SN/T 3757-2013
基本信息
标准号： SN/T 3757-2013
中文名称：紫羊茅腥黑粉菌检疫鉴定方法
标准类别：商检行业标准(SN)
标准状态：现行
出版语种：简体中文
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标准分类号
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出版信息
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标准简介
SN/T 3757-2013 紫羊茅腥黑粉菌检疫鉴定方法
SN/T3757-2013
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标准内容
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T3757-—2013
紫羊茅腥黑粉菌检疫鉴定方法
Detection and identification of Tilletia vankyi Carris & Castlebury2013-11-06发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2014-06-01实施
本标准按照GB/T1.12009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国天津出人境检验检疫局。本标准主要起草人：廖芳、郭京泽、蔡国瑞、罗加凤、刘鹏、刘庭、黄国明SN/T3757-2013
1范围
紫羊茅腥黑粉菌检疫鉴定方法
本标准规定了紫羊茅腥黑粉菌的检疫鉴定方法本标准适用于紫羊茅、黑麦草种子上紫羊茅腥黑粉病菌的检疫鉴定。2规范性引用文件
SN/T3757—2013
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T18085—2000植物检疫小麦矮化腹黑穗病菌检疫鉴定方法，3病菌基本信息
中文名：紫羊茅腥黑粉菌
学名：TilletiavankyiCarris&Castlebury分类地位：紫羊茅腥黑粉菌属真菌界（Fungi），担子菌门（Basidiomycota），黑粉菌亚门（Ustilaginomycotina)，黑粉菌纲（Ustilaginomycetes），腥黑粉菌自（Tilletiales），腥黑粉菌科（Tilletiaceae），腥黑粉菌属（Tilletia）。
传播途径：病原菌在紫羊茅和黑麦草作物抽穗杨花期侵染种脐，在种脐的腹面呈一黑点或沿腹沟形成疤斑，为害严重时整个籽粒充满病菌的冬孢子，主要通过种子作远距离传播。紫羊茅腥黑粉菌的其他信息参见附录A。4方法原理
该病菌的寄主及其菌瘦形态、冬孢子形态特征、PCR反应特性等为鉴定依据。5仪器及用具
5.1仪器
体视显微镜，光学显微镜（带显微照相装置及测微尺）、天平（感量0.1名）、生物安全柜或超净台、低速离心机、往复式振荡器、涡旋振荡器、高压灭菌锅、PCR仪、可调微量加样器、刻度离心管（10mL或20 mL)等。
5.2用具
烧杯、三角瓶、镀子、载玻片、盖玻片、量筒、酒精灯、吸管、Parafilm膜或铝箱纸、离心管（1.5mL）、接种针、PCR管等。
SN/T3757-2013
6主要试剂
次氯酸钠溶液或漂白精片（化学纯）、吐温-20（Tween-20）、席尔氏浮载剂（见GB/T18085—2000附录A中席尔氏浮载剂配制方法）封片剂无灵光显微镜物镜镜头油（Nd=1.516）、琼脂以及PCR试剂氯化钾（KCI）、氯化镁（MgCI）、4种脱氧核糖核酸（dNTPs）、rIaqDNA聚合酶、引物、阳性质粒等。7病原菌鉴定
7.1种子的洗涤检验
7.1.1样品制备
样品接收后在样品预备室内将原始样品在样品袋内混合均匀，制成平均样品7.1.2洗涤离心与定容
称取50g试验样品倒入经灭菌三角瓶中，加灭菌水100mL，再加吐温-201～2滴，用铅箱纸或Parafilm膜封住三角瓶口，将三角瓶置于往复式振荡器上振荡5min，立即将洗涤渡注人灭菌的10mL或20mL离心管内，以1000r/min离心5min，倾去上清液，再加入剩余洗涤悬浮液，离心，直至所有洗涤悬浮液离心完毕，弃上清，取沉淀物。在沉淀物中加入席尔氏浮载剂使之悬浮，视沉淀物多少定容至1mL~3mL
