SN/T 4525.4-2016
基本信息
标准号： SN/T 4525.4-2016
中文名称：出口食品中致病菌的分子分型MLST方法 第4部分：霍乱弧菌
标准类别：商检行业标准(SN)
标准状态：现行
出版语种：简体中文
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标准分类号
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出版信息
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标准简介
SN/T 4525.4-2016 出口食品中致病菌的分子分型MLST方法 第4部分：霍乱弧菌
SN/T4525.4-2016
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标准内容
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T4525.4--2016
出口食品中致病菌的分子分型
第4部分：霍乱弧菌
MLST方法
Multilocus sequence typing detection method for pathogens in export food-Part4:Vibriocholera
2016-06-28发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2017-02-01实施
SN/T4525《出口食品中致病菌的分子分型第1部分：沙门氏菌；
第2部分：金黄色葡萄球菌；
第3部分：副溶血性弧菌；
第4部分：霍乱弧菌；
第5部分：克罗诺杆菌
第6部分：化脓链球菌；
第7部分：空肠弯曲菌；
第8部分：致泻性大肠埃希氏菌：第9部分：单核细胞增生李斯特氏菌；第10部分：小肠结肠炎耶尔森氏菌本部分为SN/T4525的第4部分。
MLST方法》共分10个部分：
本部分按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。SN/T4525.4--2016
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位：中华人民共和国江苏出入境检验检疫局、中华人民共和国北京出人境检验检疫局。
本部分主要起草人：付薄博、曾静、汪琦、张锡全、薛峰、蒋原、刘莉。1范围
SN/T4525.4—2016
出口食品中致病菌的分子分型
MLST方法
第4部分：霍乱弧菌
SN/T4525的本部分规定了出口食品中霍乱孤菌分子分型MLST检测方法，本部分适用于出口食品中霍弧菌的分2规范性引用文件
产分型检测
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注H期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单适用于本文件。GB/T6682：分析实验室用水规格和试验方法GB19489实验室生物安全通用要求GB/T27403实验空质量控制规范食品分子生物学检测SN/T1022—2010进出口食品中霍乱弧菌检验方法3术语和定义、缩略语
3.1术语和定义
下列术语和定义适用于本文件
管家基因house-keepinggenes
产物是对维持细胞基本生命活动所必需的，其基因序列高度保所有细胞中均要表达的一类基因，其守并且在大多数情况下持续表达。又称看家基因，持家基因。3.1.2
Tag DNA 酶 Thermus aquaticus DNA polymerase从Thermus aquaticus细菌中提取的耐热DNA聚合酶3.2缩略语
下列缩略语适用于本文件
dVTP：脱氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleosideiriphosphate）EDTA：Z二胺四Z酸（EthyleneDiarnineTetraaceticAeid)MLST：多位点序列分型（multilocussequencetyping）ST：序列型（SequenceType)
Tris：三（羟甲基）氨基甲烷【tris（hydroxymethyl)aminomethane）4原理
MLST是通过测定多个管家基因中长度约为470bp核心片段的核苷酸序列，对其组合进行索引编1
SN/T4525.4—2016
号，不同的菌株对应不同的序列型，从而揭示菌株间等位基因的多样性。MLST分型中多个管家基因的序列分析比较在实验过程的操作性与结果的可靠性之间取得了平衡，且结果准确，所得数据在不同的实验室间具有良好的可比性，
