SN/T 4417-2016 常见食品过敏原可视芯片检测方法 SN/T4417-2016 标准压缩包解压密码：www.bzxz.net

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T4417—2016
常见食品过敏原可视芯片检测方法Food allergen detection with visual biosensor chips2016-03-09发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
新除保童真的
2016-10-01实施
本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。SN/T4417—2016
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口，本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国山东出人境检验检疫局、中华人民共和国北京出人境检验检疫局、中华人民共和国辽宁出入境检验检疫局、中华人民共和国上海出入境检验检疫局、中华人民共和国广东出入境检验检疫局、中华人民共和国天津出入境检验检疫局。本标准主要起草人：陈颖、韩建勋、王玮、邓婷婷、高宏伟、曾静、吴亚君、曹际娟、张舒亚、李志勇、侯丽萍。
1范围
常见食品过敏原可视芯片检测方法SN/T4417—2016
本标准规定了食品中大豆、花生、小麦、腰果、牛、鱼、鸡、虾等8种常见食品过敏原成分的可视芯片检测方法。
本标准适用于检测糕点、巧克力等食品中8种食品过敏原成分的定性检测，其他食品可参照使用。本标准所规定方法的最低检出限（LOD)为0.01%（质量分数）。2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仪注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T27403—2008实验室质量控制规范食品分子生物学检测3术语和定义、缩略语
3.1术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。3.1.1
foodallergen
食品过敏原
食品中能使机体产生过敏反应的物质。常见食品过敏原主要包括大豆、花生、小麦、坚果、牛奶、鱼、蛋类及甲壳纲动物等八大类重要过敏原。3.1.2
可视芯片visualbiosensorchips在平滑的基片表面均勾包覆一层100nm~1000nm厚度的透明薄膜，并将捕获探针以矩阵的形式点样于活化的薄膜表面，即成为可视芯片。用生物素标记的样品核酸与芯片上捕获探针进行特异性杂交反应，然后加人酶-抗体复合物和酶底物溶液。在酶的催化下，芯片表面的探针点上原位沉积产生不溶物，引起薄膜表面厚度改变，继而导致探针点反射光的颜色改变，产生肉眼可见的杂交信号，完成样品检测。
3.2缩略语
下列缩略语适用于本文件。
DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonuleicacid）dNTP：脱氧核糖核苷三磷酸（deoxyribonucleosidetriphosphate）CTAB：十六烷基三甲基溴化铵（cetyltrithylammoniumbromide）Tris：三（羟甲基）氨基甲烷tris(hydroxymethyl)aminomethaneEDTA：乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraaceticacid）Taq：水生热栖菌（Thermusaquaticu）OD：光密度值（opticaldensity）1
SN/T4417-2016
PCR：聚合酶链反应（polymerasechainreaction）SSC：柠檬酸钠缓冲液（saltsodium citrate）ATC：酸处理的酪蛋白（acid-treatedcasein）TMB：四甲基联苯胺（tetramethylbenzidine）HRP：辣根过氧化酶（horscradishPeroxidase)4防污染措施
可视芯片方法检测过程的防污染措施应符合GB/T27403—2008中附录D的规定。5方法提要