7.1.3镜检
用微量加样器吸取沉淀物悬浮液至载玻片上，加盖玻片制片，制片用沉淀物悬浮液的量以加盖玻片不外溢为准，在光学显微镜下镜检，每份实验样品的离心沉淀物至少检查5张玻片，每片按视野依次全部检查。如发现具网状的腥黑穗病菌冬孢子，应对冬孢子形状、色泽以及不孕细胞（视野中可能没有）的形状、色泽进行观察，并随机测量30个成熟冬抱子的直径网脊高度及一直径上的网自数。5张玻片仍不足30个冬孢子时，再次洗涤样品，直至测量30个孢子。测量应在油镜（100×）下进行，对每个成熟冬孢子按长短轴方向测量直径大小，两者的平均值即为该冬孢子的直径。
2菌瘦检查
将剩余样品倒入白瓷盘内，仔细检查有无菌瘦和病粒（参见附录B），重点检查种子腹沟两侧有无变色或异常。轻度感染的种子表皮上有微小的隆起疱斑，用针刺破常可见黑粉涌出，感病较重的籽粒腹沟侧面表皮下形成黑粉腔，有时延至部分或大部分胚乳，表皮破裂后，露出黑粉。挑取黑粉进行显微镜检查鉴定。
7.3PCR检测
7.3.1冬孢子DNA获取
将6.1.2所获得的沉淀物或菌瘦刺破涂于载玻片上，载玻片上放置1mm见方的灭菌盖玻片，其上滴约0.5μL10×PCRbuffer，体视显微镜下挑取3～10个冬孢子至盖玻片小块上，盖上相似大小的另一块盖玻片，用镊子轻轻按压盖玻片，显微镜下确认孢子破裂后将叠合的两片盖玻片一起放人含4.510XPCRbuffer的PCR管底部。
7.3.2冬孢子套式PCR检测
反应混合液和循环参数及实验方法参见附录C,并测序确认。8鉴定特征
8.1冬孢子及不孕孢形态特征
SN/T3757—2013
紫羊茅腥黑粉病菌冬孢子成熟时呈黄色、红褐色至棕褐色，球形或亚球形，直径18μm～29um（平均23um），表面网状；网脊清晰，较高，1.0um～2.7um，最高可达3.0μm，=直径上网目数为5～9个不孕细胞淡色或无色，透明，直径12μm21um，壁厚0.5um~1.8μm，参见附录B8.2菌瘦形态
菌瘦比种子稍膨大，褐色、黑褐色或黑色，外被一层薄的植物组织，菌瘦易破裂，冬孢子堆呈黑褐色，粉状，参见附录B。
PCR检测
冬孢子DNA经套式PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳后成像观察是否出现550bp的目标条带。将目标条带切胶回收并测序确认。
9结果判定
9.1发现菌瘦
发现菌瘦，寄主是紫羊茅或黑麦草，冬孢子形态特征与8.1相符，菌瘦形态与8.2相符，可初步判定为检出紫羊茅腥黑粉病菌，进一步的判定需做冬孢子套式PCR扩增检测。2未发现菌瘦
如果未发现菌瘦，从紫羊茅或黑麦草洗涤液中发现网状冬抱子，冬抱子形态特征与8.1相符，进一步以冬孢子PCR反应结果作判定。9.3冬孢子套式PCR扩增结果判定冬孢子基因组DNA经套式PCR扩增，在琼脂糖凝胶电泳成像观察。阳性DNA应同时出现70Obp和550bp两条目的带，样品管如果同时出现700bp和550bp两条目标带，测定的550bp序列与附录C.2中的序列相似度为99%以上，则视为T.uankyi阳性，携带紫羊茅腥黑粉菌，如果不出现550bp目标带，则视为T.uankyi阴性，不携带紫羊茅腥黑粉菌，如果700bp和550bp两条目标带均未出现，则需重做该实验。
样品保存荐
经鉴定为紫羊茅黑粉菌的样品应按报检号、品种、批号分别存放，置低温干燥处妥善保存6个月，以备接受复核、重复鉴定。保存期满后，需经灭菌处理。3
SN/T3757—2013
茵株保存
将挑抹出来的菌瘦保存于4℃冰箱·保存期满后，需经灭菌处理，将洗涤检验获得的冬孢子制成水久玻片标本。
实验记录保存
要善保存检验报告及实验原始记录。A.1分布
附录A
（资料性附录）
紫羊茅黑粉菌的其他相关信息
已知分布国家有德国、澳大利亚和美国，中国无分布。A.2寄主
SN/T3757-—2013
目前已知寄主有黑麦草属的多年生黑麦草（oliumperenneL）、羊茅属的紫羊茅（FestucarubaL.）A.3寄生同一寄主上的近似种
