SN/T 4525.1-2016 出口食品中致病菌的分子分型MLST方法 第1部分：沙门氏菌 SN/T4525.1-2016 标准压缩包解压密码：www.bzxz.net

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中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T4525.1—2016
出口食品中致病菌的分子分型
MLST方法第1部分：沙门氏菌
Multilocus sequence typing detection method for pathogens in export food-Part1:Salmonella
2016-06-28发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2017-02-01实施
SN/T4525《出口食品中致病菌的分子分型！MLST方法》共分10个部分：
第1部分：沙门氏菌：
第2部分：金黄色葡菊球菌：
第3部分：副溶血性弧菌；
第4部分：霍乱弧菌；
第5部分：克罗诺杆菌；
第6部分：化脓链球菌：
第7部分：空肠弯曲菌：
第8部分：致泻性大肠埃希氏菌；第9部分：单核细胞增生李斯特氏菌；第10部分：小肠结肠炎耶尔森氏菌。本部分为SN/T4525的第1部分。
本部分按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。SN/T4525.1--2016
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承扭识别这些专利的责任本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位：深圳市检验检疫科学研究院、中华人民共和国深圳出人境检验检疫局、中华人民共和国江苏出人境检验检疫局。本部分主要起草人：林燕全、刘慧玲、袁芳、吕敬章、马淑棉、黄欣迪、葛丽雅、黄季华、赵芳、国燕云蒋原、薛峰。
1范围
出口食品中致病菌的分子分型
MLST方法第1部分：沙门氏菌
SN/T4525的本部分规定了出口食品中沙门氏菌分子分型MLST检测方法。本部分适用于出口食品中沙门氏菌2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。SN/T4525.1--2016
是注日期的引用文件，仪注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB4789.4食品安全国家标准
食品微生物学检验
2分析实验室用水规格和试验方法GB/T6682
GB19489实验室生物安全通用要求沙门氏菌检验
GB/T27403
实验室质量控制规范食品分子生物学检测3术语和定义、缩略语
3.1术语和定义
下列术语和定义适用于本文件
house-keeping genes
管家基因
所有细胞中均要表达的一类基因，其产物是对维持细胞基本生命活动所必需的，其基因序列高度保守并且在大多数情况下持续表达。又称看家基因，持家基因，3.1.2
ThermusaquaticusDNA polymeraseTagDNA酶
从Thermusaquaticus细菌中提取的耐热DNA聚合酶3.2缩略语
下列缩略语适用于本文件。
dNTP：脱氧核糖核苷三磷酸（deaxyribonucleosidetriphosphate)）EDTA：乙二胺四乙酸（EthyleneDiamineTetraaceticAcid)MLST：多位点序列分型（multilocussequencetyping）ST：序列型（SequenceType)）
Tris：三（羟甲基）氨基甲烷tris(hydroxymethyl)aminomethane4原理
MLST是通过测定多个管家基因中长度约为470bp核心片段的核苷酸序列，对其组合进行索引编SN/T4525.1—2016
号，不同的菌株对应不同的序列型，从而揭示菌株间等位基因的多样性。MLST分型中多个管家基因的序列分析比较在实验过程的操作性与结果的可靠性之间取得了平衡，结果准确，所得数据在不同的实验室间具有良好的可比性
5试剂和材料
除有特殊说明外，所有实验用试剂均为分析纯或生化试剂；实验用水符合GB/T6682中一级水的要求。所有试剂均用无DNA酶污染的容器分装。5.1DNA提取试剂：细菌基因组DNA提取试剂盒。5.2TaqDVA酶。
