SN/T 4525.3-2016 出口食品中致病菌的分子分型MLST方法 第3部分：副溶血性弧菌 SN/T4525.3-2016 标准压缩包解压密码：www.bzxz.net

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T4525.3—2016
出口食品中致病菌的分子分型
MLST方法第3部分：副溶血性弧菌Multilocus sequence typing detection method for pathogens in export food-Part 3:Vibrio parahemolyticus2016-06-28发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2017-02-01实施
SN/T4525《出口食品中致病菌的分子分型MLST方法》共分10个部分：
第1部分：沙门氏菌；
第2部分：金黄色葡葡球菌；
第3部分：副溶血性弧菌；
第4部分：霍乱弧菌：
第5部分：克罗诺杆菌：
第6部分：化链球菌；
第7部分：空肠弯曲菌：
第8部分：致泻性大肠埃希氏菌；第9部分：单核细胞增生李斯特氏菌；第10部分：小肠结肠炎耶尔森氏菌本部分为SN/T4525的第3部分
本部分按照GB/T1.1一2009给出的规则起草SN/T4525.3--2016
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位：中华人民共和国北京出入境检验检疫局、中华人民共和国江苏出入境检验检疫局、中华人民共和国河北出人境检验检疫局。本部分主要起草人：曾静、付溥博、将原、薛峰、张琳。1范围
出口食品中致病菌的分子分型
MLST方法第3部分：副溶血性弧菌SN/T4525.3—2016
SN/T4525的本部分规定了出口食品中副溶血性弧菌分子分型MLST检测方法。本部分适用于出口食品中副溶血性弧菌的分子分型2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的凡是注日期的引用文件，仪注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB4789.7食品安全国家标准
食品微生物学检验
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB19489实验室生物安全通用要求副溶血性弧菌检验
GB/T27403实验室质量控制规范食品分了生物学检测3术语和定义、缩略语
3.1术语和定义
下列术语和定义适用于本文件
管家基因
house-keepinggenes
所有细胞中均要表达的一类基因，其产物是对维持细胞基木生命活动所必需的，其基因序列高度保守并且在大多数情况下持续表达。叉称看家基因，持家基因。3.1.2
Thermus aquaticusDNA polymeraseTagDNA酶
从Thermusaquaticus细菌中提取的耐热DNA聚合酶3.2缩略语
下列缩略语适用工本文件
dNTP：脱氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleosidetriphosphate）EDTA：乙二胺四乙酸（EthyleneDiamineTetraaceticAcid)MLST：多位点序列分型（multilocussequencetyping）ST：序列型（SequenceType）
Tris：三（羟甲基）氨基甲烷Ltris（hydroxymethyl)aminomethane4原理
MLST是通过测定多个管家基因中长度约为470bp核心片段的核首酸序列，对其组合进行索引编1
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号，不同的菌株对应不同的序列型，从而揭示菌株间等位基因的多样性，MLST分型中多个管家基因的序列分析比较在实验过程的操作性与结果的可靠性之间取得了平衡，且结果准确，所得数据在不同的实验室问具有良好的可比性。
试剂和材料
除有特殊说明外，所有实验用试剂均为分析纯或生化试剂；实验用水符合GB/T6682中一级水的要求。所有试剂均用无DNA酶污染的容器分装。5.1DVA提取试剂：细菌基因组DNA提取试剂盒。5.2TagDNA酶
5.3dNTP:dATP、dTTP,dCTP,dGTP,5.4引物：扩增引物和测序引物序列见表A.2。5.510XPCR缓冲液：200mmol/LTris-HCl(pH8.4），200mmol/L氟化钾，15mmol/L氯化镁5.6琼脂糖凝胶
5.7Gelred核酸染色剂
5.86×溴酚蓝上样缓冲液。
5.9分子量标记：100bpDNAmarker。5.105×TBE电泳缓冲液：445mol/LTris，445mmol/I.硼酸，10mmol/LEDTA（pH8.0）使用时稀释为0.5XTBE电泳缓冲液。
5.11质控菌株：副溶血性弧菌ATCC17802或等效菌株。6
仪器和设备
6.1离心机。
6.2天平：量程2kg，感量0.1g。6.3 pH计。
6.4涡旋振荡器。
6.5PCR仪。
6.6电泳仪。
6.7凝胶成像仪。
基因测序仪。
6.9超净工作台。
移液器：0.1μ~2.5m2μl~20μl.20μ~200μ.100μL~1000μl.g7
检测程序
根据副溶血性弧菌的7个管家基因，设计PCR引物和测序引物序列（见附录A)，通过管家基因片段的PCR扩增，再进行PCR产物的纯化和TDNA序列双向测定，将所得到的副溶血性弧菌7个管家基内测序结果的上下游序列整合后得到完整序列，为减小误差首尾的几个碱基不计算入序列测定结果。最后将测序结果上传至ML.ST网站（http：//mlst.warwick.ac.uk/mlst/）进行在线数据分析，得到的结果与MLST数据库进行比对，获得菌株所对应的等位基因图谱，确定副溶血性弧菌分离株的序列型。在确定ST基础I:应用eBLRST程序对菌株进行分析，构建系统遗传进化树（参见附录B）。MLST的操作程序见图1。
检测步骤
细菌基因组DNA提取
提取细菌基因组DNA
MLST基因选择
PCR引物和测序引物的选择
管家基因片段的PCR扩增
