SN/T 4525.5-2016
基本信息
标准号： SN/T 4525.5-2016
中文名称：出口食品中致病菌的分子分型MLST方法 第5部分：克罗诺杆菌
标准类别：商检行业标准(SN)
标准状态：现行
出版语种：简体中文
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标准分类号
关联标准
出版信息
相关单位信息
标准简介
SN/T 4525.5-2016 出口食品中致病菌的分子分型MLST方法 第5部分：克罗诺杆菌
SN/T4525.5-2016
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标准内容
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T4525.5—2016
出口食品中致病菌的分子分型
MILST方法
第5部分：克罗诺杆菌
Multilocus sequence typing detection method for pathogens in export food-Part5:Cronobacterspp.
2016-06-28发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2017-02-01实施
SN/T4525《出口食品中致病菌的分子分型第1部分：沙门氏菌；
第2部分：金黄色前萄球菌；
第3部分：副溶血性弧菌；
第4部分：霍乱弧菌；
第5部分：克罗诺杆菌：
第6部分：化脓链球菌；
第7部分：空肠弯曲菌；
第8部分：致泻性大肠埃希氏菌；第9部分：单核细胞增生李斯特氏菌：第10部分：小肠结肠炎耶尔森氏菌。本部分为SN/T4525的第5部分。
MLST方法》共分10个部分：
本部分按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。SN/T4525.5—2016
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国江苏出入境检验检疫局、中华人民共和国南京出入境检验检疫局。
本部分主要起草人：王、陈颖、赵晓燕、将原、薛峰、赵晓美1范围
SN/T4525.5—2016
出口食品中致病菌的分子分型
MLST方法
第5部分：克罗诺杆菌
SN/T4525的本部分规定了出口食品中克罗诺杆菌的分子分型MLST检测方法。本部分适用于出口食品中克罗诺杆菌的分子分型检测2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB4789.402010食品安全国家标准食品微生物学检验阪崎肠杆菌检验GB/T6682分析实验室用水规格和实验方法GB19489实验室生物安全通用要求GB/T27403实验室质量控制规范食品分子生物学检测3术语和定义、缩略语
术语和定义
下列术语和定义适用于本文
管家基因house-keeping genes
所有细胞中均要表达的
一类基因
其产物是对维持细胞基本生命活动所必需的，其基因序列高度保守并且在大多数情况下持续表达。又称看家基因，持家基因3.1.2
Thermus aquaticusDNA polymeraseTagDNA酶
从Thermusaquaticus细菌中提取的耐热DNA聚合配3.2缩略语
下列缩略语适用于本文件
dNTP：脱氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleosidetriphosphate）EDTA：乙二胺四乙酸（EthyleneDiamineTetraaceticAcid)MLST：多位点序列分型（multilocussequencetyping）ST：序列型（SequenceType）
Tris：三（羟甲基）氨基甲烷[tris(hydroxymethyl)aminomethane4原理
MLST是通过测定多个管家基因中长度约为470bp核心片段的核苷酸序列，对其组合进行索引编SN/T4525.5—2016