5.3dNTP:dATP、dTTP、dCTP、dGTP5.4引物：扩增引物和测序引物序列见表A.2。510×PCR缓冲液：200mmol/LTris-HClpH8.4)，200mmol/L氯化钾，15mmol/L氯化镁。5.5
5.6琼脂糖凝胶
Gelred核酸染色剂。
5.86×溴酚蓝上样缓冲液
5.9分子量标记：100bpDNAmarker。5.105×TBE电泳级冲液：445mmol/LTris，445mmol/L硼酸.10mmol/LEDTA（pH8.0）。使用时稀释为0.5XTBE电泳缓冲液。
5.11质控菌株：肠炎沙门氏菌ATCC13076或等效菌株仪器和设备
6.1离心机。
6.2天平：量程2kg，感量0.1g。6.3 pH计。
6.4涡旋振荡器。
6.5PCR仪
6.6电泳仪。
6.7凝胶成像仪。
6.8基因测序仪。
超净工作台。
移液器：0.1μL~2.5μL.2μL20μl20μL~200μL、100uL1000μL。6.10
7检测程序
根据沙门氏菌的7个管家基因，设计PCR引物和测序引物序列（见附录A），通过管家基因片段的PCR扩增，再进行PCR产物的纯化和DNA序列双向测定，将所得到的沙门氏菌7个管家基因测序结果的上下游序列整合后得到完整序列，为减小误差首尾的几个碱基不计算入序列测定结果。最后将测序结果上传至MLST网站（http：//mist.warwick.ac.uk/mlst/）进行在线数据分析，得到的结果与MLST数据库进行比对，获得菌株所对应的等位基因图谱确定沙门氏菌分离株的序列型。在确定ST基础上应用eBURST程序对菌株进行分析，构建系统遗传进化树（参见附录B)。MLST的操作程序见图1。
检测步骤
细菌基因组DNA提取
提取细菌基因组 DNA
MI.ST基因选择
PCR引物和测序引物的选择
管家基因片段的PCR扩增
PCR产物的纯化和DNA序列测定
管家基因的DNA序列分析
数据处理
图1MLST操作程序
将经过GB4789.4的方法鉴定为沙门氏菌的菌株提取基因组DNA。8.2MLST基因选择
按表A.1所示，选择沙门氏菌的7个管家基因进行MLST分析8.3PCR扩增引物和测序引物的选择SN/T4525.1--2016
按表A.2中的序列，合成沙门氏菌7个管家基因对应的7对PCR扩增引物和7对测序引物。引物在使用前按照相应分子量进行稀释到10umol/1.,一20℃保存备用。管家基因片段的PCR扩增bzxz.net
反应体系体积为50μL：10×PCR缓冲液5μL、dNTP（2.5mmol/L）4l、引物对（10μmol/L）2μL、TaDNA聚合酶（5U/μL)0.4uL、模版DNA2μl、水34.6uLaroC、hemD、hisD、sucA、thrA基因的反应条件为：预变性94C5min；变性94℃458，退火60℃3
SN/T4525.1—2016
45s，延伸72℃1min，进行35个循环；72℃再延伸7min。dnaN、purE基因的反应条件为：预变性94℃5min：变性94℃45s，退火58℃45s，延伸72℃1min，进行35个循环；72℃再延伸7min。将PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，染色后紫外光下成像观察，条带单一且明亮的样品进行PCR产物纯化与DNA序列测定。
8.5DNA序列测定
将PCR产物纯化后，采用附录A中表A,2的测序引物对管家基因的DNA序列进行双向测序。8.6结果报告
将所得到的沙门氏菌7个管家基因测序结果与Genank中的已有的相关基因进行比对，然后使用Lasergcnc7.1对序列进行ClustalV分析，将上下游序列整合后得到完整序列，为减小误差首尾的几个碱基不计算人序列测定结果。最后将测序结果上传至MI.ST网站（http：//mlst.warwick.ac.uk/mlst/）进行在线数据分析，得到的结果与MLST数据库进行比对。生物安全措施和防污染措施
生物安全措施
为了保护实验室人员的安全，应由具备资格的工作人员检测沙门氏菌，所有培养物和废弃物应按照GB19489中的有关规定执行。
9.2防污染措施
防止污染措施应符合GB/T27403的规定4
基因名称
引物名称
扩增引物
测序引物
片段大小
附录A
（规范性附录）
沙门氏菌多位点序列分型的管家基因及引物序列表A.1
沙门氏菌管家基因
管家基因名称
分支酸变位酶基因(cha
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rismate synthase)
