SN/T 3542-2013 光合细菌菌剂中沼泽红假单胞菌计数方法 SN/T3542-2013 标准压缩包解压密码：www.bzxz.net

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T3542-2013
光合细菌菌剂中沼泽
红假单胞菌计数方法
Enumeration of Rhodopseudomonas palustrisin phototrophicbacteria product2013-03-01发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2013-09-16实施
本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。SN/T3542—2013
本标准起草单位：中华人民共和国厦门出人境检验检疫局、中华人民共和国广西出人境检验检疫局、集美大学、厦门市农产品质检中心、厦门大学。本标准主要起草人王群力、陈双雅、刘军义、周常义、杨涛，刘棠、彭小莉、黄河清。1范围
光合细菌菌剂中沼泽
红假单胞菌计数方法
本标准规定了光合细菌菌剂中活的沼泽红假单胞菌的测定方法，本标准适用于进出口光合细菌菌剂中沼泽红假单胞菌有效活菌数的测定。2规范性引用文件
SN/T3542—2013
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法SN/T1538.1培养基制备指南第1部分：实验室培养基制备质量保证通则SN/T1538.2培养基制备指南第2部分：培养基性能测试实用指南3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。3.1
沼泽红假单胞菌Rhodopseudomonaspalustris属于细菌域《Bacteria）、变形菌门（Proteobacteria）、α-变形杆菌纲（Alphaproteobacteria）、根瘤菌目（Rhizobiales）、慢生根瘤菌科（Bradyrhizobiaceae）、红假单胞菌属（Rhodopseudomonas），能进行不产氧光合作用，含细菌叶绿素a和类胡萝卜素。3.2
光合细菌菌剂phototrophiebacteriaproduct以沼泽红假单胞菌为菌种，采用有机、无机原料，经发酵培养而制成的活菌制品。分液体和固体制剂两种，以菌液形式存在的称为液体制剂，以某种固体物质作为载体吸附菌液而成或采用某种工艺干燥而成的称为固体制剂。
4设备和材料
4.1光照恒温培养箱：30℃土1℃，带日光型荧光灯或白炽灯，照度不小于20001x。4.2显微镜：100X。
4.3均质器，旋转式均质器或拍击式均质器或等同功能的均质器。4.4高压灭菌器。
4.5玻璃、耐高温塑料、陶瓷或不锈钢过滤器。4.6抽滤瓶。
真空泵。
4.8滤膜：直径47cm.微孔径0.45μm1
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4.9天平：感量0.1g
4.10微需氧培养罐：能维持1%氧浓度的透明培养容器装置。4.11吸管：lmL.分刻度0.1mL，10mL.分刻度1ml.可调移液器：10~100L：100pl~1000mL4.12
4.13螺口试管，容量13ml
4.14灭菌平皿，直径00mm，底部平整的玻璃或一次性塑料灭菌平血。4.15灭菌的样品处理器具：锻子、剪刀、勺子。5培养基和试剂
除另有规定外，所用试剂均为分析纯，试验用水应符合GB/T6682的规定M-AT培养基·见附聚A中A.1。
5.2光合细菌分离琼脂：见A2.