号，不同的菌株对应不同的序列型：从而揭示菌株间等位基因的多样性。MLST分型中多个管家基因的序列分析比较在实验过程的操作性与结果的可靠性之间取得了平衡，且结果准确，所得数据在不同的实验空间具有良好的可比性，
5试剂和材料
除有特殊说明外，所有实验用试剂均为分析纯或生化试剂：实验用水符合GB/T6682中一级水的要求，所有试剂均用无INA酶污染的容器分装。5.1ExTaqDNA聚合海。
5.2dNTP.dATP.dTTP,dCTP,dGTP。5.3DNA提取试剂:DNA提取试剂盒。5.410XErTaqBuffer(20mmol/l.MgClz)。5.5琼脂糖。
TAE缓冲液：2mol/LTrisHCl(pH8.4)，1mol/L乙酸，100mol/LEDTA。5.7
参考菌株：克罗诺杆菌ATCC29544。仪器和设备
PCR扩增仪。
离心机。
6.3核酸蛋白分析仪。
6.4电泳仪。
分子凝胶成像仪
微量移液器和灭菌吸头：10μL、100ul、200uL、1000μL。恒温培养箱。
恒温水浴锅。
6.9天平。
灭菌角烧瓶：500ml250mL。
灭菌平Ⅲ：90mm×15mm。
灭菌试管：内径3mm，长5cm。
检测程序
对克罗诺杆菌7对管家基因alpD、fusA、glnS、gltB、gyrB、infB、pps分别设计引物，并进行PCR扩增（引物序列见表A.2），对扩增结果阳性的样品进行克隆测序，将所得到的克罗诺杆菌7对管家基因测序结果上下游序列整合后得到完整序列，将测序结果上传至MLST网站（http：//mlst.net）进行在线数据分析，得到的结果与MLST数据库进行比对，获得菌株所对应的等位基因图谱，确定克罗诺杠菌分离株的序列型（SequenceType,ST)，并与PubMLST数据库中菌株的资料进行比较。在确定STs的基础上应用MEGA程序对菌株进行聚类分析（参见附录B)。MLST的操作程序见图1。
8检测步骤
提取细菌基因组DNA
提取细菌基因组DNA
MLST基因选择
PCR引物和测序引物的选择
管家基因片段的PCR扩增
PCR产物的纯化和DNA序列测定
管家基因的DNA序列分析
数据处理
图1MLST操作程序
取经过GB4789.40—2010鉴定为克罗诺杆菌的增菌液，提取基因组DNA。8.2MLST基因选择
SN/T4525.5—2016
选择克罗诺杆菌的7个管家基因作为目的基因进行MILST分析，如表A,1所示，它们分别是ATP合成β链基因（ATPsynthasechain，atpD）、伸长因子G基因（Elongationfactor，fusA）、谷氨酰胺酰基tRNA合成酶基因（Glutaminyl-tRNAsynthetase，glnS）、谷氨酰胺合成酶大亚基基因（GlutamateSynthaselargesubunitgltB）、DNA解旋酶B亚基基因（DNAgyraseB.gyrB）、翻译起始因子IF-2基因（TranslationinitiationfactorIF-2，infB）、磷酸合成酶基因（Phosphoenol-pyruvatesynthase，pps）。8.3PCR引物和测序引物的选择
针对表A.1中克罗诺杆菌7个日的基因.合成7对相应的PCR引物序列（表A.2）。引物在使用前按照相应分子量进行稀释到10umol/L，-20℃保存备用。8.4目的基因片段的PCR扩增
反应体系体积为50μL：10×ETagBuffer5μL、引物对（10μmol/L)各1μL，dNTP(2.5mmol/L）3
SN/T4525.5—2016
2.5uL、ErTagDNA聚合酶（5U/μL)0.5μL、水38μL、模板DNA2ul。反应条件：95℃预变性10min，95℃变性30s，gltB和ginS基因60℃退火45s，atpD、fusA、gyrB、infBpps基因58℃退火45s，72℃延伸1min35个循环，72℃充分延伸10min，4℃保存反应产物。注：PCR反应参数可根据基因扩增仪型号的不同进行适当的调整。检测过程中分别设阳性对照、空白对照。阳性对照为克罗诺杆菌参考菌株ATCC29544的基因组DNA，空白对照为无菌水。
将PCR产物进行2%琼脂糖凝胶电泳，EB染色后紫外光下成像观察，条带单一且明亮的PCR产物进行DNA序列测定。
8.5DNA序列测定
