SN/T 1059.6-2016 出口食品中沙门氏菌属检测方法 第6部分：垂直膜过滤法 SN/T1059.6-2016 标准压缩包解压密码：www.bzxz.net

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T1059.6—2016
代替SN/T1059.6—2008
出口食品中沙门氏菌属检测方法第6部分：垂直膜过滤法
Detection of Salmonellae in food for export-Part 6:Vertical membranefilting method2016-03-09发布
影派装育
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2016-10-01实施
SN/T1059共分为7个部分：
SN/T1059.1
SN/T1059.2
SN/T1059.3
SN/T1059.4
SN/T1059.5
进出口食品中沙门氏菌滤膜筛选法；进出口食品中大肠菌群、大肠杆菌计数滤膜/MUG法；
进出口食品平板菌落计数滤膜法；进出口食品中大肠杆菌检验方法谷氨酸脱羧酶法；SN/T1059.6-—2016
食品和动物饲料大肠杆菌0157的检测方法免疫磁珠法；SN/T1059.6出口食品中沙门氏菌属检测方法第6部分：垂直膜过滤法；SN/T1059.7
进出口食品中沙门氏菌检测方法实时荧光PCR法。本部分为SN/T1059的第6部分。
本部分按照GB/T1.12009给出的规则起草。本部分代替SN/T1059.6一2008《进出口食品中沙门氏菌属检验方法法垂直膜过滤法》。
本部分与SN/T1059.6一2008相比，主要技术变化如下：修改了标准的中英文名称；
修改了标准的范围（见第1章，2008年版第1章）；修改了规范性引用文件（见第2章，2008年版第2章）；修改了样品制备和增菌培养（见7.1）；修改了培养基（见附录A，2008年版附录A）。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位：中华人民共和国辽宁出人境检验检疫局。本部分主要起草人：吴斌、刘淑艳、蔡晓萍、于畅、张雪。本部分所代替标准的历次版本发布情况为：-SN/T1059.6—2008。
1范围
出口食品中沙门氏菌属检测方法第6部分：垂直膜过滤法
SN/T1059的本部分规定了出口食品中沙门氏菌属垂直膜过滤检验方法。本部分适用于出口食品中沙门氏菌属的检验2规范性引用文件
SN/T1059.6—2016
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仪注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB4789.4食品安全国家标准
3原理
食品微生物学检验
沙门氏菌检验
本方法是基于垂直过滤的方式使测试样品道过包被有特别沙门氏菌抗体的膜，样品中的沙门氏菌抗原与膜上抗体结合，通过酶偶合物将抗原抗体结合物显色，若是阳性样品，试剂中央出现蓝色的圆点，反之为无色的圆点。
4设备与材料
滤器：备有预滤器。
真空泵。
滤膜：有机相或水相，孔径0.45m培养箱：36℃±1℃，42℃1℃。水浴箱：45℃±1℃，36℃1
吸管：1mL、10mL，具刻度。
锥形瓶：容量250mL500ml。
试管：17mmX170mm
玻璃珠：5mm。
平皿：直径90mm。
天平：感量0.1g。
均质器。
5培养基和试剂
缓冲蛋白陈增菌液（BPW)：见附录A中A,1。5.1
5.2RVS肉汤：见A.2。
5.3MKTTn肉汤：见A.3。
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木糖赖氨酸脱氧胆盐(XLD)琼脂：见A.4。5.4
