SN/T 5133-2019
基本信息
标准号： SN/T 5133-2019
中文名称：枣大球蚧及近似种DNA条形码鉴定方法
标准类别：商检行业标准(SN)
标准状态：现行
出版语种：简体中文
下载格式：.zip .pdf
下载大小：6538089
标准分类号
关联标准
出版信息
相关单位信息
标准简介
标准号：SN/T 5133-2019
标准名称：枣大球蚧及近似种DNA条形码鉴定方法
英文名称：DNa barcoding for Eulecanium gigantea and related species
标准格式：PDF
发布时间：2019-09-03
实施时间：2020-03-01
标准大小：7021K
标准介绍：本标准规定了枣大球蚧及近似种DNA条形码鉴定方法。
本标准适用于枣大球蚧及近似种基因组的提取、DNA条形码序列的扩增、序列核查比对及基于DNA条形码的种类鉴定
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法
3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件
DNA条形码 DNA barcodes
DNA条形码是生物体内一段较短的、标准的、有足够变异的且易扩增的基因片段，在昆虫中，一般是指线粒体CO1基因上5端的一段序列
COI基因 CoI gene
COI基因是线粒体基因组的细胞色素C氧化酶亚基I( Cytochrome c oxidase subunit 1的编码基因，该基因进化速率较快，常用于分析亲缘关系密切的种、亚种及地理种群之间的系统关系
DNA条形码鉴定 DNA barcoding
过对DNA条形码基因片段的扩增和序列比对，进行生物物种的区分和鉴定。
序列相似性 Similarity of the sequence
标准图片预览
标准内容
ICS65.020.01
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T5133—2019
枣大球轿及近似种DNA条形码鉴定方法DNA barcoding for Eulecanium gigantea and related species行业标准信息服务平台
2019-09-03发布
中华人民共和国海关总署
2020-03-01实施
本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由中华人民共和国海关总署提出并归口SN/T5133—2019
本标准起草单位：中华人民共和国太原海关、中华人民共和国运城海关、山西省运城市盐湖区植物保护检疫站。
本标准主要起草人：李惠萍、刘晓琳、刘艳俊、高媛惠、杨营业、王琳、毛本前、高浩、刘海峰。行业标准信息服务平台
1范围
枣大球蚜及近似种DNA条形码鉴定方法本标准规定了枣大球轿及近似种DNA条形码鉴定方法。SN/T5133—2019
本标准适用于枣大球蜥及近似种基因组的提取、DNA条形码序列的扩增、序列核查比对及基于DNA条形码的种类鉴定。
规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。3.1
DNAbarcodes
DNA条形码
DNA条形码是生物体内一段较短的、标准的、有足够变异的且易扩增的基因片段，在昆虫中，一般是指线粒体COI基因上5端的一没序列。3.2
COI基因COIgene
COI基因是线粒体基因组的细胞色素C氧化酶基I（CytochromecoxidasesubunitI)的编码基因，该基因进化速率较快，常用于分析亲缘关系密切的中、亚地理种群之间的系统关系。信息
DNA条形码鉴定DNAbarcoding
序列相似性Similarityofthesequences反映序列间相似程度的数值，一般以百分数表示，4
缩略语
下列缩略语适用于本标准
CTAB：Cetyltrithylammoniumbromide，十六烷基三甲基溴化铵。PCR：Polymerasechainreaction，聚合酶链式反应。DNA：DeoxyribonμLeicacid，脱氧核糖核酸。COl：CytochromeCOxidaseI,线粒体细胞色素C氧化酶亚基I。SN/T5133—2019
5枣大球及近似种的基本信息
中文名：枣大球
学名：Eulecaniumgigantea
