SN/T 3736-2013
基本信息
标准号： SN/T 3736-2013
中文名称：国境口岸肠道病毒71型(EV71病毒)实时荧光RT-PCR检测方法
标准类别：商检行业标准(SN)
标准状态：现行
出版语种：简体中文
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相关标签： 国境 口岸 肠道病毒 病毒 实时 荧光 PCR 检测 方法
标准分类号
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出版信息
相关单位信息
标准简介
SN/T 3736-2013 国境口岸肠道病毒71型(EV71病毒)实时荧光RT-PCR检测方法
SN/T3736-2013
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标准内容
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T3736—2013
国境口岸肠道病毒71型（EV71病毒）实时荧光RT-PCR检测方法
Detection method for enterovirus 71(EV71 virus)by real timefluorescenceRT-PCR atfrontierports2013-11-06发布
中华人民共和国
实真价
国家质量监督检验检疫总局
2014-06-01实施
本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。SN/T3736—2013
本标准起草单位：中华人民共和国深圳出人境检验检疫局、深圳市检验检疫科学研究院、中华人民共和国四川出入境检验检疫局。本标准主要起草人：刘胜牙、朱玉兰、田绿波、古莉冰、樊学军、谢聪贤、甄胜西、周连志、曾传萍、孙体东、张妮奇、石莹。
1范围
国境口岸肠道病毒71型（EV71病毒实时荧光RT-PCR检测方法
SN/T3736—2013
本标准规定了国境口岸手足口病EV71病毒检测的生物安全要求，标本的采集、运输和保存，标本的处理.EV71病毒实时荧光RT-PCR检测方法。本标准适用于国境口岸人出境人员携带EV71病毒的分子生物学检测。2
规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB19489实验室生物安全通用要求WS233微生物和生物医学实验室生物安全通用准则可感染人类的高致病性病原微生物菌（毒）种或样本运输管理规定（中华人民共和国卫生部令第45号）
人间传染的病原微生物菌（毒）种保藏机构管理办法（卫生部）3www.bzxz.net
术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。3.1
肠道病毒71型Enterovirus71
引起手足口病的主要病原体之一。属于小RNA病毒科（picornaviridae）中的肠道病毒属（enterovirus），A组肠道病毒。EV71病毒是单正链的无包膜RNA病毒，小球形（直径20nm～30nm）、20面体对称结构。
缩略语
下列缩略语适用于本文件
RT-PCR：逆转录聚合酶链式反应（Reversetranscription-polymerasechainreaction）Ct值：循环阅值，每个反应管内的荧光信号达到设定的阅值时所经历的循环数（Cyelethreshold）RNA：核糖核酸(Ribonucleicacid)FAM：6-羧基荧光素，一种荧光报告基团（6-carboxy-fluorescein）TAMARA：6-羧基四甲基若丹明一种荧光萍灭基团（6-carboxytetramethylrhodamine）5
生物安全要求
5.1个人防护遵循GB19489。
SN/T3736—2013
实验室应遵循GB19489和WS233对生物安全2级（BSL-2)实验室的生物安全要求。使用过的实验用品应遵照GB19489对废弃物的处理要求进行无害化处理。5.3
