SN/T 3648-2013 饲料中呋喃唑酮、呋喃妥因、呋喃它酮、呋喃西林含量的检测方法 液相色谱法 SN/T3648-2013 标准压缩包解压密码：www.bzxz.net

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T3648-2013
饲料中呋喃唑酮、喃妥因、呋喃它酮、呋喃西林含量的检测方法
液相色谱法
Determination of furazolidone,nitrofurantoin,furaltadone and nitrofurazonein animal feeding stuff-HPLC method2013-08-30发布
中华人民和国
玉家质量监馨验检捷总局
2014-03-01实施
本标准按照CB/T1.1一2009给出的规则起草。本标准山中华人民共和国国家认证认可监督管理委员会提山并归口。本标准起草单位：中华人民共和国广东出入境检验检疫局本标主要起草人：林峰、姚仰勋、吴映璇、欧少伦，林海丹SN/T3648—2013
1范围
饲料中呋喃唑酮、呋喃妥因、呋喃它酮、肤喃西林含量的检测方法
液相色谱法
SN/T 3648—2013
肤响要因，味喃它酮，味啸西林含量的液相色谱检测方法。本方法规定了饲料中吹喃唑酮
本方法适用十配合饲料、浓缩饲料和添加剂预混合饲料中味嘴整酮、、呋喃要因、呋喃它酮、呋喃西林原药含骨的检测。
2规范性引用文件
下列文件对丁本文作的应用是必不可少的。凡是注口期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件，凡是不注期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单适用于本文作。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T 14699.1
饲料采样
3样品制备
按G3/个14699.1规定，取有代表性的样品，四分法缩减至约200g经粉碎，全部过1 mm孔筛，混
勾装人玻璃磨口瓶中备用。样品制备操作过程手应防止样品受到污染或发生待检测物质含凰的变化。4方法提要
样品经乙睛-N,N-二甲基甲酰胺(DMF）混合没提取，提取液用阳离子交换杆柱净化.高效液相色谱-紫外检测器测定,外标法定最。
5试剂
除等别规定外，所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水。5.1 乙晴:IIPLC级。
5.2甲醇:HPLC级
5.3N,N二甲基甲酰胺（LDMF)。
5.4磷酸、
5.5盐酸。
5.6正已烷。
氨水:25%。
5.81mol/L磷酸：67mL磷酸加水至1000mL，混合均匀。5.90.1mol/L盐酸：8.3mL盐酸加水至1000ml..混合均匀，SN/T 3648—2013
5.10氮水-甲醇溶液：氨水1甲醇(5195,体积比）。5.11样品提取剂：乙晴一D.MF(8+2.体积比）。5.12Z.猜-水-1)MF混合液：乙腈+水—DMF(25「715,体积比)。5.13呋响唑酮，呋喃妥因，吹喃它酮、吹喃西林标雅品：味喃唑酮（Furazolidlone,CAS号67-45-8）味啪要凶（Nitrrofuranloin，CAS号67-20-9），味喃它酮盐酸盐（Furaltaclone，CA号139-91-3，计算时需换算为以呋楠它酮计），映喃西林(Nitrofnrazonc,CAS号5987）,纯度人于或等于99为。5.14呋南唑酬、呋喃妥风、味嘀它、味嘀西林标准储备液：200mg/1.。分别称取适量啸唑酮、吹南晏因、味喵它酮、味嘴西林标准品（准碎至C.1mg）于100mL棕色容量瓶巾，如入20mL1DMF（5.3），轻摇使标准品完全溶解，用甲醇-水（1十：,体积比)稀释至刻度，此溶液1mL分别相当于200μg的呋响唑酮、呋喃妥因、呋喃它酮、咪嘀西林，该储备澈置于，℃冰箱中避光保存，使用前需置于暗处平衡牟室温方可使用。
5.15呋喃酮、呋扇婴因、峡喃它酮、吹哨西林混合标雅中间波：50mg/L。分别吸取6.2mL呋喃唑酮、味南晏味楠它酮、峡西林标雅储备（5.4）于21L棕色容量瓶中，甲醇定容至刻度，混句此溶液1mL分别含有5μ的呋喃唑酮、呋喃要因、吹腩它酮，喃西林，该混合标准中问液置于4℃冰箱中避光保存，便用前需于暗处平衡至室湿方可使用5.16味唑酮、呋喃耍因、吹嘀它酮、吹喃西林混合标准工作浚：根据需要吸取一定量的m1g/I哨唑酮、味喃要因、味喃它酮、味西林混台标雅间液（5.15）用乙晴-水-DMF混合滋（5.12）稀释成适当浓度的混合标准丁作液，使用前配制。5.17阳离f交换柱:OasisMCX附离子交换柱.150 mg,3 ml.,或同等效能的阳离子交换柱。使用前依次用5mL.甲醇、！uL水(pH4,磁酸调节）活化备用。5.180.45m滤膜：有机相过谜用。6仪器