英文名：Giganticglobularscale近似种：皱大球Eulecaniumkutwanai、朝鲜毛球Didesmococcuskoreanus、沙里院褐球Rhodococcussariuoni、水木坚Parthenolecaniumcorni。分类地位：枣大球蚜属半翅目Hemiptera，科Coccidae.大球蚜属EulecaniumCockerell枣大球与皱大球E.kuuanai、朝鲜毛球D.koreanus、沙里院褐球R.sariuoni、水木坚蚜P.corni在形态上相似，难以区分，这类虫多分布于温带地区，主要危害经济林木、绿化植物、景观花卉等，通过吸食植物汁液，分泌蜜露，导致植物生长衰弱和枯死，枣大球与近似种均固定在寄主植物上危害，可随寄主作远距离传播。6方法原理
利用一对特定引物对球蚜类虫线粒体DNA中的COI基因片段进行扩增和测序，获得到长度约为750bp的DNA序列，对该序列进行核查、校对和处理后得到有效序列，跟NCBI数据库中相应的序列进行比对，根据序列的相似度实现物种确定的目的，7
仪器及试剂耗材
7.1仪器
常规PCR仪、核酸蛋白分杆仪电泳仪、凝胶成像系统、生物安全柜、高压灭菌锅、显微镜、电子天平（感量1/10000）、眼科手术剪（10cm直大头）、水浴锅、恒温磁力搅拌器、漩涡混合仪、制冰机、纯水仪、准信息
干燥箱、冰箱、离心机（最大离心力大子1400g）微量移液器（0.5μL，2μL，10μL，20μL，100μL，200μL.1000μL)。
7.2试剂、耗材
除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂。CTAB提取液（参见附录A）、超纯水（应符合GB/T6682）、无水艺醇is饱和酚、TE缓冲液、蛋白酶K、氯仿、异戊醇、异丙醇、75%乙醇、DNA聚合酶、dNTP、6xDNA上样爱冲液DNA分子量标准、琼脂糖、溴化乙锭（EB)、TAE电泳液、胶回收试剂盒。PCR管（0.2mL.1.5mL)、无粉一次性手套。7.3引物
目标基因
引物名称
C1-1554_F
C1-2342_R
引物序列（5°-3）
CAGGAATAATAGGAACATCAATAAG
ATCAATGTCTAATCCGATAGTAAATA
扩增片段
750bp左右
8核酸提取与浓度、纯度测定
8.1样品处理
SN/T5133—2019
在显微镜下，取单头未被寄生的虫体（无水乙醇中保存），用无水乙醇洗净，常温晾干。8.2DNA提取
将上述样品置于已灭菌的1.5mL洁净离心管中加入CTAB提取液180L，充分剪碎，加入20μL蛋白酶K.按酚氯法（参见附录B)或试剂盒进行基因组DNA的提取。8.3DNA纯度与浓度的测定Www.bzxZ.net
用微量核酸蛋白分析仪测定DNA的纯度与浓度，选择浓度为50ng/μL～200ng/μL，纯度OD260/OD280比值为1.8～2.0的DNA进行扩增反应。9PCR扩增与序列分析
9.1PCR扩增
PCR扩增反应体系为25μL.体系配制（参见附录C）。PCR反应条件为：95℃3min预变性；5个循环（94℃40s,41℃40s.72℃60s).35个循环（94℃30s,52℃50s.72℃60s)：72℃10min延伸。PCR产物于4℃冰箱保存，如放置时间较长可放一20℃保存备用。9.2琼脂糖凝胶电泳
取3xDNA上样缓冲液4uL，与2LPCR产物混匀，用1%琼脂糖凝胶，在电压140V条件下，电泳35min～40min.EB染色，通过费胶成像系统观察、拍照。9.3PCR产物回收和测序
将电泳检测后以相同模板扩增的两管PCA制余产物合并共计46L，进行电泳，利用胶回收试剂盒纯化回收，将回收产物或PCR扩增原液送测序公司赔序。9.4序列数据的处理
测序获得长度约750bp的序列，通过序列编辑软件（MEGA6.0）对该片进行碱基核对，去除两端峰形杂乱的序列，选择峰形整齐的、方向与PCR扩增正向引物方向一致的-一序列作为确定物种的查询序列（参见附录D）。
10结果判定
将查询序列与NCBI数据库中序列比对，相似度最高的10条序列为相同物种，且最大相似度在98%以上（见附录E），可判定为该物种。11标本及原始数据保存
11.1标本保存
虫样标本置于无水乙醇中，在4℃保存；核酸样品在一20℃条件下保存。样品要标明来源，寄主，3
SN/T5133—2019
采集时间、地点及采集者。
11.2原始数据保存
样品检测结束后，其原始记录单和检验报告或证书须归档，要善保管，以备复验、谈判和仲裁行业标准信息服务平台
附录A
（资料性附录）
CTAB提取液配制方法
SN/T5133—2019
A.1称取6.00g固体CTAB（W/V=3%），16.36g固体NaCI(1.4mol*L-1），2.00g固体PVP（聚乙烯吡略烷酮）（W/V=1%）于300mL烧杯中。A.2加150mL水于前述，在恒温磁力搅拌器上，遂渐加热，同时连续搅拌，待固体充分溶解后，再加入8mLEDTA-Na(0.5mol*L-1PH=8.0).20mLTris-HCl(1mol*L-1PH=8.0).充分混勾。A.3将烧杯中液体转人200mL容量瓶中.加入0.4mLβ-筑基乙醇（V/V=0.2%）.定容至200mL，混匀。
