SN/T 3731.1-2013 食品及饲料中常见禽类品种的鉴定方法 第1部分鹌鹑成分检测 PCR法 SN/T3731.1-2013 标准压缩包解压密码：www.bzxz.net

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T3731.1-—2013
食品及饲料中常见禽类品种的鉴定方法第1部分：成分检测
PCR法
Identification of poultry ingredient in food and feedPart 1:Detection of quail ingredient-PCR method2013-11-06发布
品空自机
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2014-06-01实施
SN/T3731《食品及饲料中常见禽类品种的鉴定方法》共分为以下6个部分：第1部分：鹤鹑成分检测
PCR法；
第2部分：鹅成分检测PCR法；
一第3部分：鸽子成分检测实时荧光PCR法：一第4部分：火鸡成分检测实时荧光PCR法：一第5部分：鸭成分检测PCR法；第6部分：鹧鸪成分检测实时荧光PCR法。本部分为SN/T3731的第1部分。
本部分按照GB/T1,1一2009给出的规则起草。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。SN/T3731.1—2013
本部分起草单位：中国检验检疫科学研究院、深圳市检验检疫科学研究院、中华人民共和国深圳出入境检验检疫局
本部分主要起草人：宗卉、陈颖、阮周曦、张利平、韩建勋、曹琛福、张彩虹、杨俊兴、卢体康、花群义。1范围
食品及饲料中常见禽类品种的鉴定方法第1部分：鹑成分检测PCR法
SN/T3731的本部分规定了食品及饲料中鹤鹑成分检测的PCR方法。本部分适用于食品及饲料中成分的定生检测2规范性引用文件
SN/T3731.1—2013
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T27403实验室质量控制规范食品分子生物学检测3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。3.1
多聚酶链式反应polymerasechainreaction：PCR一种体外扩增DNA的方祛。PCR使用一种耐热的多聚酶，以及两条含有20个左右碱基的单链引物。经过高温变性将模板DNA分离成两条链，低温退火使得引物和一条模板单链结合，然后是中温延伸，反应液的游离核苷酸紧接着引物从5端到3端合成一条互补的新链。而新合成的DNA又可以继续进行上述循环，因此DNA的数自不断倍增。3.2
Taq DNA酶Thermus aquaticus DNA polymerase从Thermusaquaticus细菌中提取的耐热DNA聚合酶。4缩略语
下列缩略语适用于本文件。
dNTP：脱氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleosidetriphosphate）CTAB：十六烷基三甲基溴化铵（cetyltrithylammoniumbromide）Tris：三（羟甲基）氨基甲烷（tris（hydroxymethyl)aminomethane）EDTA：乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraaceticacid)DNAMarker：核酸相对分子质量标准5方法提要
样品经研磨混勾后，提取DNA，以DNA为模板，采用线粒体12sRNA基固特异性检测引物1
SN/T3731.1-2013
进行PCR扩增，经电泳，在245bp大小处观察是否有扩增条带，必要时进行测序，来判断样品中是否存在鹤鹑成分。
试剂和材料
除另有规定外，试剂为分析纯或生化试剂，实验用水符合GB/T6682的要求。所有试剂均用无DNA酶污染的容器分装
6.1检测用引物（对）序列
鹤鹑成分扩增引物详见表1。
表1试验用引物
钨鹑成分5嘴引物
鹤鹑成分3端引物
序列（5-3*）
F.5-TGAGCTCAATAGCCGCCA-3
R：5'-TGGCTTAATGGTTGGGTG-3
目的基因
鹤鹑线粒体12sRNA基因
裂解液：1%CTAB;0.05mol/LTris-HCI10XPCR缓冲液。
硫酸镁。
dNTP混合液。
75%乙醇。