侵染黑麦草（Loliumspp.）的腥黑粉菌有小麦矮化腥黑穗病菌（Tilletiacontroversa，TCK）T.lolii、T.walkeri及T.uankyi，T.walkeri冬孢子具疣状突起，与其他三种黑粉菌易于区分，TCK、T.lolli、T.uankyi，冬孢子胞壁纹饰均为网状，从形态上难以鉴定区分。侵染紫羊茅的腥黑粉菌有雀麦腥黑粉菌（T.bromz）、TCK、小麦网状腥黑穗病菌(T.caries，TCT）、紫羊芽茅腥黑粉菌（T.uankyi）、T.sterilis及T.texana，共6种，其中T.terana冬孢子大小18μm~35μm，淡黄色至透明色，突起圆锥状，表面不成网状，这与冬孢子表面为网状的T.bromi、TCK、TCT、T.vankyi和T.sterilis明显不同。SN/T3757—2013
B.1菌婆形态见图B.1。
附录B
（资料性附录）
菌瘦、冬孢子和不孕孢形态
注；左为菌瘦，中为健康种子，右为带额片的健康种子。图B.1
2冬孢子及不孕孢形态见图B.2。B2
不孕孢
菌瘦与健康种子比较
a）剖面观
注，标尺为10m。
表面观
冬孢子剖面观和表面观，示网脊和网目（100×）c.1引物
C.1.1第一轮引物
通用外套引物：
附录C
（资料性附录）
冬孢子套式PCR扩增
UF:5-GGATGCATTCTGGGGACGT-3'
UR:5-GTAGCCTTGTTGCTACGATCTG-3\Tilletiawankyi外套引物：
VF.5TGGAAAGAAGTATCAGAGGATC-3VR:5-CCTGTACTATTCTGACCTCTT-3*C.1.2第二轮引物
通用内套引物：
NUF:5-CACCGCCCAAGCACGTAC-3\NUR:5'-GACCTTTTGGGGTCAAACTTCTC-3扩增片段约为700bp。
T.ucinkyi特异内套引物：
LSNF:5'-CTCCGCCCTTTGCC-3
LSNR.5'-GAGAATAACCTTATGTAATGATTTGA-3扩增片段约为550bp。
SN/T3757—2013
通用外套引物UF/UR和通用内套引物NUF/NUR用于冬孢子的套式扩增，实现对实验过程的质量监测。T.Uankyi外套引物VF/VR和特异内套引物LSNF/LSNR用于冬孢子的套式扩增，实现对T.uamkyi冬孢子的特异检测。
特异引物LSNF/LSNR扩增的目标片段序列CTCCGCCCTTTGCCCGATTATATATAATAAAAAAGCAAATTAAGATAAAAAAAGCCAAGGTAACGTGCTAAGACATAACAACTATAGAAAAAAGAGCGAAATTTTATTAGGCAGGTGGTAAAACCTTTTTTAATATAATGAGGTTTTTTATTATATTTATATAATAAAAAAACAAACGGCATCTTACATAATTTTTTTCTACTTTTTTTATTATTATAAAAAAAGCAAATTAAGATAGAAAAAGGGGAAAGAGGCCGATAAGAAGTTAAGACCTAATATAATAAAGAGAAATTCTCTACCGCTACTCTAGTCCATACCGTATAAATCTGTGTAACCATTAGAGGAAAACAGATTTTAAGTATGTTTATGCCCACAGGCATAAAGTGATTCTAAAAAATCATCGGCAATACAAGTGAAAACGGTCAACGTATATTCGTATAAAGACCGTCGGCAGTCTAAACTGTCGCTACAGACTGGGTCACTTGCGGGTACCTGAAATGGTGCTTAATGTACAGTCGGCTTTCTCTAATGGTCAAATCATTACATAAGGTTATTCTC
SN/T3757-—2013
实验方法
C.3.1套式扩增第一轮
C.3.1.1反应体系
冬孢子套式扩增第一轮的反应体系中包含4条引物（UF/UR和VF/VR），扩增模板为排取及破碎的3～10个冬孢子，模板和PCR缓冲液共5μL，添加成分见表C.1，实验设置3个重复，添加无菌水为阴性对照，不设置阳性对照。
C.3.1.2循环参数
热循环参数见表C.1
套式扩增第一轮及第二轮的反应体系及热循环参数表C.1
反应体系
热循环参数
套式扩增第二轮
反应体累
总体积
Buffer
预变性
循环数
终延伸
第一轮下载标准就来标准下载网
56℃30
94C5min
72C7min
第二轮
每条各0.5μL
每条各0.2μL
第一轮产物1μl
94r15s
72℃40s
反应体系见表C.1，包含4条引物（NUF/NUR和LSNF/LSNR），另以NUF/NUR和LSNF/LSNR扩增片段的阳性质粒为阳性对照，每种质粒的浓度约为40ng/uL，阴性对照为第一轮阴性对照管扩增产物。