磷酸盐缓冲稀释液：见A，3。
AT培养基：见A.4
5.5革兰氏染色液：见A.5
培养基和试剂的配制遵循SN/T1538.1和SN/T1538.2的要求。固体制剂中有效活菌数的测定
6.1方法提要
光合细菌固体菌剂中有效活菌数的测定是通过选择性增菌（MPN法），分离，生化鉴定等方法对其中活的超泽红假单胞菌进行渊定6.2测定程序
招泽红假单胞菌MPN测定程序见图1样品25g+225mL稀格液
10借样度稀释，送取3管×3个格释度：加入M-AT90！光照质就，
54-10d
光合组菌分离球脂
30±℃，光熊庆氧，2d-3d
挑取可氨菌落
草兰氏染色
碳源利用试验
30土1r光期换氧，3dd
报告结果
图1沼泽红假单胞菌MPN法测定程序示意图iiKacadiaiKAca
6.3样品制备
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6.3.1无菌操作称取25g样品，放人无菌均质杯中，加人225mL灭菌磷酸盐缓冲液，以8000r/min~10000t/min的转速均质1min~2min或放人无菌均质袋中，加人225mL灭菌磷酸盐缓冲液.用拍击式均质器拍打1min~2min，制成1：10的样品勾液。6.3.2用1mL灭菌吸管吸收1：10稀释液1mL，沿管壁缓缓注人加人装有9mL灭菌稀释液的试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），混合均匀，制成1：100样品勾液。6.3.3根据对样品含菌量估计，按上述操作，依次制成10倍递增系列稀释样品勾液。每递增稀释1次，换用1支1mL无菌吸管或吸头。6.4接种培养
6.4.1根据对样品含菌情况的估计，选择3个连续适宜的稀释度，最高稀释度应能达到获得阴性终点。每个稀释度接种3管装有M-AT培养基的螺口试管，每管接种1mL.柠紧试管帽。置30℃士1C光照培养5d。如有沼泽红假单胞菌生长，培养液变棕红色至红色，如不变色，继续培养5d。6.4.2将所有培养基变棕红色至红色的试管上下颠倒摇匀，用3mm接种环沾取一环，接种光合细菌分离琼脂平板，置微需氧培养罐，30℃士1℃光照培养2d~3d，观察菌落形态6.4.3沼泽红假单胞菌在光合细菌分离琼脂上的典型菌落特征为红色，红色或深红色，无粘液。从每个平板上挑取2个典型或可疑菌落，分别接种到光合细菌分离琼脂斜面上，置微需氧培养罐30℃士1℃光照培养2d~3d.取纯培养物按6.5进行鉴定6.5鉴定
6.5.1革兰氏染色
挑取斜面上的纯培养物，进行革兰氏染色，沼泽红假单胞菌为革兰氏阴性杆菌。6.5.2碳源利用试验
革兰氏染色阴性的杆菌培养物分别接种以苯甲酸钠，柠檬酸钠甲酸钠、葡萄糖、酒石酸钠为唯一有机碳源的AT培养基。置微需氧培养罐,30C士℃光照培养3d—5d，如试验碳源培养基变红，则判定利用该碳源阳性；如不变色，则为阴性。沼泽红假单胞菌生化特性见表！。表1沼泽红假单胞菌属细菌生化特性培养基
生化特性
苯甲酸钠
注，十表示阳性，一表示阴性
6.5.3判定
柠檬酸钠
甲酸钠
葡萄糖
酒石酸钠
在光合细菌分离琼脂平板上具有典型菌落，革兰氏染色阴性，且符合表1中生化特性，判定为沼泽红假单胞菌。
6.6结果报告
计算沼泽红假单胞菌阳性管数，应用MPN表（见附录B），查出并计算样品中的沼泽红假单胞菌MPN值，报告为每g样品中沼泽红假单胞菌的最近似值，以MPN/g表示。3
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液体制剂中有效活菌数的测定
方法提要
光合细菌液体制剂中有效活菌数的测定是通过分离琼脂平板培养、生化鉴定等方法对其中活的沼泽红假单胞菌进行平板计数。