DNA聚合酶合成酶mg亚单位基因（DNApolymeraseⅡbetasubunit）康叶咻原Ⅲ同和酶基因（uroperphyrinogenIcosynthase)组氨醇脱氢酷基因（hisrdinol dehydrogenase）氨基咪唑甲酸核苷酸羧酶基因（phosphoribosylaminoimidazolecarboxylas）钱二酸脱氢酶基因（alphaketoglutaratedehydrogenase）天冬氨酸激酶高丝氨酸脱氢酶基因（aspartokinase+homoserinedehydrogenase)表A.2
基因名称
沙门氏菌管家基因的扩增引物序列和测序引物序列引物序列45°*3）
aroC(Forward)
aroC (Reverse)
dnaN(Forward)
dnaN (Reverse)
hemD(Forward)
hemD (Revcrse)
hisD (Forward)
hisD(Reverse)
purE(Forward)
purE (Reverse)
sucA(Forward)
sucA (Reverse)
thrA (Forward)
thrA (Reverse)
aroC(Forward)
aroC (Reverse)
dnaN (Forward)
dnaN (Reverse)
hemD(Forward)
hemD(Reverse)
hisD (Forward)
hisD(Reverse)
purE (Forward)
purE (Reverse)
sucA (Forward)
sucA (Reverse)
thrA (Forward)
thrA (Reverse)
CCTGGCACCTCGCGCTATAC
CCACACACGGATCGTGGCG
ATGAAATTTAC
CGTTGAACGTGA
GAGAGGATTGC
AATTTTCATIC
GAAGCGTTAGTGAGCCGTCTGCG
LAGCGACCTTAATATCTTGCCA
TCCGCGCAGAC
AAACGTTCCATT
CTGAACGGTCAI
TCCGTTTCTG
ATGTCTTCCCGCAATAATCC
TCATAGCGTCCCCCGCGGATC
AGCACCGAA
GAGAAACGCTG
GGTTGTTGATAACGATACGTAC
GTCACGGTGATCGATCCGGT
CACGATATTGATATTAGCCCG
GGCACCAGTATTGGCCTGCT
CATATGCGCCACAATGTGTTG
CCGATTCTCGGTAACCTGCT
CCATCCACCAGCTTCGAGGT
GTGGCCTGGAGTTTTCCACT
GACCAATAGCCGACAGCGTAG
GTCGGTCTGTATATTCCCGG
GGTAATCGCATCCACCAAATC
CGCATTATTCCGGCGCGTGT
CGCGGATCGGGATTTTCCAG
AGCACCGAAGAGAAACGCTG
GGTTGTTGATAACGATACGTAC
ATCCCGGCCGATCACATGAT
CTCCAGCAGGGGCTCTTTCAG
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附录B
（资料性附录）
系统遗传进化树的构建
将所得到的沙门氏菌7个管家基因核酸扩增片段DNA序列进行MLST分析，获得菌株所对应的等位基因图谱，确定沙门氏菌分离株的序列型（ST）。在确定ST的基础上应用eBURST程序将菌株分为各个谱系组（clonalcomplex），构建系统遗传进化树：图B.1为部分沙门氏菌进行MLST分析后，绘制的系统遗传进化树图。
Title:dismat387733.txt
Date:ThuNoy2712:35:202014
ST-40, ST-40,5T-40
ST19,ST19,ST-19.ST-19,ST-19
ST-152
1,ST-11,ST-11,ST-11,ST-11,ST-11,ST-11,ST11,ST-11.SI-11,ST-11ST-32.ST-32,ST-32,ST-32,ST-32ST-811
ST R07ST-815
ST-810
ST-809
ST 115, ST-115, ST-115,ST115ST-684,ST684
ST-321
Fit-91.0ntax-61
ST-808.ST-808
ST-13,ST13,ST-13,ST-13,ST13
ST-2,ST-2,ST-2.ST-2,ST-2
部分沙门氏菌系统遗传进化树图图B.1
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