5试剂和材料
除有特殊说明外，所有实验用试剂均为分析纯或生化试剂；实验用水符合GB/T6682中一级水的要求。所有试剂均用无DNA酶污染的容器分装。5.1DNA提取试剂：细菌基因组DNA提取试剂盒。5.2
2TaqDNA酶。
dNTP:dATP,dTTP,dCTP,dGTP
引物：扩增引物和测序引物序列见表A.2。5.4
510×PCR缓冲液：200mmol/LTris-HCl(pH8.4)，200mmol/L氯化钾，15mmol/L氯化镁。5.5
琼脂糖凝胶。
Gelred核酸染色剂。
36×溴酚蓝上样缓冲液。
9分子量标记：100bp~2000bpDNAmarker5.9
5.105×TBE电泳缓冲液：445mmol/l.Tris，445mmol/L硼酸，1Cmmol/LEDTA（pH8.0）。使用时稀释为0.5XTBE电泳缓冲液。
质控菌株：霍乱孤菌Vbo非01霍乱弧菌或等效菌株。：仪器和设备
6.1离心机。
犬平：量程2kg，感量0.1g。
pH计。
涡旋振荡器
PCR仪。
5电泳仪。
凝胶成像仪。
基因测序仪。
超净工作台。
移液器：0.1μL2.5μl2μL~-20μL.20μL~200μL、100μL~1000μl检测程序
MILST的操作程序见图1。
8检测步骤
细菌基因组DNA提取
提取细菌基因组DNA
MLST基因选择
PCR引物和测序引物的选择
管家基因片段的PCR扩增
PCR产物的纯化和DNA序列测定
管家基因的DNA序列分析
数据处理
图1MLST操作程序
SN/T4525.4--2016
将经过SN/T1022一2010的方法鉴定为霍乱孤菌的菌株提取基因组DNA。取待测样本1mL，加到1.5ml.离心管中，8000r/min离心3min，弃去上清。加入750uLDNA提取液，65℃温浴30min加酚：三氯甲烷：异戊醇（25：24：1)500μL，振荡混勾，13000r/min离心5min，吸取500uL上清液与400μL的异丙醇充分混合，13000r/min离心5min.75%乙醇冲洗沉淀一次，13000r/min离心5min，充去上清，沉淀干燥后溶于30μLTE溶液中，立即用于检测或短期保存于20℃。注：也可使用其他经验证的DNA提取方法或等效的商品化细菌DNA提取试剂盒，按照其使用说明操作。8.2DNA浓度和纯度的测定
取5μLDNA溶液加双蒸水稀释至1mL，使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计分别检测260nm和280nm处的吸光值A26和Az80。DNA的浓度按式（1)计算：=AXNX50/1000
式中：
-DNA浓度，单位为微克每毫升（μg/mL.)；A
-260nm处的吸光值：
SN/T4525.4—2016
N—核酸稀释倍数。
当A280/A28比值在1.7~1.9之间时，适宜于PCR扩增，8.3MLST基因选择
按表A.1所示，选择霍乱孤菌的7个管家基因进行MLST分析。8.4PCR扩增引物和测序引物的选择按表A,2中的序列，合成霍乱弧菌7个管家基因对应的7对PCR扩增引物（测序引物）。引物在使用前按照相应分了量进行稀释到10μmol/L，一20C保存备用。8.5目的基因片段的PCR扩增
反应体系体积为50uL：10×
PCR缓冲液5uLdNTP(10mmol/L)2μL、引物对（10μmol/L）2uL、TagDNA聚台酶（5U/uL)0.4μL模板DNA5水33.6
反应条件为：94℃5min：94℃1min，55℃1min，72℃30s.35个循环；72℃7min将PCR产物进行2%琼脂糖凝胶电泳，染色后紫外光下成像观察，条带单一且明亮的样品进行PCR产物纯化与DNA序列测定。
8.6DNA序列测定
将PCR产物纯化后，采用表A.2中的测序引物对管家基因的DNA序列进行双向测序。8.7结果报告
将所得到的霍乱弧菌7个管家基因测序结果使用Lasergene7.1对序列进行CluxtalV儿个碱基不计算人序列测定结果，GenBank中的已有的相关基因进行BLAST，然后分析，将上下游序列整合后得到完整序列，为减小误差首尾的测序结果上传至ML.ST网站（http：//mlst.net）进行在最后将
线数据分析，得到的结果与MLST数据库进行比对。在确定序列型的基础上应用eBURST或其他软系统遗传进化（参见附录B）
件将菌株分为各个谱系组，构建9生物安全措施和防污染措施
9.1生物安全措施
为了保护实验室人员的安全，应由具备资格的工作人员检测霍乱弧菌，所有培养物和废弃物应按照GB19489中的有关规定执行
9.2防污染措施
防止污染措施应符合GB/T27403的规定。4
基因名称
基因名称
adk(Forward)