样品经研磨后，提取DNA，以DNA为模板，采用大豆Lectin基因、小麦Gliadin基因、花生Arah3基因、腰果Ana03基因、鱼16SrRNA基因、虾16SrRNA基因、牛线粒体DNA基因和鸡线粒体DNA基因设计和筛选特异性的引物和探针，基于多重PCR反应，对8种常见食品过敏原进行可视芯片高通量检测：根据芯片杂交信号，判断样品中是否存在常见的8种食品过敏原成分。6可视芯片检测方法
6.1原理
将醛基标记探针固定在经过氨基化处理的芯片表面，然后使用生物素标记的引物进行PCR扩增，扩增产物与芯片上的探针进行特定的杂交反应，接着用辣根过氧化酶抗体（HRP-antibody）处理，洗去未杂交的DNA链，加人四甲基联苯胺（TMB）处理，生物素标记的杂交DNA链在HRP-antibody和TMB的作用下产生沉淀而形成
层有机薄膜，这层薄膜通过改变芯片表面的厚度导致反射光的颜色变化，从而产生肉眼可见的信导，而没有杂交成功的探针位点无法结合抗体则无变化。仪器和设备
PCR仪。
离心机：最大离心力≥16.000g。微量移液器：2.5μ、10m100l.200、1000M冰箱.2℃～8℃.-20℃。
高压灭菌器，
核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。精密烘箱。
组织研磨器。
漩涡震荡器。
pH计。
天平：感量0.001g。
试剂和材料
6.3.1CTAB提取缓冲液：20 g/L,CTAB.1.4mol/LNaCl,0.1mol/L.Tris-HCl,0.02mol/LNazEDTA用10%盐酸调pH至8.0,121℃，高压灭菌20min，备用，6.3.2CTAB沉淀液：5g/LCTAB，40mmol/LNaCl,121℃.高压灭菌20min，备用。2
6.3.3NaCl溶液：1.2mol/L
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TE缓冲液（Tris-HCI、EDTA缓冲液)：1ommol/LTrisHCI(pH8.0).1mmol/LEDTA(pH8.0)
蛋白酶K：20mg/μL
无水乙醇（分析纯）。
70%乙醇。
异丙醇（分析纯）。
三氯甲烷（分析纯）
HotMasterTagDVA聚合。
dNTPs混合液。
10XMultiHotstartBuffer(含20mmol/1.Mg+）6.3.13
20xSSC溶液：3.0mal/L
NaCi.o.3mol/LCH.Na.O
芯片杂交缓冲液：30mL20×SSC溶液和12mLATC溶液，加去离子水定容至120mL。SDS溶液：1mg/mL
可视芯片：表面涂布一层T结构聚合体的聚二甲基硅氧烷（T-structurepolydimethylsiloxane，TSPS)基片
氨基修饰缓冲液：取2.5mgpoly（phe-lys）和5.85gNaCl置于100mL烧杯中，加人50mL6.3.17
1XPBS缓冲液，充分搅拌溶解，4℃保存备用。31XPBS缓冲液：8.0gNaO1.0.2gKCI.0.27gKHPO,和1.42gNazHPO,(pH7.4)。6.3.18
常见食品过敏原成分扩增引物和探针详见表16.3.19
试验用引物和探针
引物和探针库列
UCCCCA3
上游引物：5'GCCCTCTAGTCCAC
下游引物：5\biotin-GCCCATCTGCAAGCCITTTT3探针：5'ALDHaaHaaaaaAGCTTCGCCGCTTCCTTCAACTTCAG3上游引物：5'CGCAAAGTCAGCCTAGACAA3CTGCTCGTTCTC
下游引物：5'biotin-CTTGTC
擦针：5'ALD-aaaaaaaaaaGAAGAGCGTGAATTAGCCCTCGAGGACAGCA3
上游引物：5'TGGTCTCATCCCTCTGGTCAA3下游引物：5bhiotinGCTGCTGAGGAATCTGTGCTA3探针：5'ALDraaaaanaaaTGGCCACAAAGCGATTGCCAAGTGATGA3上游引物：5TGCCAGGAGTTGCAGGAAGT3F游引物：5'biotin-GCTGCCTCACCATTTGCTCTA3”保针：5'ALD-aaaaaaaasACAGAAGGTGCCGCTGCCAGAA3上游引物：5'CCCTCCTCCTTTCATCCTCAT3下游引物：5‘biotinGTCATAGCGGAACCGTGGATA3探针：5ALDaaaaaaaaAaCTATGAATCCGGGCCTC3上游H物：5GCCATATACTCTCCTTGGIGACA3下游引物：5\biotinGTAGGCTTGGGAATAGTACGA3探针.5'ALD-HaEaHaaCACAACTTTTATCACAATCCAGAACTGACACCAAC3目的基因
