SN/T 4525.7-2016 出口食品中致病菌的分子分型MLST方法 第7部分：空肠弯曲菌 SN/T4525.7-2016 标准压缩包解压密码：www.bzxz.net

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 4525.7--2016
出口食品中致病菌的分子分型
MLST方法第7部分：空肠弯曲菌
Multilocus sequence typing detection method for pathogens in export food-Part7:Campylobacterjejuni
2016-06-28发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2017-02-01实施
SN/T4525《出口食品中致病菌的分子分型第1部分：沙门氏菌；
第2部分：金黄色葡萄球菌；
第3部分：副溶血性弧菌；
第4部分：霍乱弧菌；
第5部分：克罗诺杆菌：
第6部分：化链球菌；
第7部分：空肠弯曲菌；www.bzxz.net
第8部分：致泻性大肠埃希氏菌；第9部分：单核细胞增生李斯特氏菌：第10部分：小肠结肠炎耶尔森氏菌。本部分为SN/T4525的第7部分。
M1.ST方法共分10个部分：
本部分按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。SN/T4525.7--2016
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位：中华人民共和国江苏出人境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院、中国食品安全风险评估中心，中华人民共和国深圳出人境检验检疫局、上海交通大学。本部分土要起草人：蒋原、薛峰、陈颖、袁芳、郭云吕、王娉、曾德新、蒋鲁岩、封振、吕敬章、施春雷、史贤明。
1范围
出口食品中致病菌的分子分型
MLST方法第7部分：空肠弯曲菌
SN/T4525.7--2016
SN/T4525的本部分规定了出口食品中空肠弯曲菌分子分型ML.ST检测方法。本部分适用于出口食品中空肠弯曲菌的2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包托所有的修改单）适用于本文件。GB4789.9食品安全国家标准食品微生物学检验空肠弯曲菌检验GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB19489实验室生物安全通用要求GB/T27403实验室质量控制规范食品分了生物学检测3术语和定义、缩略语
术语和定义
下列术语和定义适用于本文件
管家基因house-keepinggenes
所有细胞中均要表达的一类基因，其产物是对维持细胞基本生命活动所必需的，其基因序列高度保守并且在大多数情况下持续表达。义称看家基因·持家基因。
Taq DNA 酶 Thermus aquaticus DNA polymerase从Thermusaquaticus细菌中提取的耐热DNA聚合酶3.2缩略语
下列缩略语适用于本文件。
dNTP：脱氧核糖核苷兰磷酸（deoxy-ribonucleosidetriphosphate）EDTA：乙二胺四乙酸（EthyleneDiamineTetraaceticAcid)MLST：多位点序列分型（multilocussequencetyping）ST：序列型（SequenceType）
Tris三（羟甲基）氨基甲烷[(ris（hydroxymethyl)aminomethane」4原理
MLST是通过测定多个管家基因中长度约为470bp核心片段的核昔酸序列，对其组合进行索引编SN/T4525.7—2016
号，不同的菌株对应不同的序列型，从而揭示菌株间等位基因的多样性。MLST分型中多个管家基因的序列分析比较在实验过程的操作性与结果的可靠性之间取得了平衡，且结果准确，所得数据在不同的实验空间具有良好的可比性
5试剂和材料
除有特殊说明外，所有实验用试剂均为分析纯或生化试剂；实验用水符合GB/T6682中一级水的要求。所有试剂均用无DNA酶污染的容器分装5.1DNA提取试剂:细菌基因组DNA提取试剂盒。5.2TqDNA酶
