SN/T 3730.1-2013
基本信息
标准号： SN/T 3730.1-2013
中文名称：食品及饲料中常见畜类品种的鉴定方法 第1部分：貂成分检测 实时荧光PCR法
标准类别：商检行业标准(SN)
标准状态：现行
出版语种：简体中文
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相关标签： 食品 饲料 常见 畜类 品种 鉴定 方法 成分 检测 实时 荧光 PCR
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标准简介
SN/T 3730.1-2013 食品及饲料中常见畜类品种的鉴定方法 第1部分：貂成分检测 实时荧光PCR法
SN/T3730.1-2013
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标准内容
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T3730.1--2013
食品及饲料中常见畜类品种的鉴定方法第1部分：貂成分检测
实时荧光PCR法
Identification of domestic animal ingredient in food and feed-Part 1:Detection of martes ingredient-Real-time PCR method2013-11-06发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2014-06-01实施
SN/T3730《食品及饲料中常见畜类品种的鉴定方法》共分为以下8个部分：第1部分：貂成分检测
第2部分：狗成分检测
实时荧光PCR法；
实时荧光PCR法；
第3部分：狐狸成分检测
实时荧光PCR法；
一第4部分：驴成分检测
第5部分：马成分检测
第6部分：猫成分检测
实时荧光PCR法；
实时荧光PCR法；
实时荧光PCR法；
-第7部分：水牛成分检测实时荧光PCR法；第8部分：猪成分检测
实时荧光PCR法
本部分为SN/T3730的第1部分。
本部分按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。SN/T3730.1—2013
本部分起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国辽宁出人境检验检疫局、宝生物工程(大连)有限公司。
本部分主要起草人：郑秋月、李晶泉、于灵、张浩、赵听、封雪、徐君怡、吴亚君。1范围
食品及饲料中常见畜类品种的鉴定方法SN/T3730.1—2013
第1部分：貂成分检测
实时荧光PCR法
SN/T3730的本部分规定了食品及饲料中貂成分鉴定的实时荧光PCR法。本部分适用于食品及饲料中貂成分，包括水貂（Mustlavison）、紫貂（Martesxibellina）、月本貂(Martesmelampus）、黄喉貂（Martesflauigula）等的定性检测。2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T27403实验室质量控制规范食品分子生物学检测3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件
貂Martes
食肉目融科动物，属珍贵毛皮动物。本部分中貂成分即指水貂、紫貂、日本貂、黄喉貂等特异性DNA片段。
实时荧光PCRrealtimePCR
在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的积累实时监控整个PCR扩增过程。3.3
Ct值cyclethreshold
每个反应管内的荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数。4缩略语
下列缩略语适用于本文件。
DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonuleicacid）dNTP：脱氧核苷酸三磷酸（deoxyribonucleosidetriphosphate）CTAB：十六烷基三甲基漠化铵（cetyltrithylammoniumbromide）Tris：三（羟甲基）氨基甲烷[tris(hydroxymethyl）aminomethaneEDTA：乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraaceticacid）EaTagHS：高效热启动DNA聚合酶OD：光密度值（opticaldensity）SN/T3730.1—2013