大豆Lectin基因
花生Arah3基因
小麦Giudin基因
腰果Ana03基因
鸡线粒体DNA基因
牛线粒体DNA基因
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表1（续）
引物和探针序列
上游引物：5ATAACAGCGCAATCCTCTCCC3鱼
芯片质
控探针
下游引物：5'biotinGCTGCACCATTAGGATGTCCT3探针：5'ALD-aaaraanaaaTTTACGACCTCGATGTTGGA3游引物：5AAGTCTAGCCTGCCCACTG3下游引物：5'biotin-GTCCAACCATTCATACAAGCC3探针：S'ALD-aaaaaaaaaGACCGTGCGAAGCTAGCATAATCATTAGTCT35'-ALD-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3'-Biotin6.4DNA提取
日的基固
鱼16SrRNA基因
虾16STRNA基因
称取10Cmg已制备好的样品至1.5mL离心管中，加人1mLCTAB提取缓冲液和10uL蛋白酶K，65℃1h，期间每隔10min振荡混匀。6.4.2
12000g离心10min，吸取上清液700μL至一新1.5mL离心管中，加入490uL氯仿，振荡混合后，12000g离心10min吸取500μlL上清液至一新1.5mL管中。加人2倍体积CTAB沉淀液，混后室温静置60min，12000g离心10min。弃去上清液.加人350μL1.2mmol/LNaCl溶液充分溶解沉淀。加人350μl氯仿，高速漩涡振荡混勺，1200g离心10min。吸取上清液至一新1.5ml管中，加入0.8倍体积异丙醇，混匀，一20℃静置20min，12000g离心10min。
6.4.9奔么1清液，用70%乙醇洗涤沉淀一次，12000g离心10min。弃去上清液，晾十，加人100μLTE缓冲液，溶解DNA沉淀，一20℃保存备用。6.4.10
6.5检测步骤
阴性对照、阳性对照和空白对照的设置阴性对照：采用不含有待测基因序列的动植物基因组DNA为模板阳性对照：采用含有待测基因序列的动植物DNA作为模板或含有目的基因序列的质粒DNA代替DNA模板。
设两个空白对照：
提取DNA时设置的提取空白对照（以无菌水代替样品）；多重反应的空自对照（以DNA溶解液代替DNA模板）。6.5.2多重PCR反应体系
多重PCR反应体系见表2和表3。表2为大豆、花生、小及腰果4种过敏原反应体系，表3为牛、鱼、鸡及虾4种过敏原反应体系。每个样品各做2个平行管。表2大豆、花生、小麦及腰果4种过敏原多重PCR反应体系组分
loxMulti HotstartBuffer
（含20mmol/LMg+）
大豆上游引物
大豆下游引物
花生上游引物
花生下游引物
小麦上游引物
小麦下游引物
腰果上游引物
腰果下游引物
HotMasterTaqDNA聚合
DNA模板
无菌水
工作液浓度
5μmol/L
10 pmol/L
10μmol/L
10μmol/lbzxZ.net
10μmol/L
10pemol/L
10pinol/L
10μmol/L
10μmol/L
10 ng/μl
加样量/uL
表3牛、鱼、鸡及虾4种过敏原多重PCR反应体系组分
10XMulti Hotstart Buffer
(含20mmol/LMg+）
牛上游引物
牛下游引物
鱼上游引物
鱼下游引物
鸡上游引物
鸡下游引物
虾上游引物
虾下游引物
HotMasterTaDNA聚合酶
DNA模板
无茵水
工作液浓度
5μmol/L
10umol/l
10μmol/L
10μmol/L
10μmol/L
10umol/l
10μmol/L
10μmol/L
10μmol/L
5U/μL
10 ng/μL
加样量/ul
注：反应休系可根据样品中过敏原种类检测要求进行调整(以无菌水代替引物)。6.5.3
3多重PCR反应参数
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反应体系终浓度
O.2μnol/L
0.08μmol/l
0.08μmol/L
0.16μmol/L
0.16 μmol/L
0.16μmol/l
G,16mmol/L
0.08mmol/L
0.08nmol/I.
0.04U/μL
1.6ng/4l.
反应体系终浓度
0.2μ4mol/L
0.2μmol/L
1.6μmol/L
1.6μmal/L
0.4μmol/L
0.4 μmol/L
2.0mmol/l.
