SN/T 4419.17-2016
基本信息
标准号： SN/T 4419.17-2016
中文名称：出口食品常见过敏原LAMP系统检测方法 第17部分：荞麦
标准类别：商检行业标准(SN)
标准状态：现行
出版语种：简体中文
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相关标签： 出口 食品 常见 过敏原 系统 检测 方法 荞麦
标准分类号
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标准简介
SN/T 4419.17-2016 出口食品常见过敏原LAMP系统检测方法 第17部分：荞麦
SN/T4419.17-2016
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标准内容
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T4419.17—2016
出口食品常见过敏原LAMIP系列检测方法第17部分：荞麦
Food allergen detection with LAMP methods for export-Part17.Buckwheat
2016-03-09发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
费真伪
2016-10-01实施
SN/T-4419《出口食品常见过敏原LAMP系列检测方法》由下列部分组成：第1部分：开心果；
第2部分：腰果；
第3部分：胡桃：
第4部分：榛果：
第5部分：杏仁：
第6部分：扁桃仁；
第7部分：巴西坚果：
第8部分：澳洲坚果；
第9部分：栗子；
第10部分：大豆；
第11部分：羽扇豆；
第12部分：花生；
第13部分：葵花籽；
第14部分：芝麻；
第15部分：大麦；
第16部分：小麦；
第17部分：荞麦；
第18部分：芥末；
第19部分：胡萝卜；
第20部分：芹菜；
第21部分：牛奶；
第22部分：虾。
本部分为SN/T4419的第17部分。本部分按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。SN/T4419.17—2016
请注意本文件的某些内容可能涉及专利本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国山东出入境检验检疫局。本部分主要起草人：龚方、高宏伟、孙敏、张舒亚、刘彩霞、陈颖、韩建勋、黄文胜、吴亚君、邓婷婷。1
1范围
SN/T 4419.17—2016
出口食品常见过敏原LAMP系列检测方法第17部分：荞麦
SN/T4419的本部分规定了出口食品中过敏原芥麦成分的环介导等温扩增（LAMP)检测方法本部分适用于食品及其原料中过敏原养麦成分的定性检测。本部分所规定方法的最低检测限（1.OD）为0.5%（质量分数）2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T274032008实验室质量控制规范食品分子生物学检测SN/T1961.18-2013出口
食品过敏原成分检测第18部分：实时荧光PCR方法检测养麦成分3术语、定义和缩略语
3.1术语和定义
下列术语和定义适用于本文件
过敏原
allergen
又称致敏原或变应原，是指能够引起变态反应的抗原3.1.2
荞麦buckwheat
学名：Fugopyrumesculentum，别名净肠草，蓼科荞麦属植物，粮食作物，其中甜荞（F.esculentum）和苦养（F.tataricum）是两种主要的栽培种。2缩略语
下列缩略语适用于本文件。
dNTP：脱氧核糖核苷三磷酸（deoxyribonucleosidetriphosphate）LAMP：环介导等温扩增（loopmediatedisothermalamplification）TrilanX-100:聚乙二醇辛基苯基醚4防污染措施
环介导等温扩增检测过程的防污染措施应符合GB/T27403—2008中附录D的规定。SN/T 4419.17-—2016
5方法提要
样品经研磨后，提取DNA，以DNA为模板，采用荞友过敏原蛋白基因特异性检测引物进行LA.MP扩增，通过颜色变化观察判定是否存在荞麦成分。5LAMP检测方法
6.1原理
根据养麦过敏原蛋白基因序列设计内引物、外引物各·对，特兄性识别靶序列上的6个独立区域在链置换型DNA聚合酶的作用下，内引物与模板DNA退火、延伸，并利用外引物与模板DNA的退火、延伸，并利用外引物与模板DNA的退火延伸置换出内引物合成链。山于内引物与相邻区域存在互补区，游离的内引物合成链折叠成基-环结构，以自身为模板，启动链置换扩增循环，合成长度不一的大量茎-环结构DVA。加入显色液，即可通过反应液的颜色变化观察判定结果。DNA聚合反应析出的焦磷酸根离子与溶液中的Mg+结合，形成焦磷酸镁乳白色沉淀，故也可通过反应液的浊度变化观察判定结果。
