SN/T 3742-2013 国境口岸西尼罗病毒检测方法 实时荧光RT-PCR法 SN/T3742-2013 标准压缩包解压密码：www.bzxz.net

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T3742--2013
国境口岸西尼罗病毒检测方法
实时荧光RT-PCR法
Detection method for West Nile Virus at frontier ports-Real-timefluorescenceRT-PCR
2013-11-06发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2014-06-01实施
本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。SN/T3742—2013
本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国深圳出人境检验检疫局、中华人民共和国腾冲出人境检验检疫局。
本标准主要起草人：胡孔新、杨鹏飞、侯中生、史蕾、张丽萍、徐焕洲、孙肖红、杨宇、刘丽娟、王静。1范围
国境口岸西尼罗病毒检测方法
实时荧光RT-PCR法
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本标准规定了国境口西尼罗病毒感染疑似病例或蚊携带西尼罗病毒核酸实时荧光RT-PCR检测方法，包括标本采集、保存及转运、样本处理、检测方法结果判定及报告。本标准适用于国境口西尼罗病毒感染疑似病例或蚊携带西尼罗病毒的实验室检测。2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB19489实验室生物安全通用要求WS233微生物和生物医学实验室生物安全通用准则可感染人类的高致病性病原微生物菌（毒）种或样本运输管理规定（中华人民共和国卫生部令第45号）
3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件
西尼罗病毒WestNileVirus
属于黄病毒科（Flaviviridae）黄病毒属（Flaviuirus）单股正链RNA病毒，具有黄病毒成员的典型特征，病毒颗粒为直径约40nm~60nm的球型，约25nm的核衣壳外包裹着脂质双分子膜。WNV是全球广泛流行的一种病毒，蚊虫是最主要的传播媒介，鸟是该病毒的存宿主，也是WNV感染的主要传染源，病毒可在鸟体内大量紫殖并形成高带毒量的病毒血症，主要引起人和哺乳动物的西尼罗热和西尼罗脑炎。
4检测对象
国境口岸西尼罗病毒感染疑似病例或截获的蚊虫。5实验室生物安全要求
检测工作中的个人防护遵照GB19489生物安全应遵照GB19489和WS233对生物安全2级（BSL-2)实验室的生物安全要求。5.2
使用过的实验用品应遵照GB19489对废弃物的处理要求进行无害化处理。5.3
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6仪器设备与试剂
6.1仪器设备
常用仪器设备如下：
超净工作台：
二级生物安全柜；
微型混合器、涡旋振荡器：
超低温冰箱（一70℃及以下）；一普通台式离心机；
高速冷冻离心机（离心力可达20000g）；一可调式微量加样器（10μL、100μL、1000μL）及配套带滤芯吸头；荧光PCR检测仪（如：LightCycler、ABIPrism7500、ABIPrism7000型等）。6.2试剂
带用试剂如下：
商品化系统如BDUniversalViralCulturetteTMTransportSystem；Ag-Path-IDTMone-stepRT-PCR试剂盒。1)7
样本采集、保存与转运
7.1样本采集
人血清样本：采集疑似病例的静脉血3mL~5mL，室温静置30min使其凝固，然后1500r/min~7.1.1
2000r/min离心10min，去除纤维蛋白和红血球，收集血清于2mL无菌螺口塑料管中。蚊样本：根据实际工作需要采集蚊虫样本，按1～5只或适量为一组，装人2mL螺口塑料管内。7.1.2
7.2样本的保存
采集的人血清样本或分类分组后的蚊虫样本，装入螺口塑料血清管，用耐低温油性记号笔记上编号，于一70℃以下保存待检。
7.3样本转运
疑似人感染西尼罗病毒感染材料的包装及转运应符合中华人民共和国卫生部第45号令。8样本处理
8.1疑似病例血清样本
无需处理可直接提取核酸进行检测，如不能及时检测应存放在一70℃以下冰箱。1》由指定单位提供，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。2
8.2蚊虫样本