0.8mmol/L
6mmol/L
1.6ng/μL
95℃预变性15min.94变性30s，58℃退火30s.72℃延伸20s;35个循环；循环完成后72℃，5min充分延仲。
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6.5.4可视芯片检测
6.5.4.1芯片表面改性：将可视芯片加入氨基修饰缓冲液，液面覆盖芯片，密封，室温下反应过夜；去掉氨基修饰缓冲液，依次用1PBS缓冲液、火菌水清洗芯片，各3次，立即吹干芯片表面，4℃保存备用。6.5.4.2探针固定：采用手工点样方式在每个杂交位点上点50nL150nL的探针溶液（100μmol/L）。也可采用芯片点样仪点探针。探针点样完毕后，将芯片置于湿度为70%的环境下室温放置2h，依次用1g/I.SDS溶液、灭菌水清洗芯片·各3次，立即吹干芯片表面，4℃避光干燥保存。6.5.4.3预杂交：加入90ul杂交缓冲液于装有芯片的容器中使芯片完全浸在杂交缓冲液中，45℃孵育5min。
6.5.4.4PCR产物变性：将2uLPCR产物用灭菌水稀释至10L，混勾后快速离心.95℃变性3min。6.5.4.5杂交：将变性的PCR产物立即移至杂交缓冲液中吸打混匀且防止出现气泡，45℃孵育10 mina
6冲洗：吸出杂交缓冲液，依次加人200L0.1×SSC溶液灭菌水，各清洗3次，立即吹干芯片6.5.4.6
表面。
6.5.4.7抗体结合：加入100uL辣根过氧化酶抗体溶液于装有芯片的容器中，使芯片完全浸在抗体溶液里，室温放置5min：
6.5.4.8冲洗：吸出抗体溶液，依次加人200aL0.1×SSC溶液、灭菌水，各清洗3次，立即吹干芯片表面。
6.5.4.9底物显色：加入100μL四甲基联米腰（TMB）底物显色液使芯片浸在TMB底物显色液里，室温避光放置5min。
6.5.4.10冲洗：吸出TMB底物显色液，加人2001灭菌水于芯片容器中，轻冲洗2次～3次，立即吹十芯片表面。
6.5.4.11观察：用肉眼观察可视芯片探针位点频色变化6.6质量控制
6.6.1基本原则：实验室中设置的各种对照验测结果应同时符合以下情况。否则，任何一种对照如果出现非下述正常结果，应重做实验6.6.2空白对照：日的探针位点未有肉眼可见的棕色或蓝色杂交信号。6.6.3阴性对照：目的探针位点未有肉眼可见的棕色或蓝色杂交信号。6.6.4阳性对照：目的探针位点有肉眼可见的棕色或蓝色杂交信号。7结果判断和确证
7.1可视芯片空白对照、阴性对照和口的探针位点无肉眼可见的棕色或蓝色杂交信号，阳性对照有肉眼可见的棕色或蓝色杂交信号，则判定被检样品结果为阴性。7.2可视芯片空白对照和阴性对照元肉眼可见的棕色或蓝色杂交信号，阳性对照和月的探针位点有肉眼可见的棕色或蓝色杂交信号，则判定被检样品结果阳性。还应通过对PCR产物进行测序测定，参照附录A中序列比对进行确证。
结果表述
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8.1可视芯片上目的探针检测结果为阳性者，判为含有该目的探针对应的X过敏原成分，表述为“检出×过敏原成分”
8.2可视芯片上目的探针检测结果为阴性者，判为未含有该目的探针对应的××过敏原成分，表述为“未检出××过敏原成分”。
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A.1大豆
附录A
（资料性附录）
扩增产物参考序列
GCCCTCTACTCCACCCCCATCCACATTTGGGACAAAGAAACCGGTAGCGTTGCCAGCTTCGCCGCTTCCTTCAACTTCACCTTCTATGCCCCTGACACAAAAAGGCTTGCAGATGGGOA.2
CGCAAAGTCAGCCTAGACAAGAAGAGCGTGAATTTAGCCCTCGAGGACAGCACAGCCGCAGAGAACGAGCAGGACAAG
TGGTCTCATCCCTCTGGTCAATGATCTGGCCACAAAGCGATTGCCAAGTGATGAGGCAACAATGCTGCCAACAACTAGCACAGATTCCTCAGCAGCA.4
TGCCAGGAGTTGCAGGAAGTAGACAGAAGGTGCCGCTGCCAGAACCTAGAGCAAATGGTGAGGCAGC
CCCTCCTCCTTTCATCCTCATTTCTATGAATCCGGGCCTCATATCCACGGTTCCGCTATGACA.6
GCCATATACTCTCCTTGGTGACATGCCGCAACTAGACACGTCAACATGACTGACAAIGATCTTATCAATATTCTTGACCCTTTTTATCATCTTTCAACTAAAAGTTTCAAAACACAACTTTTATCACAATCCAGAACTGACACCAACAAAAATATTAAAACAAAACACCCCTTGAGAAACAAAATGAACGAAAATTTATTTACCTCTTTTATTACCCCTGTAATTTTAGGTCTCCCTCTCGTAACCCTTATCGTACTATTCCCAAGCCTACA.7鱼
ATAACAGCGCAATCCTCTCCCAGAGTCCCTATCGACGAGGGGGTTTACGACCTCGATGTT8
GGATCAGGACATCCTATTGGTGCAGC
SN/T 4417—2016
AAGTCTAGCCTGCCCACTGATTAGAATTTAAAGGGCCGCGGTATACTGACCGTGCGAAGGTAGCATAATCATTAGTCTTTTAATTGAAGGCTTGTATGAATGGTTGGAC9
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