显色液显色原理：SYBRGreenT是一种结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的具有绿色荧光的染料。在游离状态下，SYBRGreen「发出微弱的荧光，但一Ⅱ与dsDNA结合后，荧光大大增强。因此，SYBRGreen1荧光的强度与dsDNA的量正相关，可以根据LAMP反应液的荧光强度测定反应体系中的dsDNA的量。
6.2仪器和设备
超纯水发生器(分子生物学级别）。6.2.2水浴锅或加热模板：65℃土1℃和80℃土1℃。6.2.3
离心管：0.lmL，1.5ml.c
6.2.4计时器。
移液枪：量程0.5μL~10mL量程10μ100m、量程100l~1000μ6.3
试剂和材料
除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂。6.3.1实验用水：应符合GB/T6682中一级水的规格。6.3.2
CTAB提取缓冲液（20g/LCTAB.1.4mol/LNaCl,0.1mol/L.Tris-HCl,0.02mol/INa,EDTA.pH 8.0)。
6.3.3CTAB沉淀液(5g/LCTAB.40mmol/LNaCl)6.3.4NaCl溶液：1.2mmol/L。
蛋白酶K（20mg/mL）
dNTPs溶液：每种脱氧核糖核苷酸浓度10mmol/L6.3.6
BstDNA聚合酶：酶浓度8U/μL。6.3.8
10×ThermolPol缓冲液：含200mmol/LTris-HCl(plI8.8），100mmol/L硫酸铵、100mmol/L氯化钾、20mmol/L硫酸镁、1%TritonX-100。6.3.9
硫酸镁溶液：50mmol/L。
6.3.10甜菜碱溶液：5mol/L。
显色液：SYBRGreenI荧光染料，l000X。SN/T4419.17—2016
6.3.12引物：根据荞麦过敏原白基因设计一套特异性引物，包括外引物F3/B3，内引物FIP/BIP，见表1。
表1引物序列
LAMP引物序列
6.4DNA提取
外侧上游引物（F3）
外侧下游引物（B3）
内侧上游引物（FIP)
内侧下游引物（BIP)
5'-ATCCTCGGACCGAGATGG-3
5'-AGTCCTTCTCTTCCTGCCT-3
5-CTCCGACAACCTGGACTCTTCCAACTTGAACGCGCACAGC-35-AGTGTGTTCGACGACAACGTGCTCAACACCACTGCGAATCC-3*6.4.1
称取100mg已制备好的样品至1.5mL离心管中，加人1mLCTAB提取缓冲液和10μL蛋白酶K，65℃1h.期间每隔10min振荡混勾。6.4.212000g离心10min，吸取上清液700uL至一新1.5ml离心管中。6.4.3
加人490μL氯仿，振荡混合后，12000g离心10min。吸取500μL上清液至一新1.5mL管中。加人2倍体积CTAB沉淀液，混勾后室温静置60min，12000g离心10min。弃去上清液，加人350μL1.2mmol/LNaCl溶液充分溶解沉淀。加入350μL氯仿，高速漩涡振荡混匀，12000g离心10min。吸取上清液至一新1.5mL管中，加人0.8倍体积兄丙醇，混勾，一20℃静置20min，12000g离心10 min。
弃去上清液，用70%乙醇洗涤沉淀一次，12000g离心10min。弃去上清液，晾干，加人100μLTE缓冲液，溶解DNA沉淀，一20℃保存备用。6.5
实验步骤
阴性对照、阳性对照和空白对照的设置6.5.1
阴性对照：采用不含有待测基因序列的植物基因组DNA为模板阳性对照：采用含有待测基因序列的植物DNA作为模板或含有目的基因序列的质粒DNA代替DNA模板。
设两个空白对照：
提取DNA时设置的提取空白对照（以水代替样品）；LAMP反应的空白对照（以DNA溶解液代替DNA模板）6.5.2荞麦LAMP反应体系
LAMP反应体系见表2。每个样品各做2个平行管。加样时应使样品DNA溶液完全加人反应液中，不要粘附于管壁上。在反应体系配制完成后，将1μL显色液滴在管盖内侧，盖管盖时应小心，防止显色液混合进入反应液中。
SN/T 4419.17—2016
ThermoPol缓冲液
外侧上游引物（F3)
外侧下游引物（B3)
内侧上游引物（FIP）
内侧下游引物（BIP）
甜菜碱此内容来自标准下载网
硫酸镁
BsDNA聚合酶
DNA模板
LAMP反应参数
表2过敏原荞麦成分LAMP反应体系工作液浓度
5amol/L
5./2mol/1
40μmol/1
40μmol/L.