6.1高效液相色谱仪,配有紫外检测器。6.2
振荡器。
6.3同相萃取装置，带真空泵。
离心机，转速大下或等于4000r/min6.4
6.5吹氮浓缩装置，
6.6 旋转蒸发器。
漩混勾器，
6.8不锈钢筛筛孔1mm。
7分析步骤
7.1样品提取
7.1.1配合饲料的提取
称取试样5g（精确至.01g）于50mL离心管中，川人25mL样品提取剂（5.11)，振荡30min4000r/min离心5min，上.清液转移至浓缩瓶中，加人_0mL提取液至离心管中，用玻棒捣蔽离心管中的沉淀物，离心管游涡振1min，4000r/min离心5min，上清液合并至浓缩瓶中，置于旋转燕发器上于4a℃下减压蒸馏至近于，残液用45ml.水全部转移至50mL比色管中，用1mal/I.磷酸调节至pH1,水定容至 50 InL刻度，摇匀待净化。7.1.2浓缩饲料及预混合饲料的提取SN/T 3648—2013
称取试样5g（精确至0.0lg）丁5)ml.离心管巾,入2)mL乙腈（5.1)，超声提取10Ini,涡振荡2 min,提取液4000 r/min离心5 min,上清液转移至比色管中，加,人20 ml.乙腈（5.1)至离心管中，用玻棒捣散离心管中的沉淀物，重复提取一次。加入10mLD.MF(5.3)超声提取5min，凝满振荡2min，4000rmin离心5min，上清薇转移合开至比色管巾定容至50nL.准确移取10.00inL提取液于浓缩瓶中，置于旋转蒸发器上于40℃下减压蒸馏至近干，残液用8ml水全部转移至10ml.比色管中,用1mol/L磷酸调节至pH 4,水定容至10 mL刻度,准确吸取5.00 mL溶液于试管中,加入3mL乙睛饱和止已烷，3000r/nin离心3min，弃去上层正己烷层，待净化。7.2样品净化
准确吸取适量样品提取液（配合饲料5.00mL，缩饲料2.50ml.及预混合饲料1.00ml.）至已活化的固相萃取柱(5.17),控制流速在1mL/min～2mL/min,充去流出液；用5mL0.1mol/L盐酸溶液淋洗固相萃取杜：奔去淋洗液;再依次用4 mL甲醇、4 ImL氨水-甲醇浴液(5.10)洗脱，洗脱液于吹氮浓缩装置中于tC下用氮气挥干残渣用乙睛-水-DMF混合液(5.12)溶解，定容至1.0mI.,过0.45μ滤膜（5.18)待上机测定，样品提取和净化过程中需采取适当的避光措施。8测定
8.1 液相色谱条件
色谱柱：Discuverycl柱,25c mm×4.6mm(内径），粒度5um;或同等条件的色谱柱。8.1.2流动相：配合饲料的流动相：乙睛「水·磷酸（200+800+0.5，体积比）；淤缩饲料的流动相：乙1水·磷酸（1501850「0.5.体积比）；添加剂预混合饲料的流动相：乙腈+水+磷酸（100+900+0.5，体积比）。
8.1.3流速：1.0mL/min。
8.1.4检测波长：370nm。
8.1.5柱温：40℃。
8.1.6进样量；20μL。
8.2液相色谱测定
根据样液中4种硝基吹南药物的含量，选定峰面积相近的标雄工作落液。标工作溶和样品落液中1种硝基呋喃药物的响应值均应在仪器检测线性范围内。对标准工作溶液和样液等体积参插进样进行测定。在上述色谱条件下，配合饲料中味喃唑阐、味嘀妥因、峡喃它酮、吹喃四林的色谱保留时问分别为13.0min，11.6min,5.8min,10.1min；浓缩饲料中吹喃唑酮、喃要因、呋喃它酮、呋西林的色谐保阐时间分别为17.0min,13.3nin,5,9irnin,11.1min;添灿剂预混合料中呋嘀唑酮，呋嘴要因、呋嘀它酮、呋喃西林的色谱保留时间分别为29.8min.24.2min，8.7min，19.9min。4种硝基吹喃类药物标准溶液的液相色谱图参则图 A.1～图 A.3。8.3空白试验
除不加试样外，均按上述步骤进行。9计算
用色语数据处理机或按戏(1)计算，计算结果需扣除空白值3
SN/T 3648—2013
我中：
x,=c:X
试样中硝基呋类药物含最，单位为毫克存千克（mg/kg);从标准.1.作曲线得到的硝基呋响类药物溶液浓度，单位为毫克每升（m1g/L)：样品溶液最终定容体积,单位为毫升（ml.)样品溶液所代表最终试样的质量，单位为克（），10方法的测定低限、回收率
10.1测定低限
本方法测定低限为：配合饲料中4种硝基肤响类药物的测定低限为C.5mg/kg：浓缩饲料中1种硝基呋响类药物的测定低限为 1.02.5 rg/kg。
10.2回收率
m/kg·添加剂预混合饲料中4种硝基呋哺类药物的测定低限为4种硝基火喃类药物的添加回收率实验数据（元见表1~表3，
配合饲料中4种硝基肤哺类药物的添加回收率实验数据添加浓度