5.5亚硫酸铋(BS)琼脂：见A.5。5.6HE琼脂：见A.6。
5.7四乙酸二氨基乙烷（EDTA）：0.2mol/L。沙门氏菌检测膜。
检测膜配套溶液：见A.7。
6检验程序
检验程序见图1。
25g(mL）样品+225mLBPW，均质
36℃±1℃
18h±2h
0.1mL+RVS10mL,41.5C±1℃.24h±3h(或0.1ml.+MKTTn10mL36℃±1C,24h±3h）BC
36℃±1℃,40 h~48 h
XLD(或HE)
36℃±1℃,18 h24 hb
挑取5个典型菌落+250μLPBS，混匀，垂直膜过滤鉴定报告
图1沙门氏菌属垂直过滤法检验程序7操作步骤
样品制备和增菌培养
7.1.1如为冷冻样品，应在45℃以下不超过15min，或在2℃～5℃不超过18h解冻。若不能及时检验，应置于一15℃左右保存。非冷冻而易腐的食品，置于4℃冰箱保存。7.1.2称取25g（mL）样品放入盛有225mLBPW的灭菌均质杯中，以8000r/min~10000r/min均质1min~2min，或置于盛有225mLBPW的灭菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1min~2min。若样品为液态，不需要均质，振荡混勾。无菌操作将样品转至500mL无菌锥形瓶中，如使用均质袋，可直接进行培养，于36℃水浴培养18h士2h，进行前增菌。7.1.3轻轻摇动培养过的样品混合物，移取0.1mL，转种于盛有10mLRVS肉汤的无菌试管中，混合均匀，于41.5℃士1℃培养24h士3h；或移取1mL，转种于10mLMKTTn肉汤的无菌试管中，混合均勾，于36℃士1℃培养24h士3h，进行选择性增菌。2
7.2分离
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用接种环取选择性增菌液1环，划线接种于一个BS琼脂平板和一个XLD琼脂平板（或HE琼脂平板），于36℃土1℃分别培养18h～24h（XLD琼脂平板，HE琼脂平板）或培养40h48h（BS琼脂平板），观察各个平板上生长的菌落。沙门氏菌典型菌落特征为：BS琼脂上，菌落为黑色有金属光泽、棕褐色或灰色，菌落周围培养基可呈黑色或棕色；有些菌株形成灰绿色的菌落，周围培养基不变。HE琼脂上，菌落为蓝绿色或蓝色，多数菌落中心黑色；有些菌株为黄色，中心黑色或儿乎全黑色。XID琼脂上，菌落呈粉红色，带或不带黑色中心，有些菌株可呈现大的带光泽的黑色中心，或呈现全部黑色的菌落，有些菌株为黄色菌落，带或不带黑色中心。7.3鉴定
吸取250μLPBS缓冲液至玻璃试管中。7.3.1
7.3.2从选择性平板上挑取5个典型菌落，移至试管中，混合均匀制成样品液，室温培养（25℃）10min。
7.3.3加入800μL0.5%吐温20磷酸盐缓冲液于样品液中，并均匀混合7.3.4加人200叫L样品液至膜上。7.3.5加入250μL0.2mol/LEDTA溶液。加入250μLTMB底物溶液。
加人100μL2mol/L硫酸溶液，终止反应。7.3.7
7.3.8着色后稳定几秒后判读结果：应在5min内读取结果，否则无效7.3.9
检测过程中同时设置阴、阳性对照，以沙门氏菌纯培养物为阳性对照，实验用水为阴性对照。结果判定
8.1质控
阴性对照结果应为无色。
阳性对照结果应为蓝色。
8.2结果判定
在符合8.1的情况下，被检样品进行检测时，如检测膜呈现均匀的蓝色，没有斑点，可以看到整个测试区域表面，判为沙门氏菌属筛选阳性。否则，判为沙门氏菌属筛选阴性。筛选阴性的被检样品报告未检出，筛选阳性的被检样品，按照GB4789.4进行确证，报告以该检测结果为准。
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缓冲蛋白陈增菌液
蛋白陈
氯化钠
磷酸氢二钠（含12H.O)
磷酸二氢钾
附录A
（规范性附录）