10mmol/L
10ommol/l
加样量/u
65℃恒温扩增60min，80℃5min使酶灭活反应结
显色反应
反应体系终浓度
0.2umoi/L
0.2umol/L
1.6μmol/t.
1.6 umol/l.
2.0mmol/L.
0.8mmol/l.
G mmol/l.
（包括缓冲液中所含硫酸镁）
0.32U/μL
0.8ng/μL
反应结束后，将显色液与皮应液工下颠倒轻轻混匀，在黑色背景下立即进行额色观察。质量控制
基本原则：实验室中设置的各种对照LAMP检测结果应符合以下情况。否则，任一种对照如果出现非下述正常结果，应重做实验空白对照：反应管中液体呈橙色：阴性对照：反应管中液体橙色：阳性对照：反应管中液体呈绿
7结果判断和确证
7.1待检样品2个平行样反应管中液体均呈橙色，同时各种实验对照结果正常，可判断该样品检测结果为阴性
7.2待检样品2个平行样反应管中液体至少1管呈绿色，同时各种实验对照结果止常，可判断该样品过敏原养表成分初筛阳性，还应通过下列方法之一进行确证：按照SN/T1961.182013实时荧光PCR检测；可对PCR扩增产物进行序列测定，参照附录A中序列比对：其他验证方法。
结果表述
SN/T 4419.17—2016
对LA.MP检测结果为阴性的样品，可表述为该样品未检出过敏原养麦成分。对I.AMP检测结果为初筛阳性的样品，应按照确证实验情况进行结果判断和表述SN/T 4419.17—2016
附录A
（资料性附录）
扩增产物参考序列
ATCCTCGGACCGAGATGGAACTTGAACGCGCACAGCGCACTGTACGTGACGAGAGGAGAAGGAAGAGTCCAGGTTGTCGGAGATGAAGGAAGAAGTGTGTTCGACGACAACGTGCAGCGAGGACAGATCCTTGTGGTCCCACAGGGATTCGCAGTGGTGTTGAAGGCAGGAAGAGAAGGACT
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出口食品常见过敏原LAMIP系列检测方法第17部分：荞麦
Food allergen detection with LAMP methods for export-Part17.Buckwheat
2016-03-09发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
费真伪
2016-10-01实施
SN/T-4419《出口食品常见过敏原LAMP系列检测方法》由下列部分组成：第1部分：开心果；
第2部分：腰果；
第3部分：胡桃：
第4部分：榛果：
第5部分：杏仁：
第6部分：扁桃仁；
第7部分：巴西坚果：
第8部分：澳洲坚果；
第9部分：栗子；
第10部分：大豆；
第11部分：羽扇豆；
第12部分：花生；
第13部分：葵花籽；
第14部分：芝麻；
第15部分：大麦；
第16部分：小麦；
第17部分：荞麦；
第18部分：芥末；
第19部分：胡萝卜；
第20部分：芹菜；
第21部分：牛奶；
第22部分：虾。
本部分为SN/T4419的第17部分。本部分按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。SN/T4419.17—2016
请注意本文件的某些内容可能涉及专利本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国山东出入境检验检疫局。本部分主要起草人：龚方、高宏伟、孙敏、张舒亚、刘彩霞、陈颖、韩建勋、黄文胜、吴亚君、邓婷婷。1
1范围
SN/T 4419.17—2016
出口食品常见过敏原LAMP系列检测方法第17部分：荞麦
SN/T4419的本部分规定了出口食品中过敏原芥麦成分的环介导等温扩增（LAMP)检测方法本部分适用于食品及其原料中过敏原养麦成分的定性检测。本部分所规定方法的最低检测限（1.OD）为0.5%（质量分数）2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T274032008实验室质量控制规范食品分子生物学检测SN/T1961.18-2013出口