5方法提要
提取样品DNA，以DNA为模板，分别采用貂成分的特异性检测引物和探针进行实时荧光PCR扩增，观察实时荧光PCR的增幅现象，进行食品和饲料中貂成分的鉴定。6试剂和材料
除另有规定外，试剂为分析纯或生化试剂。实验用水应符合GB/T6682中一级水的规格。所有试剂均用无DNA酶污染的容器分装。6.1检测用引物（对）序列和探针：貂成分扩增引物和探针、内参照（真核生物成分）引物和探针详见表1。
表1试验用引物和探针
内参照5°端引物
内参照3°端引物
内参照探针
貂5端引物
貂3端引物
貂探针
水貂5°端引物
水貂3端引物
水貂探针
序列（5*-3）
TCTGCCCTATCAACTTTCGATGGTA
AATTTGCGCGCCTGCTGCCTTCCTT
FAM-CCGTTTCTCAGGCTCCCTCTCCGGAATCGAACC-EclipseTAGCRAAGAGACCTTAAG
CTRYAAGTCTTYTCACTA
FAM-AACCAGACGAGCTACCTATGAG-EclipseGCTTCAATCCTCTATTTCATAA
GCTTCTTCCTTGAGTCTTA
FAM-CCTCCTAGTCTTCATGCCAATCGT-EclipSE目的基因
真核生物18SrRNA基国
紫貂、日本貂、黄喉貂
16srRNA基因
水貂线粒体细胞
色素b基因
6.2CTAB缓冲液：55mmol/LCTAB.1400mmol/LNaCl20mmol/1EDTA100mmol/LTris.用10%盐酸调pH至8.0，121℃，高压灭菌20min，备用。6.3TE缓冲液(Tris-CI、EDTA缓冲液)：10mmol/LTris-HCl(pH8.0),1mmol/LEDTA(pH8.0)。6.4
蛋白酶K：20mg/μl。
Tris饱和酚。
三氮中烷。
异戊醇。
异丙醇。
6.970%乙醇。
ErTaqHS聚合酶。
6.11PremixErTaqTM（2X)ErTagHS聚合酶（终浓度0.1U/μL)、dNTP(终浓度0.6mmol/L)Mg2+（终浓度6mmol/L）。
7仪器和设备
7.1实时荧光PCR仪。
-niKacaaaiKAca-
7.2离心机：离心转速≥12000r/min。7.3微量移液器：10μL、100μL、200μ、1000L。7.4
冰箱：2℃～8℃，-20℃。
7.5高压灭菌器。
核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。7.6
7.7pH计。
7.8天平：感量10mg。
恒温水浴锅。
涡旋振荡仪。
8检测步骤
DNA提取
SN/T 3730.1—2013
8.1.1称取300mg已制备好的样品于2mL离心管中，加人1.5mLCTAB缓冲液和10μL蛋白酶K，振荡混匀，65℃30min，期间每隔10min振荡混匀。8.1.22000r/min离心5min，吸取上清液至一新离心管中，加400μL三氯甲烷-异戊醇（24：1），充分混匀。
8.1.312000r/min离心5min，吸取上清液至一新离心管中，加入0.8倍体积异丙醇，室温下沉淀1h~2h。
8.1.412000r/min离心10min，弃上清液；70%乙醇洗涤一次，晾干：加人50uLTE缓冲液，溶解DNA沉淀，于一20℃保存备用。
8.2DNA浓度和纯度的测定
取适成DNA溶液原液加双蒸水稀释一定倍数后，使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计测260nm和280nm处的吸收值。DNA的浓度按照式（1)计算。C=AXNX50
式中：
-DNA浓度，单位为微克每毫升（μg/mL）；A250——260nm处的吸光值；
N核酸稀释倍数。
当浓度为10uL/mL~100μL/mL，A260/A20比值在1.7~1.9之间时，适宜于实时荧光PCR扩增。8.3实时荧光PCR检测
8.3.1实时荧光PCR反应体系
实时荧光PCR反应体系见表2，每个样品各做两个平行管。可先将反应试剂及引物预混成混合液形式。
SN/T3730.1—2013
试剂名称
PremixErTaqTM(2x)
上下游引物（10μmol/L）
探针（5μmol/L）
DNA模板（10μg/mL~100μg/mL）补水至
表2实时荧光PCR反应体系
终浓度
400nmol/L
200nmol/L
真核生物内参照的反应体系同上，仅以真核生物引物对和探针替换貂引物对和探针。8.3.2实时荧光PCR反应参数
95℃/10s，1个循环；95℃/5s：52℃/10s；72℃/34$40个循环。8.3.3实验对照
反应/l