凝似人感染EV71病毒的材料的包装及转运应符合中华人民共和国卫生部第45号令。实验仪器设备
6.1荧光定量PCR仪。
6.2超净工作台。
6.3生物安全柜。
6.4高压灭菌锅。
6.5低温高速离心机：最大高心力20.000g旋涡摄荡器。
冰箱：4℃、-20℃和-70℃。
移液器：10μL、20μ、100200μL和1mL6.9
道温水浴锅。
无菌注射器。
7试剂
除另有规定外，所有试剂均采用分析纯7.1标本保存液：在新鲜配制的190mLEaglesMEM中加人-56℃热灭活30min的胎牛血清4mL、2mL庆大霉索（5000μg/mL）、2mL两性霉索B（250/g/mL）和2mL青链霉素（青霉索G10000U/mL链素10000μg/mL)，用7.5%碳酸氢钠溶液调至/pH值为7.27.2核酸提取试剂：用德国Qiagen公司QIAampViralRNAKit提取病毒核酸7.3实时荧光RT-PCR试剂：TAKARA公司OnesteprealtimeRT-PCRkit：7.4无RNA薄的DEPC水。
7.5引物和探针序列见表1。
表1EV71病毒实时荧光RT-PCR检测的引物和探针（参考毒株GenBank序列号：HM002489.1）可引物/探针名称
8检测程序
TGACGAGAGCATGATTGAGACA
CCGCRCTGCTGAAGAAACTA
FAM-CTTAACTCGCACAGYACAGCTGAGACCAC-TAMARA8.1标本的采集、运输和保存
8.1.1咽拭子或疱疹液
位置（bp）
2615-2636
2681-2700
2646-2674
扩增片段
预期扩增片段为
采集疑似手足口病的病人发病3d内的咽拭子或疱疹液标本，用于病原检测。用专用采样棉签，适1》由指定单位提供，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。2
SN/T3736-—2013
度用力拭抹咽后壁和两侧扁桃体部位，应避免触及舌部，采集咽拭子标本；用无菌注射器，适度用力挑破疱疹，用专用采样棉签适度用力拭抹，采集疱疹液标本：退速将采集标本的棉签放入装有2mL～3mL保存液的15ml.外螺旋盖采样管中，在靠近顶端处折断棉签杆.旋紧管盖并密封以防干燥，外表贴上带有唯一识别号码的标签。
8.1.2粪便
使用洁净、无菌的标本采集盒·采集怀疑感染EV71病毒病人的类便标本。粪便标本在发病首日采集，至多不能超过急性期（48h~72h）.每份稀便标本量约1ml~5ml.软便标本量大于8g。8.2标本的保存和运送
标本的运送过程要冷截。标本的保存和运输的生物安全要求参照卫生部颁布的人间传染的病原微生物菌（毒）种保藏机构管理办法》和中华人民共和国卫生部第45号令。标本采集后不能立即检测的，应在2℃～8℃购存，最多不能超过72h，长期存的条件是一20℃或以下。8.3标本的处理
8.3.1咽拭子或疱疹液标本
将咽拭子或疱疹液标本置于旋涡振荡器混匀，室温静置10min.取140xL上清液进行试验。8.3.2粪便标本
加入1ml.标本保存液至1.5ml离心管中，加入约0.1g软便标本或0.1ml.稀便标本，置于旋涡振荡器混匀室温静置10min，室温下，2800g离心5min.取140L上清液进行试验。8.4核酸提取
8.4.1吸取140uL咽拭子标本、或疱疹液标本或粪便标本处理液加入溶解的560L裂解液AVL。8.4.2脉冲混匀15s.置于室温10min。8.4.3短暂离心，加人560μL乙醇（96%~100%）脉冲混匀15g。8.4.4短暂离心。
8.4.5将QlAamp旋转柱置于2mL收集管中，从步骤3（8.4.3）中吸取630L溶液转移至旋转柱上，6000g离心1min，将旋转柱放至干净的收集管上，丢弃包含过滤液的收集管。8.4.6打开旋转柱盖，重复步骤5（8.4.5）。8.4.7打开旋转柱盖，加人500μL洗液AW1，盖紧盖子，6000离心1min。将旋转柱放至干净的收集管上，丢弃包含过滤液的收集管。8.4.8打开旋转柱盖，加人500L洗液AW2，盖紧盖子20000g离心3min。将旋转柱放至干净的收集管上，20000g再离心1min。将旋转柱放至干净的1.5mL离心管上，去弃包含过滤液的收集管。8.4.9打开旋转柱盖，加人60μL室温平衡的缓冲液AVE。8.4.10盖紧盖子，室温放置1min8.4.116000g离心1min。