食品过敏原成分检测第18部分：实时荧光PCR方法检测养麦成分3术语、定义和缩略语
3.1术语和定义
下列术语和定义适用于本文件
过敏原
allergen
又称致敏原或变应原，是指能够引起变态反应的抗原3.1.2
荞麦buckwheat
学名：Fugopyrumesculentum，别名净肠草，蓼科荞麦属植物，粮食作物，其中甜荞（F.esculentum）和苦养（F.tataricum）是两种主要的栽培种。2缩略语
下列缩略语适用于本文件。
dNTP：脱氧核糖核苷三磷酸（deoxyribonucleosidetriphosphate）LAMP：环介导等温扩增（loopmediatedisothermalamplification）TrilanX-100:聚乙二醇辛基苯基醚4防污染措施
环介导等温扩增检测过程的防污染措施应符合GB/T27403—2008中附录D的规定。SN/T 4419.17-—2016
5方法提要
样品经研磨后，提取DNA，以DNA为模板，采用荞友过敏原蛋白基因特异性检测引物进行LA.MP扩增，通过颜色变化观察判定是否存在荞麦成分。5LAMP检测方法
6.1原理
根据养麦过敏原蛋白基因序列设计内引物、外引物各·对，特兄性识别靶序列上的6个独立区域在链置换型DNA聚合酶的作用下，内引物与模板DNA退火、延伸，并利用外引物与模板DNA的退火、延伸，并利用外引物与模板DNA的退火延伸置换出内引物合成链。山于内引物与相邻区域存在互补区，游离的内引物合成链折叠成基-环结构，以自身为模板，启动链置换扩增循环，合成长度不一的大量茎-环结构DVA。加入显色液，即可通过反应液的颜色变化观察判定结果。DNA聚合反应析出的焦磷酸根离子与溶液中的Mg+结合，形成焦磷酸镁乳白色沉淀，故也可通过反应液的浊度变化观察判定结果。
显色液显色原理：SYBRGreenT是一种结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的具有绿色荧光的染料。在游离状态下，SYBRGreen「发出微弱的荧光，但一Ⅱ与dsDNA结合后，荧光大大增强。因此，SYBRGreen1荧光的强度与dsDNA的量正相关，可以根据LAMP反应液的荧光强度测定反应体系中的dsDNA的量。
6.2仪器和设备
超纯水发生器(分子生物学级别）。6.2.2水浴锅或加热模板：65℃土1℃和80℃土1℃。6.2.3
离心管：0.lmL，1.5ml.c
6.2.4计时器。
移液枪：量程0.5μL~10mL量程10μ100m、量程100l~1000μ6.3
试剂和材料
除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂。6.3.1实验用水：应符合GB/T6682中一级水的规格。6.3.2
CTAB提取缓冲液（20g/LCTAB.1.4mol/LNaCl,0.1mol/L.Tris-HCl,0.02mol/INa,EDTA.pH 8.0)。
6.3.3CTAB沉淀液(5g/LCTAB.40mmol/LNaCl)6.3.4NaCl溶液：1.2mmol/L。
蛋白酶K（20mg/mL）
dNTPs溶液：每种脱氧核糖核苷酸浓度10mmol/L6.3.6
BstDNA聚合酶：酶浓度8U/μL。6.3.8
10×ThermolPol缓冲液：含200mmol/LTris-HCl(plI8.8），100mmol/L硫酸铵、100mmol/L氯化钾、20mmol/L硫酸镁、1%TritonX-100。6.3.9
硫酸镁溶液：50mmol/L。
6.3.10甜菜碱溶液：5mol/L。
显色液：SYBRGreenI荧光染料，l000X。SN/T4419.17—2016
6.3.12引物：根据荞麦过敏原白基因设计一套特异性引物，包括外引物F3/B3，内引物FIP/BIP，见表1。
表1引物序列
LAMP引物序列
6.4DNA提取
外侧上游引物（F3）
外侧下游引物（B3）
内侧上游引物（FIP)
内侧下游引物（BIP)
5'-ATCCTCGGACCGAGATGG-3
5'-AGTCCTTCTCTTCCTGCCT-3
5-CTCCGACAACCTGGACTCTTCCAACTTGAACGCGCACAGC-35-AGTGTGTTCGACGACAACGTGCTCAACACCACTGCGAATCC-3*6.4.1