5.3dNTP.dATP.dTTP.dCTP.dGTP。5.4引物：扩增引物和测序引物序列见表A.25.5
10XPCR缓冲液：200mmol/LTris-HCl(pH8.4），200mmol/L氯化钾，15mmol/L氯化镁。5.6琼脂糖凝胶
Gelred核酸染色剂。
5.86X溴酚蓝上样缓冲液。
5.9分子量标记：100bpDNAmarker。5.105×TBE电泳缓冲液：445mmol/LTris，445mmol/L硼酸.10mmol/LEDTA（pH8.0）使用时稀释为0.5XTBE电泳缓冲液。
质控菌株：空肠弯曲菌Campylobacterjejunisubsp.jcjuniNCTC11168或等效菌株5.11
仪器和设备
6.1离心机。
6.2犬平：量程2kg感量0.1g，
6.3pH计。
6.4涡旋振荡器。
6.5PCR仪。
6.6电泳仪。
6.7凝胶成像仪，
基因测序仪。
超净工作台。
移液器：0.1uL~2.5μl、2ml20l20μ200μl100μ1000uL7检测程序
根据空肠弯曲菌的7个管家基因，设计PCR引物和测序引物序列（见附录A），通过目的基因片段的PCR扩增.再进行PCR产物的纯化和DNA序列测定，将所得到的空肠弯曲菌7个管家基因测序结果与GenBank中的已有的相关基因进行BLAST，将上下游序列整合后得到完整序列，为减小误差首尾的几个碱基不计算人序列测定结果。最后将测序结果上传至MLST网站（http：//mlst.net）进行在线数据分析，得到的结果与MLST数据库进行比对。获得菌株所对应的等位基因图谱，确定空肠弯曲菌分离株的序列型（SequenceType，ST），并与PubMLST数据库中菌株的资料进行比较。在确定STs的基础上应用BURST程序将菌株分为各个谱系组（clonalcomplex），构建系统遗传进化树（参见2
附录B)。
MLST分子分型操作程序见图1。
操作步骤
细菌基因组DNA提取
提取细菌基因纽DNA
MLST管家基因选择
PCR引物和测序引物的选择
日的基因片段的PCR扩增
PCR产物的纯化和DNA序列测定
日的基因的DNA序列分析
数据分析
多位点序列分型（MLST)操作步骤将经过GB4789.9的方法进行鉴定为空肠弯曲菌的菌株提取基因组DNA。8.2MLST基因选择
按表A.1所示，选择空肠弯曲菌的7个管家基因进行MLST分析。8.3PCR扩增引物和测序引物的选择SN/T4525.7-2016
按表A.2中的序列，合成空肠弯曲菌7个管家基因对应的7对PCR扩增引物和7对测序引物。引物在使用前按照相应分子量进行稀释到10μmol/L，一20℃保存备用。8.4目的基因片段的PCR扩增
采用50μLPCR反应体系。gltA、aspA、pgm和uncA基因的反应条件为：91℃4min；94℃1min，50℃1min,72℃1min，3C个循环，72℃10min。3
SN/T4525.7—2016
glnA和glyA基因的反应条件为：94℃4min：94℃1min.52℃1min，72℃1min，30个循环；72℃10min
tkt基因的反应条件为：04℃4min；941min.58℃1min，72℃1min.30个循环：72℃10ming
将PCR产物进行1必琼脂糖凝胶电泳，EB染色后紫外光下成像观察，条带单一且明亮的样品进行PCR产物纯化与DNA序列测定。
8.5DNA序列测定
采用表A,2中的测序引物对管家基因的DNA序列进行双向测序。8.6结果报告
将所得到的空肠弯曲菌7个管家基因测序结果与GenBank中的已有的相关基因进行BLAST，然后使用Lascrgene7.I对序列进行ClistalV分析，将上下游序列整合后得到完整序列，为减小误差首尾的几个碱基不计算人序列测定结果。最后将测序结果上传至MLST网站（http：//wwW.mlst.ne1)进行在线数据分析，得到的结果与MLST数据库进行比对。9
生物安全措施和防污染措施
9.1生物安全措施
为了保护实验室人员的安全，应山具备照GB19489中的有关规定执行。
9.2防污染措施
防止污染措施应符合GB/T27403的规定。空肠弯曲菌，所有培养物和废弃物应按基因
扩增引物
测序引物
附录A
（规范性附录）
空肠弯曲菌多位点序列分型的管家基因及引物序列表A.1
空肠弯曲菌管家基因
MLST基因位
96692-97168
658085-657609
1604930-1604529
327773 328252