7.2测定程序
沼泽红假单胞菌平板计数程序见图2样品25mL+225mL稀释液
10倍梯度稀释
地择3个逆续的活直囊将度的样品均液，接种亮合细喝分离琼脂30℃±1，光照庆氧2d-3d
报告结巢
图2沼泽红假单胞菌平板计数程序示意图7.3样品制备
以无菌吸管吸取25mL样品置盛有225mL灭菌磷酸盐缓冲液的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分混勾，制成110的样品匀液。以下按6.3.2和6.3.3操作。7.4接种培养
7.4.1根据对样品含菌情况的估计-选择3个连续适宣的稀释度，每个稀释度接种2个无菌平皿，每Ⅲ1mL将冷至46℃的光合细菌分离琼脂约15mL倾注于每个平皿中，小心旋转平血，使培养基与样液充分混匀。待琼脂凝固后翻转平皿，置微需氧培养罐，30℃±1光照培养2d~3d.7.4.2典型溜泽红假单胞菌菌落为红色、红褐福色或深红色，无粘液。7.5计数和鉴定
7.5.1选择有典型的沼泽红假单胞菌菌落的平板，且菌落数在25～250个之间的平板，计数平板上出iKacadiaiKAca
现的典型菌落。如果：
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a）如果只有一个稀释度平板的菌落数在25CFU～250CFU之间且有典型菌落，计数该稀释度平板上的典型菌落：
最低稀释度平板的菌落数小于25CFU且有典型菌落.计数该稀释度平板上的典型菌落：b
某一稀释度平板的菌落数大于250CFU且有典型菌落，但下一稀释度平板上没有典型菌落，c
应计数该稀释度平板上的典型菌落：d）某一稀释度平板的菌落数大于250CFU且有典型菌落·且下一稀释度平板上有典型菌落，但其平板上的菌落数不在25CFU250CFU之间应计数该稀释度平板上的典型菌落：以上按式13计算。
e）2个连续稀释度的平板菌落数均在25CFU～250CFU之间·按式（2）计算。7.5.2从每个计数的稀释度平板上挑取5个（小于5个全选）典型菌落，分别接种到光合细菌分离脂斜面上，置微需氧培养罐.30℃土1℃光照培养2d~3d.取纯培养物按6.5进行鉴定。7.6结果计算
7.6.1样品中沼泽红假单胞菌菌落数计算按式（1)：T=AxB
T样品中沼泽红假单胞菌菌落数：A——某一稀释度典型菌落的每皿平均数：B某一稀释度证实为沼泽红假单胞菌的菌落数：C某一稀释度用于沼泽红假单胞菌鉴定的菌落数：d
稀释因子。
样品中沼泽红假单胞菌菌落数计算按式（2）：T-AB/C+AB/C
式中：
样品中沼泽红假单胞菌菌落数；第一稀释度（低稀释倍数）典型菌落的每Ⅲ平均数：第二稀释度（高稀释倍数）典型菌落的每皿平均数：第一稀释度（低稀释倍数）证实为沼泽红假单胞菌的菌落数：第二稀释度（高稀释倍数）证实为沼泽红假单胞菌的菌落数：Ba
第一稀释度（低稀释倍数）用于沼泽红假单胞菌鉴定的菌落数：C
第二稀释度（高稀释倍数）用于沼泽红假单胞菌鉴定的菌落数：Ca
-计算系数；
稀释因子（第一稀释度）。
7.7结果报告
--（2)
根据光合细菌分离琼脂上沼泽红假单胞菌的典型菌落数，按7.6中公式计算，报告每毫升样品中沼泽红假单胞菌有效活菌数，以CFU/mL表示：如T值为0，则以小于1乘以最低稀释倍数报告。5
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M-AT培养基
基础培养基成分
MgCl,-6H.O
CaCl,-2H,0
苯甲酸钠
蒸馏水
A.1.2微量元素添加液
A.1.2.1成分
FeCl-4HO
CoCl,·6H.