adk(Reverse)此内容来自标准下载网
附录A
（规范性附录）
霍乱弧菌多位点序列分型的管家基因及引物序列表A.1、霍乱弧菌管家基因
片段大小
gyrB(Forward)
gyrB(Reverse)
metE(Forward)
metE(Reverse)
mdh(Forward)
mdh(Reverse)
pntA(Forward)
pntA(Reverse)
purM(Forward)
purM(Reverse)
pyrC(Forward)
PyrC(Reverse)
管家基因名称
SN/T4525.4--2016
nylatekinase)
肌激酶（ade
DNA旋转酶Ⅲ3亚单位基因（DNAgyrase,subunitB)蛋氨酸合成酶（m
ethionine synthase)
苹果酸酶（matatedehydrogenase）陡核苷酸转氢酶（pyridinenucleotidetranshydrogenase)磷酸核糖基甲酰甘氨酸胺环连接酶osphoribosyl-formylglyeinamidecyclo-ligase冬氨酸脱水酶基因（Dithydroorotase）大
霍乱管家基因的扩增（测序）引物序列和引物序列引物序列（5°→3）
CATCATTCTTCTCGGTGCTC
AGTGCCGTCAAAG
TTCAGGTA
CTAGTGC
AGTCTTTTTCCT
GACAATC
CGGGTGACTTTGCTTGGT
CAGATCGACTGGGCTGTG
ATGAAAGTCG
TGTTATTGG
TGGCCCATAGAAAG
CTTTGATGGAAAAACTCTCA
GATATTGCCGTCTTTTTCTT
GGTGTCGATATTGATGCAGG
GGAATGTTTTCCCAGAAGCC
ATCATGCCTAACACGGTTCC
TTCAAACACTTCGGCATA
SN/T4525.4—2016
附录B
（资料性附录）
系统遗传进化树的构建
将所得到的霍乱弧菌7个管家基因核酸扩增片段L)NA序列行MLST分析，获得菌株所对应的等位基因图谱，确定需乱弧菌分离株的序列型（ST）。在确定ST的基础上应用cBURST程序或其他相关软件将菌株分析，构建系统遗传进化树：图B.1为部分霍乱弧菌进行MI.ST分析后，绘制的eBURST分析结果图。
53300249
：283
：320
221211524152
：229
：303
.309.134
2353674152020284
2242253
1588356355
80·83262
。334
：422
：244
332166274
173170
，181
26473-168
702115:1%
169169
1218217343
·292.251
368363
205416
362 3611215
188.3721963
328305
12501384
44.206.22.21247
210·289
：131
图B.1部分霍乱弧菌eBURST分析结果图260
：243
：382
●426
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出口食品中致病菌的分子分型
第4部分：霍乱弧菌
MLST方法
Multilocus sequence typing detection method for pathogens in export food-Part4:Vibriocholera
2016-06-28发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2017-02-01实施
SN/T4525《出口食品中致病菌的分子分型第1部分：沙门氏菌；
第2部分：金黄色葡萄球菌；
第3部分：副溶血性弧菌；
第4部分：霍乱弧菌；
第5部分：克罗诺杆菌
第6部分：化脓链球菌；
第7部分：空肠弯曲菌；
第8部分：致泻性大肠埃希氏菌：第9部分：单核细胞增生李斯特氏菌；第10部分：小肠结肠炎耶尔森氏菌本部分为SN/T4525的第4部分。
MLST方法》共分10个部分：
本部分按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。SN/T4525.4--2016
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位：中华人民共和国江苏出入境检验检疫局、中华人民共和国北京出人境检验检疫局。
本部分主要起草人：付薄博、曾静、汪琦、张锡全、薛峰、蒋原、刘莉。1范围
SN/T4525.4—2016
出口食品中致病菌的分子分型
MLST方法
第4部分：霍乱弧菌