循环参数
热循环参数见表C.1。
C.4电泳检测
1.5%琼脂糖凝胶电泳，EB染色并成像观察。8
参考文献
SN/T3757—2013
Li] Rustad RC.Identification of the nucleus of a fission yeast with fluorescent dyes.Erp CellRes,1959.15：444-446.
[2] Duran R and Fischer GW.1961.The Genus Tilletia.Washington State University,PullmanPress.
[3]Vanky K.Carpathian Ustilaginales.Symb Bot Upsal.1985,24.129-144.[4] VankyK,1994.European smut fungi.GustavFisher Verlag;Stuttgart.[5] Matsumoto TBell T,1989.Laboratory guide identification of fungi quarantine significanceCalifornia-Smut fungi.
[6]Guillemette MK.Tilletia togwatii,a new bunt species from Poa reflera.Mycologia.1988,80.273-285.
[7] Carris,LM and Gray PM,2ooo.Nuclear condition and conjugation of basidiospores as taxonomie characters in Tilletia.Washington StateUniversity,Pullman.Publicationno.P-2000-0008-PCA.[8]Carris LM.Castlebury LA,Guoming Huang,et al.Tilletia vankyi,a new species of reticu-late-spored bunt fungus with non-conjugating basidiospores infecting species of Festuca and LotiunMycologicalResearch.2007.111(12):1386-1398.E9] Hardison JR.Newgrass host records and lifehistory observations of dwarf bunt in easterrOregon.PlantdiseaseReporter,1954,38:345-347.10]IngoldCT.StructureofthebasidiuminTilletialoliz.MycolRes,1992,96(5):369-370[11JIngold CT.Thebasidium of Tilletia and it's evolution.Mycologist,1997.11 (3):98-100.[12]Boyd ML,Carris LM,and Gray PM.Characterization of Tilletia goloskokovii and alliedspecies.Mycologia,1998.90(2):310-322.[13] Boyd ML,and Carris LM.Evidence supporting the separation of the Vulpia-and BromusinfectingisolatesintheTelletiafusca(T.bromi)complex.Mycologia,1998.90(6).1031-1039.[14]CastleburyLA,CarrisLM.Tilletiawalkeri,a newspecies on Loliummultifioram andL.perenne.Mycologia,1999,91(1):121-131.［15]罗加凤，黄国明，刘鹏，牛春敬.Tilletiavankyi一禾本科草种上的腥黑粉菌新种.植物检疫201024(1)：44-46.