A.4将容量瓶中的液体转人试剂瓶，高压蒸汽灭菌后，室温保存。行业标准信息服务平台
SN/T5133—2019
附录B
（资料性附录）
酚氯法提取轿虫基因组DNA的操作程序B.1取单头虫体（无水乙醇中保存）在显微镜下用无水乙醇洗净虫体；常温下晾干虫体。用70%酒精棉擦拭干净眼科手术剪，晾干手术剪后备用。B.2将晾干的虫体置于1.5mL离心管中，加入180μLCTAB提取液，再用眼科手术剪充分剪碎虫体B.3加人20μL蛋白酶K，于65℃左右水浴过夜或12h，期间可振荡数次，充分裂解。温浴结束，10000r/min离心15min。
B.4取上清液至新的1.5mL离心管中，分别加人上清液的一半体积的氯仿异戊醇（氯仿：异戊醇=24：1)和一半体积的Tris饱和酚，12000r/min离心10min。B.5取上清液于新的1.5mL离心管中，重复B.4一次。B.6取上清液于新的1.5mL离心管中，加人等体积的异丙醇（异丙醇实验前放人一20℃冰箱冷冻），轻微混匀放人一20℃，30min后，12000r/min离心20min；弃液。B.7加人500uL75%乙醇洗涤沉淀，12000r/min离心5min，如有明未洗干净的杂质，再重复洗1一2次，晾干后用30μL～50uLTE缓冲液溶解沉淀，4℃保存，不立即使用的可一20℃保存备用。行业标准信息服务平台
附录C
（资料性附录）
枣大球及近似种DNA条形码扩增体系配制枣大球及近似种扩增试剂采用的是TaKaRaLATaq酶，体系体积为25uL。C.1
C.225μL体系各组分配比见表C.1表C.1体系各组成成份及配比
组分名称
10xLA PCR Buffer II (Mg+ free)Mgcla
正向引物（10pmol/μL）
反向引物（10pmol/μL）
TaDNA聚合酶（5U/μL）
模板（50~200ng/μL）
SN/T5133—2019
行业标准信息服务平台
SN/T5133—2019
附录D
（资料性附录）
序列有效性
D.1如图D.1所示，有效序列段峰高、基部杂峰少且低的序列，且长度750bp左右。aaC
图D.1原始峰图
D.2通过对原始序列进行处理，举取有效序列后，打开MEGA软件选择Align进人Edit/BuildAlignment选择creatanewalignmen点击进人DNA：调人有效序列后选择TranslatedProteinSequences进人InvertebrateMitochon点击OK.完全翻译成氨基酸见图D.2。OZS
慧服务平台
有效序列完全翻译成氨基酸图
中文名
枣大球
皱大球
沙里院褐球
朝鲜毛球蜥
水木坚
附录E
（规范性附录）
枣大球及近似种COI参考序列
国际通用数据库中枣大球及近似种DNA条形码序列学名
Eulecaniumgigantea
Eulecaniumkuwanai
Rhodococcus sariuoni
Didesmococcus korean
Parthenolecanium corni
GenBank登陆号
KJ98521.1,KJ98531.1,
KJ908511.1.KJ908489.1
KR001893.1、MG674175、
MG674176,MG674177,
MG674178,MG674179
KJ908609、KJ908635.1
KJ908645.1.KJ905603.1
KJ908597.1.KJ908585.1、
KP189954.1、KP189964.1.
KP189962.1.KP189953.1
KP189909.1.KP189921.1、
KP189916.1,KP189911.1
MG817435.MG817436
MG817437、MG817438
MG817439.MG817440
KP189907.1.KP189895.1
KP189906.1、KP189900.1
MG317428,MG817429
MG87150.MG817431
MG817432,M17433
SN/T5133—2019
变异范围
99.8%~100%
98.9%100%
99.4%~100%
99.9%~100%
服务平
KY085291.1.KY0S5.1.
KY085133.1.KY0852.1
KY085284.1.KY085283.1
.4%~100%
JQ795616.1.KP189848.1
MG817447、MG817446
SN/T5133—2019
参考文献
[1]Ratnasingham S,HebertP.Bold:TheBarcodeof LifeData System.Molecular EcologyNotes.2007,7(3):355-364.