SN/T4525的本部分规定了出口食品中霍乱孤菌分子分型MLST检测方法，本部分适用于出口食品中霍弧菌的分2规范性引用文件
产分型检测
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注H期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单适用于本文件。GB/T6682：分析实验室用水规格和试验方法GB19489实验室生物安全通用要求GB/T27403实验空质量控制规范食品分子生物学检测SN/T1022—2010进出口食品中霍乱弧菌检验方法3术语和定义、缩略语
3.1术语和定义
下列术语和定义适用于本文件
管家基因house-keepinggenes
产物是对维持细胞基本生命活动所必需的，其基因序列高度保所有细胞中均要表达的一类基因，其守并且在大多数情况下持续表达。又称看家基因，持家基因。3.1.2
Tag DNA 酶 Thermus aquaticus DNA polymerase从Thermus aquaticus细菌中提取的耐热DNA聚合酶3.2缩略语
下列缩略语适用于本文件
dVTP：脱氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleosideiriphosphate）EDTA：Z二胺四Z酸（EthyleneDiarnineTetraaceticAeid)MLST：多位点序列分型（multilocussequencetyping）ST：序列型（SequenceType)
Tris：三（羟甲基）氨基甲烷【tris（hydroxymethyl)aminomethane）4原理
MLST是通过测定多个管家基因中长度约为470bp核心片段的核苷酸序列，对其组合进行索引编1
SN/T4525.4—2016
号，不同的菌株对应不同的序列型，从而揭示菌株间等位基因的多样性。MLST分型中多个管家基因的序列分析比较在实验过程的操作性与结果的可靠性之间取得了平衡，且结果准确，所得数据在不同的实验室间具有良好的可比性，
5试剂和材料
除有特殊说明外，所有实验用试剂均为分析纯或生化试剂；实验用水符合GB/T6682中一级水的要求。所有试剂均用无DNA酶污染的容器分装。5.1DNA提取试剂：细菌基因组DNA提取试剂盒。5.2
2TaqDNA酶。
dNTP:dATP,dTTP,dCTP,dGTP
引物：扩增引物和测序引物序列见表A.2。5.4
510×PCR缓冲液：200mmol/LTris-HCl(pH8.4)，200mmol/L氯化钾，15mmol/L氯化镁。5.5
琼脂糖凝胶。
Gelred核酸染色剂。
36×溴酚蓝上样缓冲液。
9分子量标记：100bp~2000bpDNAmarker5.9
5.105×TBE电泳缓冲液：445mmol/l.Tris，445mmol/L硼酸，1Cmmol/LEDTA（pH8.0）。使用时稀释为0.5XTBE电泳缓冲液。
质控菌株：霍乱孤菌Vbo非01霍乱弧菌或等效菌株。：仪器和设备
6.1离心机。
犬平：量程2kg，感量0.1g。
pH计。
涡旋振荡器
PCR仪。
5电泳仪。
凝胶成像仪。
基因测序仪。
超净工作台。
移液器：0.1μL2.5μl2μL~-20μL.20μL~200μL、100μL~1000μl检测程序
MILST的操作程序见图1。
8检测步骤
细菌基因组DNA提取
提取细菌基因组DNA
MLST基因选择
PCR引物和测序引物的选择
管家基因片段的PCR扩增
PCR产物的纯化和DNA序列测定
管家基因的DNA序列分析
数据处理
图1MLST操作程序
SN/T4525.4--2016
将经过SN/T1022一2010的方法鉴定为霍乱孤菌的菌株提取基因组DNA。取待测样本1mL，加到1.5ml.离心管中，8000r/min离心3min，弃去上清。加入750uLDNA提取液，65℃温浴30min加酚：三氯甲烷：异戊醇（25：24：1)500μL，振荡混勾，13000r/min离心5min，吸取500uL上清液与400μL的异丙醇充分混合，13000r/min离心5min.75%乙醇冲洗沉淀一次，13000r/min离心5min，充去上清，沉淀干燥后溶于30μLTE溶液中，立即用于检测或短期保存于20℃。注：也可使用其他经验证的DNA提取方法或等效的商品化细菌DNA提取试剂盒，按照其使用说明操作。8.2DNA浓度和纯度的测定
取5μLDNA溶液加双蒸水稀释至1mL，使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计分别检测260nm和280nm处的吸光值A26和Az80。DNA的浓度按式（1)计算：=AXNX50/1000