三氯甲烷。
异丙醇。
电泳缓冲液：Tris54g.硼酸27.5g：0.5mol/LEDTA，Tris-HCl(pH8.0)20mL.加蒸馏水至1000mL：使用时10倍稀释。
溴化乙锭（或等效染色剂）
上样缓冲液。此内容来自标准下载网
仪器和设备
离心机（最大离心力大于12000g）。7.1
7.2微量移液器（100μl~1000μL.20μ~200μL.2μL~20，0.5μL~10μ）。7.3热循环仪。
7.4恒温水浴锅。
7.5天平：感量0.001g和0.1g。
7.6涡旋振荡器。
7.7pH计。
7.8电泳仪。
凝胶成像仪。
8检验步骤
样品制备
称取待检样品200g，研磨混匀待用。样品DNA提取
SN/T3731.1—2013
取上述样品50mg于1.5mL离心管中，加入600L~800μL裂解液，65℃作用30min，期间振荡混勾；12000r/min离心5min：转移上清于洁净离心管中，加400μL三氯甲烷-异戊醇（24：1)，混匀：12000r/min离心5min，取上清液：加0.8倍体积异丙醇，沉淀；12000r/min离心5min，弃上清液：75%乙醇洗涤一次，晾干，加人50μL灭菌双蒸水溶解沉淀，制成DNA溶液，保存于一20℃待用。也可用等效DNA提取试剂盒提取样品DNA。8.3PCR扩增
8.3.1反应体系：体积为25μL.包括DNA模板1μL，10×PCR缓冲液（其中Mg+浓度为20mmol/L）2.5μl.,dNTP(2.5mmol/L)2.0μL，上、下游引物（10pmol/μL）各1μl，TaqDNA聚合酶（2U/μl）0.5L，加双蒸水补足25μl.。
8.3.2反应条件：94℃预变性5min然后94℃30s：57℃30s：72℃20s；35个循环，最后72℃延伸3min。反应完成后在4℃下保存。PCR反应条件随不同的PCR仪略有改变。8.4PCR扩增产物电泳检测
制备2%的琼脂糖凝胶并加人溴化乙锭（或等效染色剂）至终浓度为0.5μg/mL。在电泳槽中加人电泳缓冲液，使液面刚刚没过凝胶。将8μL.各PCR扩增产物分别和2L上样缓冲液混合，点样，同时加点合适的DNAMarker，9V/cm恒压，电泳至溴酚蓝指示剂迁移至凝胶2/3以后，但不能跑过胶。凝胶成像仪下观察电泳结果并记录。8.5测序
当电泳结果出现可疑阳性时，将PCR扩增产物进行DNA测序。8.6实验对照
检验过程中分别设阳性对照、阴性对照、空白对照。采用已知含有鹑成分的样品与待检样品等量混合作为阳性对照样品。采用已知不含鹑成分的样品作为阴性对照。采用与模板等体积的双蒸水作为空白对照。
9质量控制
以下条件有一条不满足时，实验视为无效a）空白对照：无PCR扩增产物条带：b)
阴性对照：在245bp大小处未见PCR扩增条带；c
阳性对照：在245bp大小处可见PCR扩增条带。3
SN/T3731.1—2013
结果判定与表述
10.1结果判定
10.1.1在符合第9章的情况下，被检样品在245bp大小处可见PCR扩增条带则判为可疑阳性；在245bp大小处未见PCR扩增条带则判为阴性。10.1.2将可疑阳性的PCR扩增产物进行核酸序列测定，与附录A中鹑线粒体12sDNA基因相对应片段的序列比对，其片段大小正确，同源性达到97%以上，则确证含有鹤成分。10.2结果表述
10.2.1结果为阴性者，表述为“未检出鹤鸦成分”10.2.2结果为可疑阳性者，经测序确证含有鹑成分，表述为”检出鹑成分”：否则，表述为“未检出鹑成分”。
11防污染措施
检测过程中防止交叉污染的措施按照GB/工27403中的规定执行。12方法检出限
本部分所规定方法的最低检出限（LOD)为100g/kg附A
（资料性附录）
鹑成分PCR扩增产物参考序列（线粒体12sRNA区段）SN/T3731.1—2013
TGAGCTCAATAGCCGCCACTAATAAGACAGGTCAAGGTATAGCCTATGGGATGGAAGAAATGGGCTACATTTTCTAAAATAGAACAAACGAAAAAGGACATGAAACCTGGTCCTTGGAAGGAGGATTTAGCAGTAAAATGGGATCACTTTGCCCACTTTAAGATGGCCCTGAGGCACGTACATACCGCCCGTCACCCTCTTCAAAAGCTACTAATACCGATAAATAACACCCAACCATTAAGCCA
小提示：此标准内容仅展示完整标准里的部分截取内容，若需要完整标准请到上方自行免费下载完整标准文档。