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在冰上操作。取出蚊样本，倒人研磨器中，加人1mL标本处理液，反复研磨至勾浆，置于4℃预冷的离心机上，12000r/min离心10min。取上清液进行核酸提取，剩余的蚊标本研磨液需保存在一70℃以下以备复查。
9样本检测方法
9.1样本的核酸提取
9.1.1样本核酸提取采用QIAampViralRNAKit病毒RNA提取试剂盒进行或其他等效核酸提取方法，实际操作时按试剂盒说明书进行。以下给出所提供试剂盒QIAampViralRNAKit的具体操作步骤案例：
9.1.2将采集的样本平衡至室温。9.1.3用移液器吸取310μL无核酸酶的水加人到310μg的CarrierRNA中，使CarrierRNA彻底溶解，得到终浓度为1μg/μL的CarrierRNA水溶液。9.1.4根据样本的数量（n），先吸取裂解液（n×0.56）mL，再吸取CarrierRNA水溶液（nX5.6）μL将两者进行充分混勾，每管分装0.56mL。注：剩余CarrierRNA水溶液应及时分装到无核酸酶的离心管中，一20C保存，避免反复冻融、9.1.5向每管CarrierRNA-裂解缓冲液中加入140μL的血清标本或蚊标本研磨液，混匀后旋振荡15s。
9.1.6加人560μL的无水乙醇，并涡旋振荡15s。9.1.7吸取离心管中的630μL混合液（包括CarrierRNA裂解缓冲液、含血清标本或蚊标本研磨液及无水乙醇），转移到带有离心管的吸附柱内，以8000r/min离心1min。9.1.8弃掉废液，将吸附柱放回收集管，将剩余的630μL混合液转移至带有离心管的吸附柱内，以8000r/min离心1min。
9.1.9弃掉废液，将吸附柱放回收集管并向吸附柱内加人缓冲液AW1（使用前检查是否已加人无水乙醇）500μL.8000r/min离心1min。9.1.10弃掉废液，将吸附柱放回收集管并向吸附柱内加人漂洗液AW2（使用前检查是否已加入无水乙醇）500μL，14000r/min离心1min。9.1.11弃掉废液，将吸附柱放回收集管，14000r/min离心30s，弃掉废液。9.1.12将吸附柱放置在一支无核酸酶的离心管上，并向离心柱内加人50μL的无核酸酶的水，室温静置2min。
9.1.13以14000r/min，离心2min，弃掉吸附柱，离心管内的液体即为病毒的核酸水溶液，做好标记一80℃保存待用。
9.2样本的核酸实时荧光RT-PCR检测方法9.2.1待Ag-Path-IDMone-stepRT-PCR试剂盒的各组分充分融化后，先将各试剂进行离心30s+然后开始实验。对于等效的试剂盒中一步法或两步法进行的荧光定量PCR时，应根据实际情况进行适当2）由指定单位提供，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。3
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的体系优化后再进行检测。
9.2.2荧光PCR反应体系配置按表1中的顺序，依次加人。表1样本实时荧光RT-PCR检测反应体系名
2XRT-PCRBuffer
WNV-FP(12.5mol/L)
WNV-RP(12.5 mol/L)
WNV-P(5mol/L)
25XRT-PCREnzymg
Nuclease-Free Water
注1：探针引物以西尼罗病毒的NS3基因为扩增模板设计体积/拉
注2：WNV-FP(5'-3\).CAGACCACGeTACGGCG,WNV-RP(5*-3\)CTAGGGCCGCGTGGG，WNV-P.FAM-TCTGCGGAGAGTGCAGTCTGCGAT-BHQI39.2.3上述分装好的PCR反应管中分别加人5L模板RNA，首先加人阴性对照，然后分别加样本RNA，最后加人阳性对照（构建的西尼罗病毒重组质粒的转录RNA）。9.2.4荧光PCR反应：将加好样的PCR反应管分别转移到荧光定量PCR检测仪上进行扩增反应，程序设置为以ABIPrism750o型全自动荧光定量PCR检测仪为例说明，将荧光信号设置为：ReporterDye：FAM，QuencherDye：NONE.PassiveReference.ROX。对于其他型号的荧光定量PCR仪应按实际机型进行反应程序设置，没有ROX荧光通道的荧光定量PCR仪，不进行ROX的设置，荧光PCR扩增程序按照表2中的程序进行设置，反应总体积为25μL。表2样本实时荧光RT-PCR反应程序步
逆转录
扩增及荧光收集
10结果判定及报告
反应温度/℃
采集荧光信号
循环数
阴性对照Ct值应显示0，阳性对照Ct值≤36并有明显的扩增曲线，否则此次检测结果无效，需10.1
重做。
10.2在阴性对照和阳性对照都成立的情况下：检测样品的Ct值≤36，具有明显的扩增曲线，报告西尼罗病毒核酸荧光定量RT-PCR检测阳性。4
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