收集滤出液，用于实时荧光RT-PCR扩增。一20℃或一70℃储存RNA。8.4.12
8.5荧光PCR反应程序
准备实时荧光RT-PCR反应液，设25L反应体系，每个待检标本反应液的组成为：2×OneStepRTPCR缓冲液3为12.5μL、TaKaRaExTagHS0.5μLPrmieScripRTEnzymeMix2为0.5μL、40μmol/LSN/T3736-—2013
VFP0.2μL.40μmol/LVRP0.2μL,10μmol/LProbe0.5μL,ROXDyeII0.5μL、RnaseFreedH,O5.1L、模板RNA5L。同时设立阴性对照和阳性对照，阳性对照模板为根据EV71病毒核苷酸序列体外合成的RNA片段或培养病毒的RNA，阴性对照模板为不含EV71病毒核酸的标本。在不同的荧光定量PCR仪上，TagMan探针实时荧光RT-PCR的反应条件略有不同。以ABI7500荧光定量PCR仪为例，实时荧光RT-PCR检测扩增程序为：42C5min.95C10S：95℃5.58C34$（收集荧光信号），45个循环。如使用其他仪器，应根据其他仪器的要求设置具体的反应条件。8.6结果分析
8.6.1阅值确定
阔值确定的方法对所有的标本都是统一的，一般是以荧光PCR反应的前3～15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，以本底信号标准差的10倍作为荧光阅值，以标本扩增产生的荧光信号达到荧光励值时所对应的循环数为循环阐值(Ct值）。8.6.2质量控制
反应结果应同时符合以下2个条件：阴性对照无扩增曲线：
阳性对照Ct<38并有明显扩增曲线。8.7结果判定
选择FAM荧光通道。并根据以下条件进行结果判定：无Ct值或Ct>38，且无明显扩增曲线判断为EV71病毒荧光RT-PCR检测阴性：Ct值38.并有明显扩增曲线·判断为EVT1病毒荧光RT-PCR检测阳性38Ct值40的标本应重做，若重做结果仍然有明显扩增曲典线，Ct值40.判断为EV7病毒荧光RT-PCR检测阳性，否则为阴性。书号：155066·2-26935
SN/T3736-2013
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国境口岸肠道病毒71型（EV71病毒）实时荧光RT-PCR检测方法
Detection method for enterovirus 71(EV71 virus)by real timefluorescenceRT-PCR atfrontierports2013-11-06发布
中华人民共和国
实真价
国家质量监督检验检疫总局
2014-06-01实施
本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。SN/T3736—2013
本标准起草单位：中华人民共和国深圳出人境检验检疫局、深圳市检验检疫科学研究院、中华人民共和国四川出入境检验检疫局。本标准主要起草人：刘胜牙、朱玉兰、田绿波、古莉冰、樊学军、谢聪贤、甄胜西、周连志、曾传萍、孙体东、张妮奇、石莹。
1范围
国境口岸肠道病毒71型（EV71病毒实时荧光RT-PCR检测方法
SN/T3736—2013
本标准规定了国境口岸手足口病EV71病毒检测的生物安全要求，标本的采集、运输和保存，标本的处理.EV71病毒实时荧光RT-PCR检测方法。本标准适用于国境口岸人出境人员携带EV71病毒的分子生物学检测。2
规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB19489实验室生物安全通用要求WS233微生物和生物医学实验室生物安全通用准则可感染人类的高致病性病原微生物菌（毒）种或样本运输管理规定（中华人民共和国卫生部令第45号）