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紫羊茅腥黑粉菌检疫鉴定方法
Detection and identification of Tilletia vankyi Carris & Castlebury2013-11-06发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2014-06-01实施
本标准按照GB/T1.12009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国天津出人境检验检疫局。本标准主要起草人：廖芳、郭京泽、蔡国瑞、罗加凤、刘鹏、刘庭、黄国明SN/T3757-2013
1范围
紫羊茅腥黑粉菌检疫鉴定方法
本标准规定了紫羊茅腥黑粉菌的检疫鉴定方法本标准适用于紫羊茅、黑麦草种子上紫羊茅腥黑粉病菌的检疫鉴定。2规范性引用文件
SN/T3757—2013
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T18085—2000植物检疫小麦矮化腹黑穗病菌检疫鉴定方法，3病菌基本信息
中文名：紫羊茅腥黑粉菌
学名：TilletiavankyiCarris&Castlebury分类地位：紫羊茅腥黑粉菌属真菌界（Fungi），担子菌门（Basidiomycota），黑粉菌亚门（Ustilaginomycotina)，黑粉菌纲（Ustilaginomycetes），腥黑粉菌自（Tilletiales），腥黑粉菌科（Tilletiaceae），腥黑粉菌属（Tilletia）。
传播途径：病原菌在紫羊茅和黑麦草作物抽穗杨花期侵染种脐，在种脐的腹面呈一黑点或沿腹沟形成疤斑，为害严重时整个籽粒充满病菌的冬孢子，主要通过种子作远距离传播。紫羊茅腥黑粉菌的其他信息参见附录A。4方法原理
该病菌的寄主及其菌瘦形态、冬孢子形态特征、PCR反应特性等为鉴定依据。5仪器及用具
5.1仪器
体视显微镜，光学显微镜（带显微照相装置及测微尺）、天平（感量0.1名）、生物安全柜或超净台、低速离心机、往复式振荡器、涡旋振荡器、高压灭菌锅、PCR仪、可调微量加样器、刻度离心管（10mL或20 mL)等。
5.2用具
烧杯、三角瓶、镀子、载玻片、盖玻片、量筒、酒精灯、吸管、Parafilm膜或铝箱纸、离心管（1.5mL）、接种针、PCR管等。
SN/T3757-2013
6主要试剂
次氯酸钠溶液或漂白精片（化学纯）、吐温-20（Tween-20）、席尔氏浮载剂（见GB/T18085—2000附录A中席尔氏浮载剂配制方法）封片剂无灵光显微镜物镜镜头油（Nd=1.516）、琼脂以及PCR试剂氯化钾（KCI）、氯化镁（MgCI）、4种脱氧核糖核酸（dNTPs）、rIaqDNA聚合酶、引物、阳性质粒等。7病原菌鉴定
7.1种子的洗涤检验
7.1.1样品制备
样品接收后在样品预备室内将原始样品在样品袋内混合均匀，制成平均样品7.1.2洗涤离心与定容
称取50g试验样品倒入经灭菌三角瓶中，加灭菌水100mL，再加吐温-201～2滴，用铅箱纸或Parafilm膜封住三角瓶口，将三角瓶置于往复式振荡器上振荡5min，立即将洗涤渡注人灭菌的10mL或20mL离心管内，以1000r/min离心5min，倾去上清液，再加入剩余洗涤悬浮液，离心，直至所有洗涤悬浮液离心完毕，弃上清，取沉淀物。在沉淀物中加入席尔氏浮载剂使之悬浮，视沉淀物多少定容至1mL~3mL
7.1.3镜检
用微量加样器吸取沉淀物悬浮液至载玻片上，加盖玻片制片，制片用沉淀物悬浮液的量以加盖玻片不外溢为准，在光学显微镜下镜检，每份实验样品的离心沉淀物至少检查5张玻片，每片按视野依次全部检查。如发现具网状的腥黑穗病菌冬孢子，应对冬孢子形状、色泽以及不孕细胞（视野中可能没有）的形状、色泽进行观察，并随机测量30个成熟冬抱子的直径网脊高度及一直径上的网自数。5张玻片仍不足30个冬孢子时，再次洗涤样品，直至测量30个孢子。测量应在油镜（100×）下进行，对每个成熟冬孢子按长短轴方向测量直径大小，两者的平均值即为该冬孢子的直径。
2菌瘦检查
