SN/T 3739-2013 国境口岸森林脑炎病毒检测方法 实时荧光RT-PCR法 SN/T3739-2013 标准压缩包解压密码：www.bzxz.net

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T3739—2013
国境口岸森林脑炎病毒检测方法实时荧光RT-PCR法
Detection method for tick-borne encephalitis virus at frontier ports-Real-timefluorescenceRT-PCR
2013-11-06发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2014-06-01实施
本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。SN/T3739-2013
本标准起草单位：中华人民共和国天津出入境检验检疫局、中华人民共和国吉林出人境检验检疫局、上海之江生物科技股份有限公司。本标准主要起草人：李智慧、詹曦菁、杨春江、杨顺义、窦勇鹰、刘阳、朱旭平、朱勤玮。1
1范围
国境口岸森林脑炎病毒检测方法实时荧光RT-PCR法
SN/T3739—2013
本标准规定了国境口岸入出境人员或蜱携带森林脑炎病毒的实时荧光RT-PCR检测，包括检测对象，标本采集和处理，检测程序，结果判定。本标准适用于国境口岸入出境人员或蜱携带森林脑炎病毒的实验室检测。2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。人间传染的病原微生物名录（卫生部2006年）3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。3.1
森林脑炎病毒tick-borneencephalitisvirus俄罗斯春夏脑炎病毒Russian spring-summerencephalitis virus黄病毒科黄病毒属成员，为单股正链RNA病毒，mRNA全长10886bp。该病毒根据系统发生学分为欧洲亚型、远东亚型和西伯利亚亚型三个亚型。该病毒所引起的森林脑炎为一种自然疫源性疾病。本病毒的储存宿主众多，传播媒介主要为蜱，易感人群多因被携带有病毒的蜱叮咬后发病。3.2
实时荧光RT-PCRreal-timeRT-PCR实时荧光RT-PCR方法有多种，本标准采用的是TaqMan水解探针法，其原理是在带规RT-PCR的基础上，加人一条特异性的荧光探针，该探针为一条赛核苷酸，两边分别标记一个荧光报告基团和一个荧光淬灭基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被萍灭基团吸收，PCR扩增时，利用Tag酶的5°-3外切酶活性将探针酶切水解，使荧光报告基团和荧光率灭基团分离，从而荧光监测系统可以接收到荧光信号。每经过一个PCR循环，荧光信号也和目的片段一样，有一个同步指数增长的过程，信号的强度与检测对象的核酸含量成正比，可根据数学模型计算出检测对象的含量。4缩略语
下列缩略语适用于本文件。
BHQ：黑洞淬灭基团（blackholequencher)）Ct值：循环阅值，每个反应管的荧光信号达到设定阈值时所经历的循环数（cyelethreshold）DEPC：焦碳酸二乙酯（diethylpyrocarbonate）FAM.6-羧基荧光素，一种荧光报告基团（6-carboxy-fluorescein）1
SN/T3739—2013
RNA：核糖核酸（ribonucleic acid）RT-PCR：逆转录聚合酶链式反应（reversetranscription-polymerasechainreaction）5生物安全要求
中华人民共和国卫生部发布的《人间传染的病原微生物名录》规定，森林脑炎病毒危害程度分类为第一类，所有有关森林脑炎病毒的实验室操作应按照以下规定执行森林脑类病毒培养和动物感染实验应在生物安全三级（BSL-3或ABSL-3>实验室内进行；未经培养的森林脑炎病毒感染性材料的操作应在生物安全三级（BSL-3)实验室内进行：森林脑炎病毒相关的灭活材料和无感染性材料操作可在生物安全一级（BSL-1)实验室内进行在保证安全的前提下，对临床和现场的未知样本检测操作可在生物安全二级或以上防护级别的实验室进行，涉及病毒分离培养的操作，应加强个体防护和环境保护。要密切注意流行病学动态和临床表现，判断是否存在高致病性病原体，若判定为疑似高致病性病原体，应在相应生物安全级别的实验室开展工作；森林脑炎病毒感染性材料运输包装分类为A类（仅培养物为A类），UN编号为UN2814。6对象