添加浓度
mng/kg
添加浓度
Eng/kg
呋嘀唑酮
87.G~·101.1
国收幸范国/
快斓安因
含0.8~1050
呋浦它
91.c--113.1
91.0~-100.0
102.2--101.4
表2浓缩饲料中
4种硝基肤类药物的添加回收率实验数据华范图
呋喃唑期
92.0~-97.0
88.3 ~106.9
味喘妥因
02.0~06.C
87.6 ~-103.1
呋哺它酮
76.0--90.0
91.0-~98.0
88.2-~104.3
陕喃西杖
73.8 ---105.0
88.4~-100.0
100.8~-103.0
陕嘴西林
80.0--93.0
96.0~-01.0
88.8-~:04.8
表3添加剂预混合饲料中4种硝基呋哺类药物的添加回收率实验数据同收率范虱/归
峡哨唑醇
84,5 ~-92.5
88.8--102.4
96.8~-104.0
陕埔妥因
92.C~-104.0
92.4--160.1
97,2--104.0
呋啸它酮wwW.bzxz.Net
84.0.~-104.5
90.4-.102.5
98.0~-108.0
映嘀西林
80.0--88.0
87.6--103.2
100.4--111.6
说明：
陕哨它潮：
呋喃西林：
呋哺妥因；
呋潔噬溺，
附录A
(资料性附录）
4种硝基呋哺药物标准溶液的液相色谱图35-
图A.1配合饲料中
种硝基味
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哺药物标准溶液的液相色谱图
hgtuam
说照：
1.00 2. 00 3.00 4. 00 5.00 6.00 7.00 8'00 9.06 10.0011.0012.0013.0n14.005.00 16:00 17.00 1R.0019.00呋喃它酶，
呋浦西林；
峡喵妥因；
咪喃唑酮。
图A.2浓缩饲料中4种硝基喃药物标准溶液的液相色谱图5
SN/T 3648-2013
t/rnin
2.004.006.00R.00 10.0012.00 14.00 16.001R.0 20.00 22.00 24.00 26.00 28.00 30.00 32.00说明：
头哨它葡；
-味嘀西林
味喃要因；
头嘀唑酮。
图A.3添加剂预混合饲料中4种硝基呋喃药物标准溶液的液相色谱图Foreword
This standard is drafted according to GB/T1.1—2009,SN/r3648—2013
The standard was proposed and charged by National Regulatory Commission for Certification and Accreditation.
This standard was drafted by Guangdong EntryExit Inspection of the People's Republic of ChinaThis standard was drafted by Lin feng, Yao yangxun, Wu yingxuan,Ouyang shaolun, Lin haidan .SN/T 3648—2013
Determination of furazolidone,nitrofurantoin,furaltadoneand nitrofurazone in animal feeding stuff--HPLC method1
This standard specifies the methdd ofrminationoffurazolidoi
e.nitrofurantoin,furaltadone,ni-trofurazane in animal feeding stuiff by liquid chromatography methodThis standard is applicablefor the determination of furazolidane,nitrofurantoin.furaltadone,nitro-furazone in formula feed,concentrated feed and premixed formula feed with additives.2Normative reference
The following dacuments is necessary for this standard.For datedreferences,only dated editiansshall applyto this standard.For undated references,theferredto applies.