将剩余样品倒入白瓷盘内，仔细检查有无菌瘦和病粒（参见附录B），重点检查种子腹沟两侧有无变色或异常。轻度感染的种子表皮上有微小的隆起疱斑，用针刺破常可见黑粉涌出，感病较重的籽粒腹沟侧面表皮下形成黑粉腔，有时延至部分或大部分胚乳，表皮破裂后，露出黑粉。挑取黑粉进行显微镜检查鉴定。
7.3PCR检测
7.3.1冬孢子DNA获取
将6.1.2所获得的沉淀物或菌瘦刺破涂于载玻片上，载玻片上放置1mm见方的灭菌盖玻片，其上滴约0.5μL10×PCRbuffer，体视显微镜下挑取3～10个冬孢子至盖玻片小块上，盖上相似大小的另一块盖玻片，用镊子轻轻按压盖玻片，显微镜下确认孢子破裂后将叠合的两片盖玻片一起放人含4.510XPCRbuffer的PCR管底部。
7.3.2冬孢子套式PCR检测
反应混合液和循环参数及实验方法参见附录C,并测序确认。8鉴定特征
8.1冬孢子及不孕孢形态特征
SN/T3757—2013
紫羊茅腥黑粉病菌冬孢子成熟时呈黄色、红褐色至棕褐色，球形或亚球形，直径18μm～29um（平均23um），表面网状；网脊清晰，较高，1.0um～2.7um，最高可达3.0μm，=直径上网目数为5～9个不孕细胞淡色或无色，透明，直径12μm21um，壁厚0.5um~1.8μm，参见附录B8.2菌瘦形态
菌瘦比种子稍膨大，褐色、黑褐色或黑色，外被一层薄的植物组织，菌瘦易破裂，冬孢子堆呈黑褐色，粉状，参见附录B。
PCR检测
冬孢子DNA经套式PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳后成像观察是否出现550bp的目标条带。将目标条带切胶回收并测序确认。
9结果判定
9.1发现菌瘦
发现菌瘦，寄主是紫羊茅或黑麦草，冬孢子形态特征与8.1相符，菌瘦形态与8.2相符，可初步判定为检出紫羊茅腥黑粉病菌，进一步的判定需做冬孢子套式PCR扩增检测。2未发现菌瘦
如果未发现菌瘦，从紫羊茅或黑麦草洗涤液中发现网状冬抱子，冬抱子形态特征与8.1相符，进一步以冬孢子PCR反应结果作判定。9.3冬孢子套式PCR扩增结果判定冬孢子基因组DNA经套式PCR扩增，在琼脂糖凝胶电泳成像观察。阳性DNA应同时出现70Obp和550bp两条目的带，样品管如果同时出现700bp和550bp两条目标带，测定的550bp序列与附录C.2中的序列相似度为99%以上，则视为T.uankyi阳性，携带紫羊茅腥黑粉菌，如果不出现550bp目标带，则视为T.uankyi阴性，不携带紫羊茅腥黑粉菌，如果700bp和550bp两条目标带均未出现，则需重做该实验。
样品保存荐
经鉴定为紫羊茅黑粉菌的样品应按报检号、品种、批号分别存放，置低温干燥处妥善保存6个月，以备接受复核、重复鉴定。保存期满后，需经灭菌处理。3
SN/T3757—2013
茵株保存
将挑抹出来的菌瘦保存于4℃冰箱·保存期满后，需经灭菌处理，将洗涤检验获得的冬孢子制成水久玻片标本。
实验记录保存
要善保存检验报告及实验原始记录。A.1分布
附录A
（资料性附录）
紫羊茅黑粉菌的其他相关信息
已知分布国家有德国、澳大利亚和美国，中国无分布。A.2寄主
SN/T3757-—2013
目前已知寄主有黑麦草属的多年生黑麦草（oliumperenneL）、羊茅属的紫羊茅（FestucarubaL.）A.3寄生同一寄主上的近似种
侵染黑麦草（Loliumspp.）的腥黑粉菌有小麦矮化腥黑穗病菌（Tilletiacontroversa，TCK）T.lolii、T.walkeri及T.uankyi，T.walkeri冬孢子具疣状突起，与其他三种黑粉菌易于区分，TCK、T.lolli、T.uankyi，冬孢子胞壁纹饰均为网状，从形态上难以鉴定区分。侵染紫羊茅的腥黑粉菌有雀麦腥黑粉菌（T.bromz）、TCK、小麦网状腥黑穗病菌(T.caries，TCT）、紫羊芽茅腥黑粉菌（T.uankyi）、T.sterilis及T.texana，共6种，其中T.terana冬孢子大小18μm~35μm，淡黄色至透明色，突起圆锥状，表面不成网状，这与冬孢子表面为网状的T.bromi、TCK、TCT、T.vankyi和T.sterilis明显不同。SN/T3757—2013