称取100mg已制备好的样品至1.5mL离心管中，加人1mLCTAB提取缓冲液和10μL蛋白酶K，65℃1h.期间每隔10min振荡混勾。6.4.212000g离心10min，吸取上清液700uL至一新1.5ml离心管中。6.4.3
加人490μL氯仿，振荡混合后，12000g离心10min。吸取500μL上清液至一新1.5mL管中。加人2倍体积CTAB沉淀液，混勾后室温静置60min，12000g离心10min。弃去上清液，加人350μL1.2mmol/LNaCl溶液充分溶解沉淀。加入350μL氯仿，高速漩涡振荡混匀，12000g离心10min。吸取上清液至一新1.5mL管中，加人0.8倍体积兄丙醇，混勾，一20℃静置20min，12000g离心10 min。
弃去上清液，用70%乙醇洗涤沉淀一次，12000g离心10min。弃去上清液，晾干，加人100μLTE缓冲液，溶解DNA沉淀，一20℃保存备用。6.5
实验步骤
阴性对照、阳性对照和空白对照的设置6.5.1
阴性对照：采用不含有待测基因序列的植物基因组DNA为模板阳性对照：采用含有待测基因序列的植物DNA作为模板或含有目的基因序列的质粒DNA代替DNA模板。
设两个空白对照：
提取DNA时设置的提取空白对照（以水代替样品）；LAMP反应的空白对照（以DNA溶解液代替DNA模板）6.5.2荞麦LAMP反应体系
LAMP反应体系见表2。每个样品各做2个平行管。加样时应使样品DNA溶液完全加人反应液中，不要粘附于管壁上。在反应体系配制完成后，将1μL显色液滴在管盖内侧，盖管盖时应小心，防止显色液混合进入反应液中。
SN/T 4419.17—2016
ThermoPol缓冲液
外侧上游引物（F3)
外侧下游引物（B3)
内侧上游引物（FIP）
内侧下游引物（BIP）
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硫酸镁
BsDNA聚合酶
DNA模板
LAMP反应参数
表2过敏原荞麦成分LAMP反应体系工作液浓度
5amol/L
5./2mol/1
40μmol/1
40μmol/L.
10mmol/L
10ommol/l
加样量/u
65℃恒温扩增60min，80℃5min使酶灭活反应结
显色反应
反应体系终浓度
0.2umoi/L
0.2umol/L
1.6μmol/t.
1.6 umol/l.
2.0mmol/L.
0.8mmol/l.
G mmol/l.
（包括缓冲液中所含硫酸镁）
0.32U/μL
0.8ng/μL
反应结束后，将显色液与皮应液工下颠倒轻轻混匀，在黑色背景下立即进行额色观察。质量控制
基本原则：实验室中设置的各种对照LAMP检测结果应符合以下情况。否则，任一种对照如果出现非下述正常结果，应重做实验空白对照：反应管中液体呈橙色：阴性对照：反应管中液体橙色：阳性对照：反应管中液体呈绿
7结果判断和确证
7.1待检样品2个平行样反应管中液体均呈橙色，同时各种实验对照结果正常，可判断该样品检测结果为阴性
7.2待检样品2个平行样反应管中液体至少1管呈绿色，同时各种实验对照结果止常，可判断该样品过敏原养表成分初筛阳性，还应通过下列方法之一进行确证：按照SN/T1961.182013实时荧光PCR检测；可对PCR扩增产物进行序列测定，参照附录A中序列比对：其他验证方法。
结果表述
SN/T 4419.17—2016
对LA.MP检测结果为阴性的样品，可表述为该样品未检出过敏原养麦成分。对I.AMP检测结果为初筛阳性的样品，应按照确证实验情况进行结果判断和表述SN/T 4419.17—2016
附录A
（资料性附录）
扩增产物参考序列
ATCCTCGGACCGAGATGGAACTTGAACGCGCACAGCGCACTGTACGTGACGAGAGGAGAAGGAAGAGTCCAGGTTGTCGGAGATGAAGGAAGAAGTGTGTTCGACGACAACGTGCAGCGAGGACAGATCCTTGTGGTCCCACAGGGATTCGCAGTGGTGTTGAAGGCAGGAAGAGAAGGACT
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