本标准适用的检测对象为：
疑似感染森林脑炎病毒的出人境人员；携带森林脑炎病毒的蜱。
7仪器和设备
本检测方法需要如下仪器设备：荧光定量PCR仪；
生物安全柜：
普通冰箱；
超低温冰箱（-70℃）；
普通台式离心机：
高速冷冻离心机（转速可达13000r/min）；微量可调移液器（0.1μL-10μL.20μL-200μL、1mL）及配套带滤芯吸头：离心管（0.2mL、1.5mL)；
匀浆器（5mL)；
涡旋器。
8试剂
核酸提取试剂
本标准涉及的核酸提取试剂包括：a)
商品化的RNA提取试剂盒。
Trizol总RNA抽提试剂：含有苯酚、异硫氰酸胍等物质。三氯甲烷：用于核酸与蛋白的分离。d)
异丙醇：用于RNA的沉淀
75%乙醇：无水乙醇与DEPC水按体积比3：1混匀。用于RNA的洗涤。e
DEPC水：终浓度含0.1%DEPC的水。用于RNA的溶解及作为空白对照。8.2实时荧光RT-PCR试剂
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由相应商品化试剂盒提供。以上海之江生物科技股份有限公司相应试剂为例，实时荧光RTPCR试剂包括以下组分：
RT-PCRmix含逆转录缓冲液、dNTP混合液、RNaseinhibitor）；a)
RT-PCR酶（含逆转录酶、TaqDNA聚合酶）；b)
阴性对照品”；
阳性对照品（人工制备含目的片段的质粒）3；e
引物及探针（详见8.3）。
实时荧光RT-PCR检测的引物和探针8.3
森林脑炎病毒三种亚型的通用引物及探针序列如下：一上游引物TBEV-F（5-3）：GGGCGGTTCTTGTTCTCC一下游引物TBEV-R(5-3\）：ACACATCACCTCCTTGTCAGACT—探针TBEV-PC5-3)：FAM-TGAGCCACCATCACCCAGACACA-BHQ19检测程序
标本的采集、处理和保存血清
9.1.1疑似感染患者标本
人血清标本
用无菌的一次性针筒抽取疑似感染森林脑炎病毒患者静脉血2mL，置于灭菌的一次性试管中，取分离出的血清密闭送检，或一70℃以下保存待检。9.1.1.2人血浆标本
用无菌的一次性针筒抽取疑似感染森林脑炎病毒患者静脉血2mL，置于灭菌的一次性非肝素抗凝试管中，取分高出的血浆密闭送检，或一70℃以下保存待检。9.1.1.3人脑脊液标本
抽取患者脑脊液0.5mL，置于灭菌的一次性试管中密闭送检，或一70℃以下保存待检。9.1.2标本
根据实际工作需要采集蜱标本。采集时用镀子夹敢，放人铺垫有潮湿滤纸或纱布的试管中，用纱布1）给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如有其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。
阴性对照为不含森林脑炎病毒核酸的标本23
阳性对照可为森林脑炎病毒核酸，也可为根据森林脑炎病毒核苷酸序列体外合成的RNA片段，或是森林脑炎3）
病毒核苷酸序列的基固工程载体。3
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包紧瓶口以防止蜱爬出，立即送检或置于一70℃保存待检。9.2病毒核酸提取
商品化RNA提取试剂盒提取核酸
用商品化的RNA提取试剂盒处理标本，具体操作参见该试剂盒说明书。9.2.2Trizol法提取核酸
9.2.2.1疑似感染患者标本
取100μL病人的血清、血浆或脑脊液置手1.5-ml高心管中，加人300μLTrizol,反复用枪吹打或剧烈振荡以裂解细胞。之后在室温15℃~30℃下放置5min加人100pL三氧甲烷，盖上管盖，混匀器上振满混匀5s或颠倒混勾15次.在室温下（15℃-30℃）放置2mn~3min后，4℃16000g离心15min，吸取上层液体，加人等体积异两醇，颠倒混匀，室温静置10min4℃16000g离心10min，轻轻倒去上清液，加人700μL75%乙醇，颠倒洗涤，4C500g离心5min，轻轻倒去上清液，倒置于吸水纸上，弃尽液体或1500g离心5$，将管壁上的残余液体甩到管底部，用微量加样器尽量吸干液体，加入20uLDEPC水溶解RNA，-20℃保存待检9.2.2.2蜱标本