检验过程中分别设阳性对照、阴性对照、空白对照。以貂提取的DNA为阳性对照，以已知不含有貂成分的样品提取的DNA为阴性对照，以灭菌水为空白对照。样品、内参照和对照设暨两个平行的反应体系。
质量控制
以下条件有一条不满足时，实验视为无效：空白对照：无荧光对数增长、相应的Ct值>40.0。a)
阴性对照：无荧光对数增长，相应的Ct值>40.0阳性对照：有荧光对数增长，且荧光通道出现典型的扩增曲线，相应的Ct值<30.0。内参照：有荧光对数增长，月荧光通道出现典型的扩增曲线，相应的Ct值<30.0。结果判定及表述
结果判定
在符合第9章的情况下，被检样品进行检测时：如Ct值≤35.0，则判定为被检样品阳性，扩增靶标序列参见附录A。a)
如Ct值≥40.0，则判定为被检样品阴性。b)
如35.0如再次扩增后Ct值≥40.0，则判定被检样品阴性。10.2结果表述
10.2.1结果为阳性者，表述为“检出貂成分”。10.2.2结果为阴性者，表述为“未检出貂成分”。4
iniKacaoaaiKAca=
防污染措施
检测过程中防止交叉污染的措施按照GB/T27403中的规定执行。12
检出限
本部分所规定方法的最低检出限（LOD)为0.01%（质量分数）。SN/T 3730.1--2013
SN/T3730.1-2013
附录A
（资料性附录）
貂成分的基因扩增靶标参考序列A.1水貂成分基因扩增靶标参考序列GCTTCAATCCTCTATTTCATAATCCTCCTAGTCTTCATGCCAATCGTCAGYATTATTGAAAATAATCTATTAAAATGAAGAGTCTTTGTAGTATATCAATTACYTTGGTCTTGTAAACCAAAAATGGAGAACCCTATCTCCCTAAGACTCAAGGAAGAAGC紫貂、日本貂、黄喉貂成分基因扩增靶标参考序列A.2
TAGCRAAGAGACCTTAAGCTAACTCCCCCGAAACCAGACGAGCTACCTATGAGCAATCCACAGGGATAAACTCATCTATGTCGCAAAATAGTGARAAGACTTRYAG6
rrKacaQiaiKAca-
SN/T3730.1-2013
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准
食品及饲料中常见畜类品种的鉴定方法第1部分：貂成分检测实时荧光PCR法S.N/T3730.1--2013
中国标准出版社出版Www.bzxZ.net
北京市朝阳区和平里西街甲2号（100013）北京市西城区三里河北街16号（100015）总编室：(010)64275323
网址spc.net.cn
中间标准出版社秦皇岛印刷厂印剧开本880×12301/16印张0.75
字数14下学
2014年4月第一版2014年4月第一次印刷印数1-1600
书号：155066·2-26829
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食品及饲料中常见畜类品种的鉴定方法第1部分：貂成分检测
实时荧光PCR法
Identification of domestic animal ingredient in food and feed-Part 1:Detection of martes ingredient-Real-time PCR method2013-11-06发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2014-06-01实施
SN/T3730《食品及饲料中常见畜类品种的鉴定方法》共分为以下8个部分：第1部分：貂成分检测
第2部分：狗成分检测
实时荧光PCR法；
实时荧光PCR法；
第3部分：狐狸成分检测
实时荧光PCR法；
一第4部分：驴成分检测
第5部分：马成分检测
第6部分：猫成分检测
实时荧光PCR法；
实时荧光PCR法；
实时荧光PCR法；
-第7部分：水牛成分检测实时荧光PCR法；第8部分：猪成分检测
实时荧光PCR法
本部分为SN/T3730的第1部分。
本部分按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。SN/T3730.1—2013
本部分起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国辽宁出人境检验检疫局、宝生物工程(大连)有限公司。
本部分主要起草人：郑秋月、李晶泉、于灵、张浩、赵听、封雪、徐君怡、吴亚君。1范围
食品及饲料中常见畜类品种的鉴定方法SN/T3730.1—2013
第1部分：貂成分检测
实时荧光PCR法