人间传染的病原微生物菌（毒）种保藏机构管理办法（卫生部）3www.bzxz.net
术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。3.1
肠道病毒71型Enterovirus71
引起手足口病的主要病原体之一。属于小RNA病毒科（picornaviridae）中的肠道病毒属（enterovirus），A组肠道病毒。EV71病毒是单正链的无包膜RNA病毒，小球形（直径20nm～30nm）、20面体对称结构。
缩略语
下列缩略语适用于本文件
RT-PCR：逆转录聚合酶链式反应（Reversetranscription-polymerasechainreaction）Ct值：循环阅值，每个反应管内的荧光信号达到设定的阅值时所经历的循环数（Cyelethreshold）RNA：核糖核酸(Ribonucleicacid)FAM：6-羧基荧光素，一种荧光报告基团（6-carboxy-fluorescein）TAMARA：6-羧基四甲基若丹明一种荧光萍灭基团（6-carboxytetramethylrhodamine）5
生物安全要求
5.1个人防护遵循GB19489。
SN/T3736—2013
实验室应遵循GB19489和WS233对生物安全2级（BSL-2)实验室的生物安全要求。使用过的实验用品应遵照GB19489对废弃物的处理要求进行无害化处理。5.3
凝似人感染EV71病毒的材料的包装及转运应符合中华人民共和国卫生部第45号令。实验仪器设备
6.1荧光定量PCR仪。
6.2超净工作台。
6.3生物安全柜。
6.4高压灭菌锅。
6.5低温高速离心机：最大高心力20.000g旋涡摄荡器。
冰箱：4℃、-20℃和-70℃。
移液器：10μL、20μ、100200μL和1mL6.9
道温水浴锅。
无菌注射器。
7试剂
除另有规定外，所有试剂均采用分析纯7.1标本保存液：在新鲜配制的190mLEaglesMEM中加人-56℃热灭活30min的胎牛血清4mL、2mL庆大霉索（5000μg/mL）、2mL两性霉索B（250/g/mL）和2mL青链霉素（青霉索G10000U/mL链素10000μg/mL)，用7.5%碳酸氢钠溶液调至/pH值为7.27.2核酸提取试剂：用德国Qiagen公司QIAampViralRNAKit提取病毒核酸7.3实时荧光RT-PCR试剂：TAKARA公司OnesteprealtimeRT-PCRkit：7.4无RNA薄的DEPC水。
7.5引物和探针序列见表1。
表1EV71病毒实时荧光RT-PCR检测的引物和探针（参考毒株GenBank序列号：HM002489.1）可引物/探针名称
8检测程序
TGACGAGAGCATGATTGAGACA
CCGCRCTGCTGAAGAAACTA
FAM-CTTAACTCGCACAGYACAGCTGAGACCAC-TAMARA8.1标本的采集、运输和保存
8.1.1咽拭子或疱疹液
位置（bp）
2615-2636
2681-2700
2646-2674
扩增片段
预期扩增片段为
采集疑似手足口病的病人发病3d内的咽拭子或疱疹液标本，用于病原检测。用专用采样棉签，适1》由指定单位提供，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。2
SN/T3736-—2013
度用力拭抹咽后壁和两侧扁桃体部位，应避免触及舌部，采集咽拭子标本；用无菌注射器，适度用力挑破疱疹，用专用采样棉签适度用力拭抹，采集疱疹液标本：退速将采集标本的棉签放入装有2mL～3mL保存液的15ml.外螺旋盖采样管中，在靠近顶端处折断棉签杆.旋紧管盖并密封以防干燥，外表贴上带有唯一识别号码的标签。
8.1.2粪便
使用洁净、无菌的标本采集盒·采集怀疑感染EV71病毒病人的类便标本。粪便标本在发病首日采集，至多不能超过急性期（48h~72h）.每份稀便标本量约1ml~5ml.软便标本量大于8g。8.2标本的保存和运送