将采集的蜱1～5只为一组，置于5mL的勾浆臂中，加人1mlTrizol液，在冰上研磨至勾浆。匀浆液立即进行核酸提取。向蜱勾浆标本中直接加入0.2mL氧仿，盖工管盖，混勾器上振荡混匀5s或颠倒混匀15次，在室温下（15℃~30℃）放置2min~3mim后，4℃16000g离心15min，吸取上层液体，加入等体积异丙醇，颠倒混勾，室温静置10min4℃16000g离心10min，轻轻倒去上清液：加入700pL75%乙醇，颠倒洗涤，4℃7500g离心5mim，轻轻倒去工清液，倒置于吸水纸上，弃尽液体或1500g离心5s，将管壁上的残余液体用到管底部用微量加样器尽量吸干液体，加人20μLDEPC水溶解RNA。20C保存待检。
9.2.3LightCycler1.0或LightCycler2.0系列仪器检测步骤9.2.3.1
荧光定量PCR反应液配制
设20μL反应体系，每个待检标本反应液（15μL）的组成为a）DEPC水
b）2XRT-PCRmix
RT-PCR酶
20μmol/LTBEV-F
20μmol/LTBEV-R
50μmol/LTBEV-P
0.5μL(600nmol/L);
0.5μL(600nmol/L);
0.3μL(100nmol/L)。
振荡混勾数秒，1500g离心数秒。9.2.3.2加样
取上述混合液15μL置于0.2mLPCR管中，然后将待检标本RNA、阳性对照品、阴性对照品各5μL分别加人上述PCR管中，盖好管盖，立即进行PCR扩增反应。9.2.3.3PCR扩增
反应管置于实时荧光定量PCR仪上，荧光通道检测选用FAM通道。4
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扩增程序为：45℃10min；95℃15min；再按95℃5s-60℃30s，循环45次；单通道荧光检测在60℃。
9.2.4ABI系列及其他仪器系列检测步骤9.2.4.1荧光定量PCR反应液配制设25μL反应体系，每个待检标本反应液（20μL)的组成为：a）DEPC水
b）2XRT-PCRmix
RT-PCR酶
d)20μmol/LTBEV-F
e)20μmol/LTBEV-R
f)50μmol/LTBEV-P
-0.5μl(600nmol/l）
0.5μL(60onmol/L):wwW.bzxz.Net
0.3μL(100nmol/L)
振荡混匀数秒，1500g高心数秒。9.2.4.2加样
取上述混合液20μL置于0.2mLPCR管中，然后将待检标本RNA，阳性对照品、阴性对照品各5μL分别加人上述PCR管中，盖好管盖，立即进行PCR扩增反应。9.2.4.3PCR扩增
反应管置于实时荧光定量PCR仪上，荧光通道检测选用FAM通道。扩增程序为：45℃10min；95℃15min；再按95℃15s-60℃60s循环45次，单通道荧光检测在60℃。
10结果判定及报告
10.1基线和对照
基线和阀值采用手动设置，阅值设定原则以阅值线刚好超过阴性对照品的检测荧光曲线的最高点，也可根据仪器噪音情况调整。阳性对照可为森林脑炎病毒核酸，也可为根据森林脑炎病毒核苷酸序列体外合成的RNA片段，阴性对照为不含森林脑炎病毒核酸的标本。10.2实时荧光RT-PCR反应的质量控制PCR反应各对照品应同时达到以下要求，否则试验视为无效：阴性对照无扩增曲线。
一阳性对照Ct<35，且有明显扩增曲线。10.3实时荧光RT-PCR检测结果判定10.3.1
无Ct值或Ct>40，且无明显扩增曲线。报告为森林脑炎病毒荧光RT-PCR检测阴性。ABI系列是指AB17000、ABI7300、ABI7500、ABI7900等荧光PCR仪，其他仪器系列是指除罗氏LightCycler1.04）
和2.0及ABI系列之外的其他实时荧光定量PCR仪，如LightCyclerR480、MJ-chromo4、MX3000P、MX3005P、SmartCyclerIIRotor-Gene6000、iCrcleriQ4、iCrcleriQ5、Bio-RadCFX96、SLAN等多色荧光PCR仪和PET5700Mj-Opticon等单色荧光PCR仪。
SN/T3739—2013
Ct值≤40，并有明显扩增曲线。报告为森林脑炎病毒荧光RT-PCR检测阳性。10.3.3
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