培养基
蒸馏水
1000ml
将各成分加人蒸馏水中，搅拌均匀，静置约10min，加热煮沸至完全溶解，调至pH7.2±0.1，121℃高压灭菌15min，临用时，以无菌操作分装灭菌玻璃瓶，每瓶225ml。A.2
2RVS肉汤
大豆蛋白陈
氯化钠
磷酸二氢钾
磷酸氢二钾
无水氯化镁
孔雀石氯
蒸馅水
min，加热点沸至完全溶解，调至pH7.2士0.1，高压将各成分加人蒸馅水中搅拌均勾，静置约10灭菌121℃，15min，临用时，以无菌操作分装灭菌玻璃瓶，每瓶225mL。A.3MKTTn肉汤
肉汁消化酶
酪蛋白消化酶
氯化钠
碳酸钙
磷酸钠
牛胆汁
宝石绿
碘化钾
新生霉素盐
蒸馏水
1000mL
将各成分加人蒸馏水中，搅混均匀，静置约10min，加热煮沸至完全溶解，调至pH7.2士0.1.高压灭菌121℃，15min，临用时，以无菌操作分装灭菌玻璃瓶，每瓶225mL。4
A,4木糖赖氨酸脱氧胆盐（XLD)琼脂酵母提取汁
L赖氨酸盐酸盐
脱氧胆酸钠
氯化钠
磷酸钠
柠檬酸胺铁
苯酚红
蒸馏水
1000mL
SN/T1059.6—2016
将各成分加入蒸馏水中，搅混均匀，静置约10min.加热煮沸至完全溶解，调至pH7.2土0.1.高压灭菌121℃，15min，临用时，以无菌操作分装灭菌玻璃瓶，每瓶200ml。A.5
亚硫酸铋(BS)琼脂
蛋白陈
牛肉膏
葡萄糖
硫酸亚铁
磷酸氢二钠
柠檬酸铋铵
亚硫酸钠
蒸馏水
或5.0g/1水溶液5.0ml
18.0g20.0g
1000ml
将前三种成分加人300mL蒸馏水（制作基础液），硫酸亚铁和磷酸氢二钠分别加入20mL和30mL.蒸馏水中，柠檬酸铋铵和亚硫酸钠分别加入20mL和30mL蒸馏水中，琼脂加入600ml蒸馏水中。然后分别揽拌均匀，煮沸溶解。冷至80℃左右时，先将硫酸亚铁和磷酸氢二钠混匀，倒入基础液中，混匀。将柠檬酸铋铵和亚硫酸钠混勾，倒入基础液中，再混勾。调至pH7.5土0.2，随即倾人琼脂液中，混合均勾，冷至50℃~55℃。加入煌绿溶液，充分混匀后立即倾注平Ⅲ。HE琼脂
牛肉膏
水杨素
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氯化钠
蒸馏水
0.4%溴麝香草酚蓝溶液
Andrade指示剂
18.0 g~20.0 g
1000mL
将前面-七种成分溶解于400mL蒸馏水内作为基础液：将琼脂加人于600mL蒸馏水内，加热溶解。加人甲液和乙液于基础液内，校正pH。再加入指示剂，并与琼脂液合并，待冷至50℃55℃，倾注平板。
甲液的配制
硫代硫酸钠
柠檬酸铁铵
蒸馏水
乙液的配制bZxz.net
去氧胆酸钠
蒸馏水
Andrade指示剂
酸性复红
1mol/L氢氧化钠溶液
蒸馏水
将复红溶解于蒸馏水中，加人氢氧化钠溶液。数小时后如复红褪色不全，再加氢氧化钠溶液1mL～2mL
A.7检测膜配套溶液
PBS缓冲液
氯化钠
磷酸二氢钾
磷酸氢二钾
氧化钾
1000ml
将各成分溶解于蒸馅水中，用1mo1/L氢氧化钠调至pH7.2。用蒸馏水加至1000ml.贮存冰箱：A.7.20.2mol/LEDTA溶液
称取2.0g乙二胺四乙酸二钠（NazH,Y·2HzO）溶于250mL蒸馏水中，转人聚乙烯塑料瓶中保存。
30.5%吐温20磷酸盐缓冲液
0.5mol/L磷酸盐缓冲液
吐温20
将吐温20溶解于0.5mol/1磷酸盐缓冲液中，最终pII7.2.贮存冰箱备用。A.7.4TMB底物溶液
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TMB储存液：200mgTMB溶于20mLN，N-二甲基甲酰胺中而成，4℃避光保存底物溶液：将75lTMB储存液、10mL底物缓冲液和10μLHO.混合而成
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