PCR产物的纯化后对目的基因的DNA序列进行双向测序，对于所有基因序列对上下游进行2次双向序列测定。
8.6结果报告
将所得到的克罗诺杆菌7个管家基因测序结果与GenBank中的已有的相关基因进行比对，然后使用Lasergene7.1对序列进行ClustalV分析，将上下游序列整合后得到完整序列，为减小误差首尾的几最后将测序结果上传至MLST网站（http：//mlst.warwick.ac.uk/个碱基不计算人序列测定结果
mlst/)进行在线数据分析，得到的结果与MLST数据库进行比对。9
生物安全措施和防污染措施
生物安全措施
为了保护实验室人员的安
照GB19489中的有关规定执行
9.2防污染措施
具备资格的工作人员检测克罗诺杆菌，所有培养物和废弃物应按由
防止污染措施应符合GB/T27
03的规定
基因名称
附录A
（规范性附录）
克罗诺杆菌多位点序列分型的管家基因及引物序列表A.1
基因名称
克罗诺杆菌管家基因
基因表达产物
Elongation fact
ClutaminyltRNA synthetase
atesynth
rgesubunit
syraseB
ton initiation factor IF-2
hosphoenol-pyruvatesynthase
SN/T4525.5—2016
克罗诺杆菌管家基因的扩增引物序列和测序引物序列引物序列(
CCGACTCCAA
GGCGATGATGT
TGGATGCGGTA
CCATACCAGCG
GTTGTTGGOT
GCGAATACO
ATGATG
CGCCTACA
CACGGAGG
CTCGCGGGTCACTGTAAA
ACGCCGATACCGTCTTTT
TGACCACGGTAAAACCTC
GGACCACGACCTTTATCC
ACCCTGACGAATTCTACG
CAGATCCGGCATGGTATC
PCR产物长度
SN/T4525.5—2016
附录B
（资料性附录）
系统遗传进化树的构建bzxz.net
将所得到的克罗诺杆菌7个管家基因核酸扩增片段DNA序列进行MLST分析，获得菌株所对应的等位基因图谱，确定克罗诺杆菌分离株的序列型（ST）。在确定ST的基础上应用cBURST程序将菌株分为各个谱系组（clonalcomplex），构建系统遗传进化树。图B.1为部分克罗诺杆菌进行MLST分析后绘制的系统遗传进化树图
部分克罗诺杆菌系统遗传进化树图
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出口食品中致病菌的分子分型
MILST方法
第5部分：克罗诺杆菌
Multilocus sequence typing detection method for pathogens in export food-Part5:Cronobacterspp.
2016-06-28发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2017-02-01实施
SN/T4525《出口食品中致病菌的分子分型第1部分：沙门氏菌；
第2部分：金黄色前萄球菌；
第3部分：副溶血性弧菌；
第4部分：霍乱弧菌；
第5部分：克罗诺杆菌：
第6部分：化脓链球菌；
第7部分：空肠弯曲菌；
第8部分：致泻性大肠埃希氏菌；第9部分：单核细胞增生李斯特氏菌：第10部分：小肠结肠炎耶尔森氏菌。本部分为SN/T4525的第5部分。
MLST方法》共分10个部分：
本部分按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。SN/T4525.5—2016
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国江苏出入境检验检疫局、中华人民共和国南京出入境检验检疫局。
本部分主要起草人：王、陈颖、赵晓燕、将原、薛峰、赵晓美1范围
SN/T4525.5—2016
出口食品中致病菌的分子分型
MLST方法
第5部分：克罗诺杆菌