标本的运送过程要冷截。标本的保存和运输的生物安全要求参照卫生部颁布的人间传染的病原微生物菌（毒）种保藏机构管理办法》和中华人民共和国卫生部第45号令。标本采集后不能立即检测的，应在2℃～8℃购存，最多不能超过72h，长期存的条件是一20℃或以下。8.3标本的处理
8.3.1咽拭子或疱疹液标本
将咽拭子或疱疹液标本置于旋涡振荡器混匀，室温静置10min.取140xL上清液进行试验。8.3.2粪便标本
加入1ml.标本保存液至1.5ml离心管中，加入约0.1g软便标本或0.1ml.稀便标本，置于旋涡振荡器混匀室温静置10min，室温下，2800g离心5min.取140L上清液进行试验。8.4核酸提取
8.4.1吸取140uL咽拭子标本、或疱疹液标本或粪便标本处理液加入溶解的560L裂解液AVL。8.4.2脉冲混匀15s.置于室温10min。8.4.3短暂离心，加人560μL乙醇（96%~100%）脉冲混匀15g。8.4.4短暂离心。
8.4.5将QlAamp旋转柱置于2mL收集管中，从步骤3（8.4.3）中吸取630L溶液转移至旋转柱上，6000g离心1min，将旋转柱放至干净的收集管上，丢弃包含过滤液的收集管。8.4.6打开旋转柱盖，重复步骤5（8.4.5）。8.4.7打开旋转柱盖，加人500μL洗液AW1，盖紧盖子，6000离心1min。将旋转柱放至干净的收集管上，丢弃包含过滤液的收集管。8.4.8打开旋转柱盖，加人500L洗液AW2，盖紧盖子20000g离心3min。将旋转柱放至干净的收集管上，20000g再离心1min。将旋转柱放至干净的1.5mL离心管上，去弃包含过滤液的收集管。8.4.9打开旋转柱盖，加人60μL室温平衡的缓冲液AVE。8.4.10盖紧盖子，室温放置1min8.4.116000g离心1min。
收集滤出液，用于实时荧光RT-PCR扩增。一20℃或一70℃储存RNA。8.4.12
8.5荧光PCR反应程序
准备实时荧光RT-PCR反应液，设25L反应体系，每个待检标本反应液的组成为：2×OneStepRTPCR缓冲液3为12.5μL、TaKaRaExTagHS0.5μLPrmieScripRTEnzymeMix2为0.5μL、40μmol/LSN/T3736-—2013
VFP0.2μL.40μmol/LVRP0.2μL,10μmol/LProbe0.5μL,ROXDyeII0.5μL、RnaseFreedH,O5.1L、模板RNA5L。同时设立阴性对照和阳性对照，阳性对照模板为根据EV71病毒核苷酸序列体外合成的RNA片段或培养病毒的RNA，阴性对照模板为不含EV71病毒核酸的标本。在不同的荧光定量PCR仪上，TagMan探针实时荧光RT-PCR的反应条件略有不同。以ABI7500荧光定量PCR仪为例，实时荧光RT-PCR检测扩增程序为：42C5min.95C10S：95℃5.58C34$（收集荧光信号），45个循环。如使用其他仪器，应根据其他仪器的要求设置具体的反应条件。8.6结果分析
8.6.1阅值确定
阔值确定的方法对所有的标本都是统一的，一般是以荧光PCR反应的前3～15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，以本底信号标准差的10倍作为荧光阅值，以标本扩增产生的荧光信号达到荧光励值时所对应的循环数为循环阐值(Ct值）。8.6.2质量控制
反应结果应同时符合以下2个条件：阴性对照无扩增曲线：
阳性对照Ct<38并有明显扩增曲线。8.7结果判定
选择FAM荧光通道。并根据以下条件进行结果判定：无Ct值或Ct>38，且无明显扩增曲线判断为EV71病毒荧光RT-PCR检测阴性：Ct值38.并有明显扩增曲线·判断为EVT1病毒荧光RT-PCR检测阳性38Ct值40的标本应重做，若重做结果仍然有明显扩增曲典线，Ct值40.判断为EV7病毒荧光RT-PCR检测阳性，否则为阴性。书号：155066·2-26935
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