量控制规范食品分子生物学检测3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件
桃Prunuspersica
普薇科梅属桃亚属植物，落叶小乔木。3.2
清汁clarifiedjuice
经过澄清工艺加工，没有浑浊和沉淀的果汁3.3
浊汁cloudyjuice
未经过澄清工艺加工，浑浊但未分层和沉淀的果汁。4缩略语
下列缩略语适用于本文件。
DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonuleicacid）dNTP：脱氧核苷酸三磷酸（deoxyribonuleosidetriphosphate）CTAB：十六烷基三甲基溴化铵（cetyltrithylammoniumbromide）Tris：三羟甲基氨基甲烷（tris(hydroxymethyl)aminomethane）EDTA：乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraaceticacid)Taq：水生栖热菌（Thermusaquaticus）SN/T3729.9-2013
OD光度密度（opticaldensity）5方法提要
提取DNA，以DNA为模板，分别采用桃的特异性检测引物和探针进行实时荧光PCR扩增.观察实时荧光PCR的增幅现象，进行食品及饮料中桃成分的检测鉴定·其中以桃果肉DNA为阳性对照，以非桃来源的DNA为阴性对照，无菌水作为空白对照。6试剂和材料
除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂。实验用水符合GB/T6682的要求。所有试剂均用无DNA酶污染的容器分装。
6.1检测用引物和探针：见表1。表1引物探针序列
引物/探针
内参照5端引物
内参照3端引物
桃5'端引物
桃3°端引物
桃探针
引物/探针序列（5-+3'）
CTTGATTTTACCAAAGATGATGA
TTCTTCGCATGTACCCGCAG
GAATTGCGCCAAGGA AATTG
GAGAGCCGAGATATCCGTTG
FAM-CGGCGTCGTCATCTTCAAATATGTAMAR扩增片段长度
靶基因
植物核酮糖-1.5-二磷
酸羧化酶/加氧酶基因
桃核糖体ITSI
5.8S-ITS2基因
6.2CTAB提取缓冲液.20g/LCTAB.1.4mol/LNaCl.0.1mol/LTris-HCl.0.02mol/LNa,EDTA，pH8.0。
6.3CTAB沉淀液：5g/LCTAB，40mmol/LNaCl6.4
三氯甲烷（氯仿）。
异丙醇。
70%乙醇（体积分数）。
NaCI溶液（1.2mol/L)
10×PCR缓冲液：氯化钾100mol/L，硫酸铵160mmol/L，硫酸镁20mmol/L，Tris-HClkpH8.8）6.8
200mmol/L,TritonX-1001%,BSA1mg/ml.。6.9
氟化镁溶液：2.5mmol/L。
dNTP溶液（dGTP、dCTP、dATP、dTTP或dUTP)：各2.5mmol/L。Taq酶（5U/μL)。
UNG（尿嘧啶-N-糖基化酶）。
仪器设备
实时荧光PCR仪。
7.2核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。7.3恒温水浴锅。
7.4离心机：离心力≥12000g。
SN/T3729.9—2013
微量移液器:0.5μL10μL.10pL~100μL.20μL~200μL,200μL~1000μ。7.5行
研钵及粉碎装置。
涡旋振荡器。
7.8pH计。
量筒：感量50ml。
7.10真空冷冻干燥机。
8检测步骤
8.1DNA提取
8.1.1清汁