GB/T6682WaterforanalyticallaboratoryuseGB/T 14699.1 Feeding stuffs sampling3 Sample preparation and starageatest edition of the normative document re-Specification and test methadsThe sample preparation and storage is according to GB/T 14699.1. The sample shall have represenla.tive, Using quartering method.each part of the sample shauld be not less than 2oo g. Crushing thesample, passing through 1 mm sieve and pulting inlo a wide-moulh glass tottle. Certain measuresshall be taken to prevent contamination or decomposition of the residues during the sample prepara-tion.
4Principle
Nilrofurans in the sample are extracted with acetonitrile-N. N-dimethyiformamide (DMF) mixturesolvent. The extraction solution is passed through a McX cartridge for clean-up and deternined byHPLc.UV.quantified by external standard method.5Reagentsandmaterials
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Unless specified,all reagents should be of analytical grade; \water\ is the first grade water pre-scribed by GB/T 6682.
5.1Acetonitrile,HPLC grade.
5,2 Methanol,HPLC grade.
N,N-dimethylformamide(DMIF
Phasphoric acid.
5.5 Hydrochloric acid.
Ammonia : 25%.
5.81mol/LPhosphoric acid solution:draw 67mLphosphoric acia.into waterto100o mL,and mixto homogeneity.
5.9 0.1 mol/L Hydrochloric acid solution::draw8.3mlhydrochloricacid.intowaterto1DoomL. and mix to homogeneity.
methanolc5+95.V/V
Ammonia-methanol：Ammoniat
The extractian solvent: acetonitrile+DMF (8+2, V/V)5.12Acetonitrile-water-DMFmixture solvent:acetonitrile+water+DMF(25+70+5.V/V/V)5.13Furazolidane,nitrofurantoin,furaltadane,nitrofurazone：purity99%5.14 Standard stock solution: 200 mg/L.Accurately weigh the suitable amount of furazolidone,ni-trofurantoin,furaltadane and nitrofurazane (accurate to 0.1 mg) ta 1oo mL brown glass volumetricflask,separately.dissolve by 20 mL DMF and dilute with methanol+ water (1+ 1.V/V) to volume.The solutions will contain 2oo mg furazolidone, nitrofurantoin, furaltadone and nitrofurazone perlitre,separately. The solution should be stored at the temperature 4 'C ,and kept away from lighting.5.15
Standard intermediate solution: 50 mg/L. Pipette 6, 25 mL of either furazolidone,nitrofurantoin,furaltadone and nitrofurazone stock salution (5.14) into a 25 mL brown glass volumet-ric flask,dilute to themark with methanol and mix well.The solution should be stared at the temper-9
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ature4.andkept awayfrom lighting5.16Standard working solution:According to the requirement,accurately measure an adequate vol-ume of 50 mg/L standard intermediate solution (5.15),dilute with Acetonitrile +water +DMFmixture solvent(5.12) to prepare a appropriate standare working solution. Prepare only when necessary.
5.17 Oasis MCX SPE, 150 mg,3 mL,or equivalent. Before use, condition the cartridge with 5 mLmethanol and 5 mL phosphoric acid aqueous solution (pH= 4). 0.45 μm membrane filter for organic5.18
Apparatus and equipment
High Performance Liquid Chromatograph,equipped with UV detector.6.2
Solie phase extraction manifold,6.4
Centrifuge: 4 000 r/min
Concentration workstation.
Rotary vacuum evaporator.
Vortexmixer.
Sieve: pore diameter 1 mm.
Analytical procedure
Extraction
Extraction of formula feed
Accurately weigh 5 g of the test sample ( accurate to 0.01 g) into a 50 mL centrifuge tube. Add 25 rmlof extration solvent (5.11) and oscillate for 30 min. Then centrifuge for 5 min at 4 o00 r/min.Transfer the supernatant into a evaporating bottle.Add 10 mL extration solvent to centrifuge tubeand homogenize for 1 min, Then centrifuge far 5 min at 4 oao r/min. Combine the supernatants to theevaporating bottle and evaporate to near dryness below 40 c. Transfer the residues into a 50 mL col-10
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