PCR产物的纯化和DNA序列测定
管家基因的DNA序列分析
数据处理
MLST操作程序
将经过GB4789.7的方法鉴定为副溶血性弧菌的菌株提取基因组DNA。MLST基因选择
按表A.1所示，选择副溶血性弧菌的7个管家基因进行MLST分析。8.3PCR扩增引物和测序引物的选择SN/T4525.3—2016
按表A.2中的序列,合成副溶血性弧菌7个管家基因对应的7对PCR扩增引物和7对测序引物引物在使用前按照相应分子量进行稀释到10umol/1.，一20℃保存备用，8.4管家基因片段的PCR扩增
反应体系体积为50μL:10×PCR缓冲液5μL、dNTP（2.5mmol/L)1pL、引物对（10μmol/L）1μL、TaDNA聚合酶（5U/μL)1μL、模版DNA3μL、水38μL反应条件为：预变性96℃5min；变性96℃1min.退火56℃1min，延伸72℃1min，进行30个3
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循环；72再延伸5min。
将PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，染色后紫外光下成像观察，条带单一且明亮的样品进行PCR产物纯化与DNA序列测定。
5DNA序列测定
将PCR产物纯化后，采用表A.2中的测序引物对管家基因的DVA序列进行双向测序8.6
6结果报告
将所得到的副溶血性弧菌7个管家基因测序结果与GenBank中的已有的相关基因进行比对.然后使用Lasergene7.1对序列进行ClustalV分析将上下游序列整合后得到完整序列，为减小误差首尾的几个碱基不计算入序列测定结果。最后将测序结果上传至MLST网站（http：//mlst.warwick.ac.uk/mlst/)进行在线数据分析.得到的结果与MLST数据库进行比对9
生物安全措施和防污染措施
生物安全措施
为了保护实验室人员的安全，应出具备资格的工作。按照GB19489中的有关规定执行.9.2防污染措施
（员检测副溶血性弧菌，所有培养物和废弃物应防止污染措施应符合GB/T27403的规定S
基因名称
引物名称
扩增引物
测序引物
附录A
（规范性附录）
副溶血性弧菌多位点序列分型的管家基因及引物序列表A.1
片段大小
副溶血性弧菌管家基因
管家基因名称
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编码重组蛋白A的基固（Recapprotein）polymerase I, alpha subunit)DNA聚合酶合成酶Ⅲ。亚单位基因（DNADNA旋转爵ⅢP亚单位基因（DNAgyrase，subunitB）苏氨酸脱氢酶基因（Threorinedehyrogenase）转氧酶亚单位基因（Transhydrogenasealpha subunit）氨甲酰天冬氨酸脱水酶基因（Dihydroorotase）色氨酸酶基因（Tryptophanase）副溶血性弧菌管家基因的扩增引物序列和测序引物序列基因名称
recA (Forward)
recA (Reverse)
dnaE (Forward)
dnaE (Reverse)
gyrB(Forward)
gyrB(Reverse)
dtdS (Forward)
dtdS (Reverse)
pntA (Forward)
pntA (Reverse)
pyrC(Forward)
pyrC(Reverse)
tnaA(Forward)
tnaA (Reverse)
recA Forward)
recA(Reverse)
dnaE(Forward)
dnaE (Reverse)
gyrB(Forward)
gyrB (Reverse)
didS (Forward)
dtdS (Reverse)
pntA(Forward)
pntA (Reverse)
PyrC (Forward)
pyrC(Reverse)
tnaA (Forward)
tnaA (Reverse)
GCTTCTGGTTGAG
GACGAG
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CAGAAAGCG
ACGACGGOCAGTCGRATMACCGCTTTCGCCGGTAAA
ACAGCTATGACCGAKATGT
GTGAGCTGTTTGC
CAGGAA
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PACCGAGTCACCK
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GACGAGAACAAACAGAAAGCG
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CAGGAAACAGCTATGACC
TGTAAAACGACGGCCAGT
CAGGAAACAGCTATGACC
TGTAAAACGACGGCCAGT
CAGGAAACAGCTATGACC
TGTAAAACGACGGCCAGT
CAGGAAACAGCTATGACC
TGTAAAACGACGGCCAGT
CAGGAAACAGCTATGACC
TGTAAAACGGCCAGT
CAGGAAACAGCTATGACC
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附录B
（资料性附录）
系统遗传进化树的构建
将所得到的副溶血性弧菌7个管家基因核酸扩增片段DNA序列进行MLST分析，获得菌株所对应的等位基因图谱，确定副溶血性弧菌分离株的序列型(ST）。在确定ST的基础上应用cBURST程序将菌株分为各个谱系组（clonalcomplex），构建系统遗传进化树。图B.1为部分副溶血性弧菌进行MLST分析后，绘制的eBURST分析结果图。.69
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部分副溶血性弧菌eBURST分析结果图30
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