B.1菌婆形态见图B.1。
附录B
（资料性附录）
菌瘦、冬孢子和不孕孢形态
注；左为菌瘦，中为健康种子，右为带额片的健康种子。图B.1
2冬孢子及不孕孢形态见图B.2。B2
不孕孢
菌瘦与健康种子比较
a）剖面观
注，标尺为10m。
表面观
冬孢子剖面观和表面观，示网脊和网目（100×）c.1引物
C.1.1第一轮引物
通用外套引物：
附录C
（资料性附录）
冬孢子套式PCR扩增
UF:5-GGATGCATTCTGGGGACGT-3'
UR:5-GTAGCCTTGTTGCTACGATCTG-3\Tilletiawankyi外套引物：
VF.5TGGAAAGAAGTATCAGAGGATC-3VR:5-CCTGTACTATTCTGACCTCTT-3*C.1.2第二轮引物
通用内套引物：
NUF:5-CACCGCCCAAGCACGTAC-3\NUR:5'-GACCTTTTGGGGTCAAACTTCTC-3扩增片段约为700bp。
T.ucinkyi特异内套引物：
LSNF:5'-CTCCGCCCTTTGCC-3
LSNR.5'-GAGAATAACCTTATGTAATGATTTGA-3扩增片段约为550bp。
SN/T3757—2013
通用外套引物UF/UR和通用内套引物NUF/NUR用于冬孢子的套式扩增，实现对实验过程的质量监测。T.Uankyi外套引物VF/VR和特异内套引物LSNF/LSNR用于冬孢子的套式扩增，实现对T.uamkyi冬孢子的特异检测。
特异引物LSNF/LSNR扩增的目标片段序列CTCCGCCCTTTGCCCGATTATATATAATAAAAAAGCAAATTAAGATAAAAAAAGCCAAGGTAACGTGCTAAGACATAACAACTATAGAAAAAAGAGCGAAATTTTATTAGGCAGGTGGTAAAACCTTTTTTAATATAATGAGGTTTTTTATTATATTTATATAATAAAAAAACAAACGGCATCTTACATAATTTTTTTCTACTTTTTTTATTATTATAAAAAAAGCAAATTAAGATAGAAAAAGGGGAAAGAGGCCGATAAGAAGTTAAGACCTAATATAATAAAGAGAAATTCTCTACCGCTACTCTAGTCCATACCGTATAAATCTGTGTAACCATTAGAGGAAAACAGATTTTAAGTATGTTTATGCCCACAGGCATAAAGTGATTCTAAAAAATCATCGGCAATACAAGTGAAAACGGTCAACGTATATTCGTATAAAGACCGTCGGCAGTCTAAACTGTCGCTACAGACTGGGTCACTTGCGGGTACCTGAAATGGTGCTTAATGTACAGTCGGCTTTCTCTAATGGTCAAATCATTACATAAGGTTATTCTC
SN/T3757-—2013
实验方法
C.3.1套式扩增第一轮
C.3.1.1反应体系
冬孢子套式扩增第一轮的反应体系中包含4条引物（UF/UR和VF/VR），扩增模板为排取及破碎的3～10个冬孢子，模板和PCR缓冲液共5μL，添加成分见表C.1，实验设置3个重复，添加无菌水为阴性对照，不设置阳性对照。
C.3.1.2循环参数
热循环参数见表C.1
套式扩增第一轮及第二轮的反应体系及热循环参数表C.1
反应体系
热循环参数
套式扩增第二轮
反应体累
总体积
Buffer
预变性
循环数
终延伸
第一轮下载标准就来标准下载网
56℃30
94C5min
72C7min
第二轮
每条各0.5μL
每条各0.2μL
第一轮产物1μl
94r15s
72℃40s
反应体系见表C.1，包含4条引物（NUF/NUR和LSNF/LSNR），另以NUF/NUR和LSNF/LSNR扩增片段的阳性质粒为阳性对照，每种质粒的浓度约为40ng/uL，阴性对照为第一轮阴性对照管扩增产物。
循环参数
热循环参数见表C.1。
C.4电泳检测
1.5%琼脂糖凝胶电泳，EB染色并成像观察。8
参考文献
SN/T3757—2013
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