NiCh,6H,0
CuCl,5H,0
MnCl4H,O
Na.Mo0,-2H.0
Na,SeO5H,0
A.1.2.2制法
附录A
（规范性附录）
培养基
1000ml
上述盐分别溶解到约900.mL水中，用1mol/1.的盐酸调节pH为2~3，定容到1L。A.1.3维生素添加液
A, 1.3. 1 成分
对-氨基苯甲酸
生物素
蒸馏水
A.1.3.2制法
经0.22um滤膜过滤，保存在无菌容器中，冷藏保存。6
iiKacaOiaikAca
A.1.4抗坏血酸添加液
A.1.4.1成分
抗环血酸
蒸馏水
A.1.4.2制法
经0.22um滤膜过滤.保存在无菌容器中，冷曦避光保存。A.1.5M-AT培养基制法
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临用前，1000mL.A.1.1基础液中添加1mLA.1.2微量元素添加液、1mLA.1.3维生素添加液和10mLA.1.4抗坏血酸添加液，调节pH6.9士0.1.培养基经0.45μm滤网过滤，分装到13mL灭菌螺日试管中，每管装液12mL
A.2光合细菌分离琼脂
基础培养基
A.2.1.1成分
CHCO0Na3HO
醇母膏
K,HPO,-3H,O
MgCl.6H.0
Fe-EDTA溶液
琼脂粉
蒸馏水
A.2.1.2制法
1000mL
除琼脂外将其余成分溶解于蒸馏水中，PH6.9，加人琼脂，加热溶解，定量分装适宜容器，121℃高压灭菌15min。
A.2.2Fe-EDTA溶液
FeSO,-7H,0
Nar-EDTA免费标准bzxz.net
蒸馏水
A.2.3光合细菌分离琼脂制法
临用前，将A.2.1基础培养基融化，保温于46℃水浴1000mLA.2.1基础培养基中加人5mLA.1.4抗坏血酸添加液。摇勾后备用。SN/T3542—2013
A.3磷酸盐缓冲稀释液
A.3.1贮存液
A.3.1.1成分
酸磷二氢鲫
蒸馏水
A3.1.2制法
用大约175mL的1mol/L氢氧化钠溶液调节pH至7.2用蒸馏水稀释至1000mL后贮存于冰箱中。
稀释液
用蒸馆水稀释1.25mL存液至1000mL，分装于适宜容器，121℃高压灭菌15minA.4AT培养基
A.4.1基础培养基成分
MgCla·6H20
CaCh·2H.O
蒸馏水
2制法
1000mL
临用前1000mLA.4.1基础液中添加1mLA.1.2微量元素添加液、1mLA.1.3维生素添加液和10mLA.14抗坏血胶添加液，调节pH6.9士0.1，培养基经0.45μm滤膜过滤，分装到13mL灭菌螺口试管中，每管装液12mL。
A.5革兰氏染色法
结晶紫染色液
A.5.1.1成分
结晶紫
95%乙醇
1%草酸铵水溶液
iiKacaOiaikAca
A:5.1.2制法
将结晶紫溶解于乙醇中.然后与草酸铵溶液混合。A.5.2
革兰氏碘液
A.5.2.1成分
碘化钾
蒸镭水
A.5.2.2制法
SN/T3542—-2013
将碘与碘化钾先进行混合，加入蒸留水少许.充分振据，完全溶解后.再加蒸增水300mL。A.5.3
复染液
A.5.3.1成分
95%乙醇
蒸馏水
A.5.3.2制法
将沙黄溶解于乙醇中，然后用蒸燕馏水稀释A.5.4染色法
A.5.4.1将涂片在火焰上固定.滴加结晶紫染色液，染1min，水洗A.5.4.2滴加革兰氏碘液，作用1min，水洗。A.5.4.3
色10s。
滴加95%乙醇脱色，约305或将乙醇滴满整个涂片，立即倾去，再用乙醇滴满整个涂片脱水洗，滴加复染液，复染1min，水洗，待干，镜检。结果：革兰氏阳性菌星紫色，革兰氏阴性菌星红色A.5.4.5
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附录B
C规范性附录
1样品中最大可能数（MPN）检索表采用三管法，接种量分别为0.10g.0.01g.0.001g，每克样品的最可能数和95%可信度见表B.1。表B.1
检索表
阳性管数
95%置信限
最低蕴最高值
期性管数
95%置信限
最低值最高值
注：表内所列接种量如改用1g、0.1g.0.01g时，表内数字应相应降低10倍：如改用0.01:g、0.001g，0.0001g时，则表内数字应相应增加10倍，其余类推10
-iiKacaQiaiKAca
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