SN/T4525的本部分规定了出口食品中克罗诺杆菌的分子分型MLST检测方法。本部分适用于出口食品中克罗诺杆菌的分子分型检测2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB4789.402010食品安全国家标准食品微生物学检验阪崎肠杆菌检验GB/T6682分析实验室用水规格和实验方法GB19489实验室生物安全通用要求GB/T27403实验室质量控制规范食品分子生物学检测3术语和定义、缩略语
术语和定义
下列术语和定义适用于本文
管家基因house-keeping genes
所有细胞中均要表达的
一类基因
其产物是对维持细胞基本生命活动所必需的，其基因序列高度保守并且在大多数情况下持续表达。又称看家基因，持家基因3.1.2
Thermus aquaticusDNA polymeraseTagDNA酶
从Thermusaquaticus细菌中提取的耐热DNA聚合配3.2缩略语
下列缩略语适用于本文件
dNTP：脱氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleosidetriphosphate）EDTA：乙二胺四乙酸（EthyleneDiamineTetraaceticAcid)MLST：多位点序列分型（multilocussequencetyping）ST：序列型（SequenceType）
Tris：三（羟甲基）氨基甲烷[tris(hydroxymethyl)aminomethane4原理
MLST是通过测定多个管家基因中长度约为470bp核心片段的核苷酸序列，对其组合进行索引编SN/T4525.5—2016
号，不同的菌株对应不同的序列型：从而揭示菌株间等位基因的多样性。MLST分型中多个管家基因的序列分析比较在实验过程的操作性与结果的可靠性之间取得了平衡，且结果准确，所得数据在不同的实验空间具有良好的可比性，
5试剂和材料
除有特殊说明外，所有实验用试剂均为分析纯或生化试剂：实验用水符合GB/T6682中一级水的要求，所有试剂均用无INA酶污染的容器分装。5.1ExTaqDNA聚合海。
5.2dNTP.dATP.dTTP,dCTP,dGTP。5.3DNA提取试剂:DNA提取试剂盒。5.410XErTaqBuffer(20mmol/l.MgClz)。5.5琼脂糖。
TAE缓冲液：2mol/LTrisHCl(pH8.4)，1mol/L乙酸，100mol/LEDTA。5.7
参考菌株：克罗诺杆菌ATCC29544。仪器和设备
PCR扩增仪。
离心机。
6.3核酸蛋白分析仪。
6.4电泳仪。
分子凝胶成像仪
微量移液器和灭菌吸头：10μL、100ul、200uL、1000μL。恒温培养箱。
恒温水浴锅。
6.9天平。
灭菌角烧瓶：500ml250mL。
灭菌平Ⅲ：90mm×15mm。
灭菌试管：内径3mm，长5cm。
检测程序
对克罗诺杆菌7对管家基因alpD、fusA、glnS、gltB、gyrB、infB、pps分别设计引物，并进行PCR扩增（引物序列见表A.2），对扩增结果阳性的样品进行克隆测序，将所得到的克罗诺杆菌7对管家基因测序结果上下游序列整合后得到完整序列，将测序结果上传至MLST网站（http：//mlst.net）进行在线数据分析，得到的结果与MLST数据库进行比对，获得菌株所对应的等位基因图谱，确定克罗诺杠菌分离株的序列型（SequenceType,ST)，并与PubMLST数据库中菌株的资料进行比较。在确定STs的基础上应用MEGA程序对菌株进行聚类分析（参见附录B)。MLST的操作程序见图1。
8检测步骤
提取细菌基因组DNA
提取细菌基因组DNA
MLST基因选择
PCR引物和测序引物的选择
管家基因片段的PCR扩增
PCR产物的纯化和DNA序列测定
管家基因的DNA序列分析
数据处理
图1MLST操作程序
取经过GB4789.40—2010鉴定为克罗诺杆菌的增菌液，提取基因组DNA。8.2MLST基因选择
SN/T4525.5—2016