1569415-156
SN/T4525.7—2016
管家基国名称
Espatasc
glutarnine synthetast
citrate synthase
rine hydroxymethyl transferasephospho glucomutase
transketolase
ATP synthasealpha subunit
空肠弯曲菌管家基因的扩增引物序列和测序引物序列表A.2
引物名称
AAl Forwar
glyAAI(Foru
glyAA2CRey
rward)
tkt A6 (Reverse)
pgm A7 (Forward)
pgm A8 (Reverse)
uncA A7 (Forward)
uncA A8 (Reverse)
aspA S3 (Forward)
aspA S6 (Reverse)
glnA SS (Forward)
glnA S6 (Reverse)
ghtA S3 (Forward)
序列（5°-3)
AGTACTAATGATGCTTATCC
TTCATCAATTTGTTCTTTGC
AGGAACTTGGCATCATATTACC
TGGACGAGCTTCTACTGGC
TTGACTTCTACAGCTACTTG
AATAAAGTTGTCTTGGACGG
GAGTTAGAGCGTCAATGTGAAGG
AAACCTCTGGCAGTAAGGGC
GCAAACTCAGGACACCCAGG
AAAGCATTGTTAATGGCTGC
TACTAATAATATCTTAGTAGG
CACAACATTTTTCATTTCTTTTTC
ATGGACTTAAGAATATTATGGC
ATAAATTCCATCTTCAAATTCC
CCAACTGCAAGATGCTGTACC
TTCATTTGCGGTAATACCATO
CATGCAATCAATGAAGAAAO
TTCCATAAGCTCATATGAAC
CTTATATTGATGGAGAAAATGG
SN/T4525.7—2016
测序引物
引物名称
表A.2（续）
gltA Ss (Reverse)
glyA S5 (Forward)
glyA S4 (Reverse)
tkt S5 (Forward)
tkt S2 (Reverse)
pgmS5(Forwrd)
pgm S6 (Reverse)
uncAS3(Forward)
uncA SA (Reverse)
序列（5→3°）
CCAAAGCGCACCAATACCTG
GCTAATCAAGGTGTTTATAT
AGGTGATTATCCGTTCCATCGC
GGTTTTAGATGTGGCTCATG
TCCAGAATAGCGAAATAAGG
GCTTAGCAGATATTTTAAGTG
AAGCCTGCTTGTTCTTTGGC
AAAGTACAGTGGCACAAGTGG
TGCCTCATCTAAATCACTAGC
附录B
（资料性附录）
系统遗传进化树的构建
SN/T4525.7—2016
将所得到的空肠弯曲菌7个管家基因核酸扩增片段DNA序列进行MLST分析，获得菌株所对应的等位基因图谱，确定空肠弯曲菌分离株的序列型（SequenceType，ST），并与PubMLST数据库中国际菌株的资料进行比较。在确定STs的基础上应用e-BURST程序将菌株分为各个谱系组（clonalcomplex），构建系统遗传进化树，见图B.1。NEW2
ST20446
ST1936Q
ST4740
ST489O
ST1811中
ST761OST5770
ST1359
ST2845
ST86STJRS
ST2282
ST386NEW150
ST2929
ST1654
/ST1919NEW170
ST2266
ST3811
ST600m
ST1790
ST16926
NEW240
NEW2QST3378OA
ST2123-ST420
AST295
nST45A
ST3446ST210925
ST3652
图B.1部分空肠弯曲菌系统遗传进化树图ST490
ST802★
ST2804
Chicken source
ADuckso
Goosesource
☆Monkey source
Pigsource
ooxsource
Humansourco
Red-croened Crane surce
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