SN/T3730的本部分规定了食品及饲料中貂成分鉴定的实时荧光PCR法。本部分适用于食品及饲料中貂成分，包括水貂（Mustlavison）、紫貂（Martesxibellina）、月本貂(Martesmelampus）、黄喉貂（Martesflauigula）等的定性检测。2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T27403实验室质量控制规范食品分子生物学检测3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件
貂Martes
食肉目融科动物，属珍贵毛皮动物。本部分中貂成分即指水貂、紫貂、日本貂、黄喉貂等特异性DNA片段。
实时荧光PCRrealtimePCR
在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的积累实时监控整个PCR扩增过程。3.3
Ct值cyclethreshold
每个反应管内的荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数。4缩略语
下列缩略语适用于本文件。
DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonuleicacid）dNTP：脱氧核苷酸三磷酸（deoxyribonucleosidetriphosphate）CTAB：十六烷基三甲基漠化铵（cetyltrithylammoniumbromide）Tris：三（羟甲基）氨基甲烷[tris(hydroxymethyl）aminomethaneEDTA：乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraaceticacid）EaTagHS：高效热启动DNA聚合酶OD：光密度值（opticaldensity）SN/T3730.1—2013
5方法提要
提取样品DNA，以DNA为模板，分别采用貂成分的特异性检测引物和探针进行实时荧光PCR扩增，观察实时荧光PCR的增幅现象，进行食品和饲料中貂成分的鉴定。6试剂和材料
除另有规定外，试剂为分析纯或生化试剂。实验用水应符合GB/T6682中一级水的规格。所有试剂均用无DNA酶污染的容器分装。6.1检测用引物（对）序列和探针：貂成分扩增引物和探针、内参照（真核生物成分）引物和探针详见表1。
表1试验用引物和探针
内参照5°端引物
内参照3°端引物
内参照探针
貂5端引物
貂3端引物
貂探针
水貂5°端引物
水貂3端引物
水貂探针
序列（5*-3）
TCTGCCCTATCAACTTTCGATGGTA
AATTTGCGCGCCTGCTGCCTTCCTT
FAM-CCGTTTCTCAGGCTCCCTCTCCGGAATCGAACC-EclipseTAGCRAAGAGACCTTAAG
CTRYAAGTCTTYTCACTA
FAM-AACCAGACGAGCTACCTATGAG-EclipseGCTTCAATCCTCTATTTCATAA
GCTTCTTCCTTGAGTCTTA
FAM-CCTCCTAGTCTTCATGCCAATCGT-EclipSE目的基因
真核生物18SrRNA基国
紫貂、日本貂、黄喉貂
16srRNA基因
水貂线粒体细胞
色素b基因
6.2CTAB缓冲液：55mmol/LCTAB.1400mmol/LNaCl20mmol/1EDTA100mmol/LTris.用10%盐酸调pH至8.0，121℃，高压灭菌20min，备用。6.3TE缓冲液(Tris-CI、EDTA缓冲液)：10mmol/LTris-HCl(pH8.0),1mmol/LEDTA(pH8.0)。6.4
蛋白酶K：20mg/μl。
Tris饱和酚。
三氮中烷。
异戊醇。
异丙醇。
6.970%乙醇。
ErTaqHS聚合酶。
6.11PremixErTaqTM（2X)ErTagHS聚合酶（终浓度0.1U/μL)、dNTP(终浓度0.6mmol/L)Mg2+（终浓度6mmol/L）。
7仪器和设备
7.1实时荧光PCR仪。
-niKacaaaiKAca-
7.2离心机：离心转速≥12000r/min。7.3微量移液器：10μL、100μL、200μ、1000L。7.4
冰箱：2℃～8℃，-20℃。
7.5高压灭菌器。
核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。7.6
7.7pH计。
7.8天平：感量10mg。
恒温水浴锅。
涡旋振荡仪。
8检测步骤
DNA提取
SN/T 3730.1—2013