选择克罗诺杆菌的7个管家基因作为目的基因进行MILST分析，如表A,1所示，它们分别是ATP合成β链基因（ATPsynthasechain，atpD）、伸长因子G基因（Elongationfactor，fusA）、谷氨酰胺酰基tRNA合成酶基因（Glutaminyl-tRNAsynthetase，glnS）、谷氨酰胺合成酶大亚基基因（GlutamateSynthaselargesubunitgltB）、DNA解旋酶B亚基基因（DNAgyraseB.gyrB）、翻译起始因子IF-2基因（TranslationinitiationfactorIF-2，infB）、磷酸合成酶基因（Phosphoenol-pyruvatesynthase，pps）。8.3PCR引物和测序引物的选择
针对表A.1中克罗诺杆菌7个日的基因.合成7对相应的PCR引物序列（表A.2）。引物在使用前按照相应分子量进行稀释到10umol/L，-20℃保存备用。8.4目的基因片段的PCR扩增
反应体系体积为50μL：10×ETagBuffer5μL、引物对（10μmol/L)各1μL，dNTP(2.5mmol/L）3
SN/T4525.5—2016
2.5uL、ErTagDNA聚合酶（5U/μL)0.5μL、水38μL、模板DNA2ul。反应条件：95℃预变性10min，95℃变性30s，gltB和ginS基因60℃退火45s，atpD、fusA、gyrB、infBpps基因58℃退火45s，72℃延伸1min35个循环，72℃充分延伸10min，4℃保存反应产物。注：PCR反应参数可根据基因扩增仪型号的不同进行适当的调整。检测过程中分别设阳性对照、空白对照。阳性对照为克罗诺杆菌参考菌株ATCC29544的基因组DNA，空白对照为无菌水。
将PCR产物进行2%琼脂糖凝胶电泳，EB染色后紫外光下成像观察，条带单一且明亮的PCR产物进行DNA序列测定。
8.5DNA序列测定
PCR产物的纯化后对目的基因的DNA序列进行双向测序，对于所有基因序列对上下游进行2次双向序列测定。
8.6结果报告
将所得到的克罗诺杆菌7个管家基因测序结果与GenBank中的已有的相关基因进行比对，然后使用Lasergene7.1对序列进行ClustalV分析，将上下游序列整合后得到完整序列，为减小误差首尾的几最后将测序结果上传至MLST网站（http：//mlst.warwick.ac.uk/个碱基不计算人序列测定结果
mlst/)进行在线数据分析，得到的结果与MLST数据库进行比对。9
生物安全措施和防污染措施
生物安全措施
为了保护实验室人员的安
照GB19489中的有关规定执行
9.2防污染措施
具备资格的工作人员检测克罗诺杆菌，所有培养物和废弃物应按由
防止污染措施应符合GB/T27
03的规定
基因名称
附录A
（规范性附录）
克罗诺杆菌多位点序列分型的管家基因及引物序列表A.1
基因名称
克罗诺杆菌管家基因
基因表达产物
Elongation fact
ClutaminyltRNA synthetase
atesynth
rgesubunit
syraseB
ton initiation factor IF-2
hosphoenol-pyruvatesynthase
SN/T4525.5—2016
克罗诺杆菌管家基因的扩增引物序列和测序引物序列引物序列(
CCGACTCCAA
GGCGATGATGT
TGGATGCGGTA
CCATACCAGCG
GTTGTTGGOT
GCGAATACO
ATGATG
CGCCTACA
CACGGAGG
CTCGCGGGTCACTGTAAA
ACGCCGATACCGTCTTTT
TGACCACGGTAAAACCTC
GGACCACGACCTTTATCC
ACCCTGACGAATTCTACG
CAGATCCGGCATGGTATC
PCR产物长度
SN/T4525.5—2016
附录B
（资料性附录）
系统遗传进化树的构建bzxz.net
将所得到的克罗诺杆菌7个管家基因核酸扩增片段DNA序列进行MLST分析，获得菌株所对应的等位基因图谱，确定克罗诺杆菌分离株的序列型（ST）。在确定ST的基础上应用cBURST程序将菌株分为各个谱系组（clonalcomplex），构建系统遗传进化树。图B.1为部分克罗诺杆菌进行MLST分析后绘制的系统遗传进化树图
部分克罗诺杆菌系统遗传进化树图
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