式中：
-DNA浓度，单位为微克每毫升（μg/mL.)；A
-260nm处的吸光值：
SN/T4525.4—2016
N—核酸稀释倍数。
当A280/A28比值在1.7~1.9之间时，适宜于PCR扩增，8.3MLST基因选择
按表A.1所示，选择霍乱孤菌的7个管家基因进行MLST分析。8.4PCR扩增引物和测序引物的选择按表A,2中的序列，合成霍乱弧菌7个管家基因对应的7对PCR扩增引物（测序引物）。引物在使用前按照相应分了量进行稀释到10μmol/L，一20C保存备用。8.5目的基因片段的PCR扩增
反应体系体积为50uL：10×
PCR缓冲液5uLdNTP(10mmol/L)2μL、引物对（10μmol/L）2uL、TagDNA聚台酶（5U/uL)0.4μL模板DNA5水33.6
反应条件为：94℃5min：94℃1min，55℃1min，72℃30s.35个循环；72℃7min将PCR产物进行2%琼脂糖凝胶电泳，染色后紫外光下成像观察，条带单一且明亮的样品进行PCR产物纯化与DNA序列测定。
8.6DNA序列测定
将PCR产物纯化后，采用表A.2中的测序引物对管家基因的DNA序列进行双向测序。8.7结果报告
将所得到的霍乱弧菌7个管家基因测序结果使用Lasergene7.1对序列进行CluxtalV儿个碱基不计算人序列测定结果，GenBank中的已有的相关基因进行BLAST，然后分析，将上下游序列整合后得到完整序列，为减小误差首尾的测序结果上传至ML.ST网站（http：//mlst.net）进行在最后将
线数据分析，得到的结果与MLST数据库进行比对。在确定序列型的基础上应用eBURST或其他软系统遗传进化（参见附录B）
件将菌株分为各个谱系组，构建9生物安全措施和防污染措施
9.1生物安全措施
为了保护实验室人员的安全，应由具备资格的工作人员检测霍乱弧菌，所有培养物和废弃物应按照GB19489中的有关规定执行
9.2防污染措施
防止污染措施应符合GB/T27403的规定。4
基因名称
基因名称
adk(Forward)
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附录A
（规范性附录）
霍乱弧菌多位点序列分型的管家基因及引物序列表A.1、霍乱弧菌管家基因
片段大小
gyrB(Forward)
gyrB(Reverse)
metE(Forward)
metE(Reverse)
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mdh(Reverse)
pntA(Forward)
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purM(Forward)
purM(Reverse)
pyrC(Forward)
PyrC(Reverse)
管家基因名称
SN/T4525.4--2016
nylatekinase)
肌激酶（ade
DNA旋转酶Ⅲ3亚单位基因（DNAgyrase,subunitB)蛋氨酸合成酶（m
ethionine synthase)
苹果酸酶（matatedehydrogenase）陡核苷酸转氢酶（pyridinenucleotidetranshydrogenase)磷酸核糖基甲酰甘氨酸胺环连接酶osphoribosyl-formylglyeinamidecyclo-ligase冬氨酸脱水酶基因（Dithydroorotase）大
霍乱管家基因的扩增（测序）引物序列和引物序列引物序列（5°→3）
CATCATTCTTCTCGGTGCTC
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GGTGTCGATATTGATGCAGG
GGAATGTTTTCCCAGAAGCC
ATCATGCCTAACACGGTTCC
TTCAAACACTTCGGCATA
SN/T4525.4—2016
附录B
（资料性附录）
系统遗传进化树的构建
将所得到的霍乱弧菌7个管家基因核酸扩增片段L)NA序列行MLST分析，获得菌株所对应的等位基因图谱，确定需乱弧菌分离株的序列型（ST）。在确定ST的基础上应用cBURST程序或其他相关软件将菌株分析，构建系统遗传进化树：图B.1为部分霍乱弧菌进行MI.ST分析后，绘制的eBURST分析结果图。
53300249
：283
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图B.1部分霍乱弧菌eBURST分析结果图260
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