8.1.1称取300mg已制备好的样品于2mL离心管中，加人1.5mLCTAB缓冲液和10μL蛋白酶K，振荡混匀，65℃30min，期间每隔10min振荡混匀。8.1.22000r/min离心5min，吸取上清液至一新离心管中，加400μL三氯甲烷-异戊醇（24：1），充分混匀。
8.1.312000r/min离心5min，吸取上清液至一新离心管中，加入0.8倍体积异丙醇，室温下沉淀1h~2h。
8.1.412000r/min离心10min，弃上清液；70%乙醇洗涤一次，晾干：加人50uLTE缓冲液，溶解DNA沉淀，于一20℃保存备用。
8.2DNA浓度和纯度的测定
取适成DNA溶液原液加双蒸水稀释一定倍数后，使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计测260nm和280nm处的吸收值。DNA的浓度按照式（1)计算。C=AXNX50
式中：
-DNA浓度，单位为微克每毫升（μg/mL）；A250——260nm处的吸光值；
N核酸稀释倍数。
当浓度为10uL/mL~100μL/mL，A260/A20比值在1.7~1.9之间时，适宜于实时荧光PCR扩增。8.3实时荧光PCR检测
8.3.1实时荧光PCR反应体系
实时荧光PCR反应体系见表2，每个样品各做两个平行管。可先将反应试剂及引物预混成混合液形式。
SN/T3730.1—2013
试剂名称
PremixErTaqTM(2x)
上下游引物（10μmol/L）
探针（5μmol/L）
DNA模板（10μg/mL~100μg/mL）补水至
表2实时荧光PCR反应体系
终浓度
400nmol/L
200nmol/L
真核生物内参照的反应体系同上，仅以真核生物引物对和探针替换貂引物对和探针。8.3.2实时荧光PCR反应参数
95℃/10s，1个循环；95℃/5s：52℃/10s；72℃/34$40个循环。8.3.3实验对照
反应/l
检验过程中分别设阳性对照、阴性对照、空白对照。以貂提取的DNA为阳性对照，以已知不含有貂成分的样品提取的DNA为阴性对照，以灭菌水为空白对照。样品、内参照和对照设暨两个平行的反应体系。
质量控制
以下条件有一条不满足时，实验视为无效：空白对照：无荧光对数增长、相应的Ct值>40.0。a)
阴性对照：无荧光对数增长，相应的Ct值>40.0阳性对照：有荧光对数增长，且荧光通道出现典型的扩增曲线，相应的Ct值<30.0。内参照：有荧光对数增长，月荧光通道出现典型的扩增曲线，相应的Ct值<30.0。结果判定及表述
结果判定
在符合第9章的情况下，被检样品进行检测时：如Ct值≤35.0，则判定为被检样品阳性，扩增靶标序列参见附录A。a)
如Ct值≥40.0，则判定为被检样品阴性。b)
如35.0
10.2.1结果为阳性者，表述为“检出貂成分”。10.2.2结果为阴性者，表述为“未检出貂成分”。4
iniKacaoaaiKAca=
防污染措施
检测过程中防止交叉污染的措施按照GB/T27403中的规定执行。12
检出限
本部分所规定方法的最低检出限（LOD)为0.01%（质量分数）。SN/T 3730.1--2013
SN/T3730.1-2013
附录A
（资料性附录）
貂成分的基因扩增靶标参考序列A.1水貂成分基因扩增靶标参考序列GCTTCAATCCTCTATTTCATAATCCTCCTAGTCTTCATGCCAATCGTCAGYATTATTGAAAATAATCTATTAAAATGAAGAGTCTTTGTAGTATATCAATTACYTTGGTCTTGTAAACCAAAAATGGAGAACCCTATCTCCCTAAGACTCAAGGAAGAAGC紫貂、日本貂、黄喉貂成分基因扩增靶标参考序列A.2
TAGCRAAGAGACCTTAAGCTAACTCCCCCGAAACCAGACGAGCTACCTATGAGCAATCCACAGGGATAAACTCATCTATGTCGCAAAATAGTGARAAGACTTRYAG6
rrKacaQiaiKAca-
SN/T3730.1-2013
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准
食品及饲料中常见畜类品种的鉴定方法第1部分：貂成分检测实时荧光PCR法S.N/T3730.1--2013
中国标准出版社出版Www.bzxZ.net
北京市朝阳区和平里西街甲2号（100013）北京市西城区三里河北街16号（100015）总编室：(010)64275323
网址spc.net.cn
中间标准出版社秦皇岛印刷厂印剧开本880×12301/16印张0.75
字数14下学
2014年4月第一版2014年4月第一次印刷印数1-1600
书号：155066·2-26829
小提示：此标准内容仅展示完整标准里的部分截取内容，若需要完整标准请到上方自行免费下载完整标准文档。