将果汁样品上下颠倒均勾。取约30mL果汁至一洁净培养皿中，抽真空冻干：称取0.2g冷冻干物质至一洁净50mL离心管中，然后加人5mLCTAB裂解液，65℃孵育1h，间期不断混勾几次：8000g离心15min，取1mL上清液至1只洁净2.0mL离心管中。然后加人700μL三氟甲烷，剧烈混匀30s.14500g离心10min，取650μL上清液至洁净2.0mL离心管中，加入1300μlCTAB沉淀液，剧烈混匀30s，室温静置1h：14500g离心20min，弃上清液，加人350μl1.2mol/LNaCl.剧烈振荡30s.再加入350μL三氯甲烷，剧烈混勾30s，14500g离心10min；分别取上清液320μL.加入0.8倍体积异丙醇，混勾后，一20℃1h，14500g离心20min弃上清液，加人500μl，70%乙醇，混匀后，14500g离心20min，弃上清液，晾至风干，加30μL双蒸水溶解，一20℃贴存备用。8.1.2浊汁
将果汁样品上下颠倒均勾。取约30mL果汁至一洁净离心管中，8000g离心10min，去上清，加人5mLCTAB裂解液，65℃孵育1h，其余步骤同8.1.1。8.1.3固体样品
称取样品500mg于50mL离心管中，加人5mLCTAB裂解液.65℃孵育1h，其余步骤同8.1.1。8.2DNA浓度和纯度的测定
使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计分别检测260nm和280nm处的吸光值A26和A28。DNA的浓度按照式(1)计算。当A/A比值在1.7～1.9之间时，适宜于PCR扩增。c=AXNX50/1000
式中：
DNA浓度，单位为微克每微升（μg/μL)；A—260nm处的吸光值；
N核酸稀释倍数。
常规PCR扩增
8.3.1常规PCR反应体系
见表2。
SN/T3729.9-2013
10XPCR缓冲液
常规PCR反应体系（25ML）
反应体系中的终浓度
dNTP溶液（各2.5mmol/L）
正向引物（20pmol/L）
反向引物（20pmol/L）
Taq酶（5U/μL)
DNA模板（20ng/μL~100ngL）
常规PCR反应程序
PCR反应程序随仪器不同反应程序略有改变。各0.2mmol/L
0.2μmol/L
0.2μmol/L
般的PCR反应程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，40个循环。72延伸5min。4℃保存。电泳
取2g琼脂糖，于100mL电冰线冲液中加热，充分熔化，加人膜化乙锭忙存液至终浓度为0.5g/mL，制胶，在电泳槽中加人电泳缓冲液，使液面刚刚没过凝胶。将5LμLPCR扩增产物分别和适量加样缓冲液混合，点样。9V/cm恒压电冰，直至漠酚蓝指示剂迁移室凝胶2/3。紫外检测仪下观察电泳结果并记录。
实时荧光PCR扩增
实时荧光PCR反应体系
见表3。
表3实时荧光PCR反应体系（25μL）试剂
10XPCR缓冲液
Mg*+溶液（25mmol/1.）
dNTP落液（各2.5mmol/L）
UNG酶
正向引物（20μmol/L）
反向引物（20imol/L）
探针（10μmol/L）
Ta醇（5U/μL)
DNA模板（20ng/μL~100ng/μL)8.4.2
实时荧光PCR反应程序
95℃预变性10min，95℃15s.60℃1min.50个循环。4
复应体系中的终浓度wwW.bzxz.Net
2.5mmol/L
各0.2mmol/L
0.2gmol/L
0.2 pμmol/L
0.1pmol/L
质量控制
空白对照：无荧光对数增长，相应的Ct值>50.0。阴性对照：无荧光对数增长，相应的C值>50.0，SN/T3729.9—2013
阳性对照：有荧光对数增长，且荧光通道出现典型的扩增曲线.相应的Ct值<40.0。内参照：有PCR扩增产物，条带大小为159bp。结果判定与表述
结果判定
如Ct值≤45，则判定被检样品阳性。如Ct值≥50.则判定被检样品阴性如45
样品阳性，表述为“检出桃成分”。样品阴性，表述为“未检出桃成分”11
检测过程中防止交叉污染的措施检测过程中防止交叉污染的措施按照GB/T27403的规定执行
小提示：此标准内容仅展示完整标准里的部分截取内容，若需要完整标准请到上方自行免费下载完整标准文档。