[2IRatnasinghamS&HebertPDN.BOLD:Thebarcodeoflifedatasystem(http://wwwbarcodinglife.org).MolecularEcologyNotes，2007,7（3):355-364.[3]HebertP,Ratnasingham S,deWardJ.Barcoding animal life:cytochrome c oxidase subunit1divergences amongcloselyrelated species.Proc.R.Soc.Lond.BBiol Sci.2o03,270:S96-S99.[4] Deng J.YuF,Zhang T X, et al.DNA barcoding of six Ceroplastes species (Hemiptera:Coccoidea:Coccidae)fromChina.MolecularEcologyResources,2012,12(5):791-796.L5ParkD S,SuhSJ,OhH W,etal.Recoveryof themitochondrial COI barcoderegionin diverseHexapoda through tRNA-based primers.BMCGenomics ,2010,11(1):1-7.［6］汤枋德，1991.中国科.山西：山西高校联合出版社.145-221.［7谢映平，1998.山西林果虫.北京：中国林业出版社.22-65[8]李惠萍，王静慧，张龙霞，刘海峰，刘晓琳.一种球类虫基因组DNA提取方法[JI.环境昆虫学报，2014，36（2）：182-187.[9]石晶晶，李惠萍，谢映平、林彦伯、刘艳俊、毛本前.基于分子标记COI、28S和18S对新菠萝灰粉与菠萝灰粉的识别鉴定[J.植物检疫，2016，30（3）：48-52行业标准信息服务平台
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中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T5133—2019
枣大球轿及近似种DNA条形码鉴定方法DNA barcoding for Eulecanium gigantea and related species行业标准信息服务平台
2019-09-03发布
中华人民共和国海关总署
2020-03-01实施
本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由中华人民共和国海关总署提出并归口SN/T5133—2019
本标准起草单位：中华人民共和国太原海关、中华人民共和国运城海关、山西省运城市盐湖区植物保护检疫站。
本标准主要起草人：李惠萍、刘晓琳、刘艳俊、高媛惠、杨营业、王琳、毛本前、高浩、刘海峰。行业标准信息服务平台
1范围
枣大球蚜及近似种DNA条形码鉴定方法本标准规定了枣大球轿及近似种DNA条形码鉴定方法。SN/T5133—2019
本标准适用于枣大球蜥及近似种基因组的提取、DNA条形码序列的扩增、序列核查比对及基于DNA条形码的种类鉴定。
规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。3.1
DNAbarcodes
DNA条形码
DNA条形码是生物体内一段较短的、标准的、有足够变异的且易扩增的基因片段，在昆虫中，一般是指线粒体COI基因上5端的一没序列。3.2
COI基因COIgene
COI基因是线粒体基因组的细胞色素C氧化酶基I（CytochromecoxidasesubunitI)的编码基因，该基因进化速率较快，常用于分析亲缘关系密切的中、亚地理种群之间的系统关系。信息
DNA条形码鉴定DNAbarcoding
序列相似性Similarityofthesequences反映序列间相似程度的数值，一般以百分数表示，4
缩略语
下列缩略语适用于本标准
CTAB：Cetyltrithylammoniumbromide，十六烷基三甲基溴化铵。PCR：Polymerasechainreaction，聚合酶链式反应。DNA：DeoxyribonμLeicacid，脱氧核糖核酸。COl：CytochromeCOxidaseI,线粒体细胞色素C氧化酶亚基I。SN/T5133—2019
5枣大球及近似种的基本信息
中文名：枣大球
学名：Eulecaniumgigantea
英文名：Giganticglobularscale近似种：皱大球Eulecaniumkutwanai、朝鲜毛球Didesmococcuskoreanus、沙里院褐球Rhodococcussariuoni、水木坚Parthenolecaniumcorni。分类地位：枣大球蚜属半翅目Hemiptera，科Coccidae.大球蚜属EulecaniumCockerell枣大球与皱大球E.kuuanai、朝鲜毛球D.koreanus、沙里院褐球R.sariuoni、水木坚蚜P.corni在形态上相似，难以区分，这类虫多分布于温带地区，主要危害经济林木、绿化植物、景观花卉等，通过吸食植物汁液，分泌蜜露，导致植物生长衰弱和枯死，枣大球与近似种均固定在寄主植物上危害，可随寄主作远距离传播。6方法原理
利用一对特定引物对球蚜类虫线粒体DNA中的COI基因片段进行扩增和测序，获得到长度约为750bp的DNA序列，对该序列进行核查、校对和处理后得到有效序列，跟NCBI数据库中相应的序列进行比对，根据序列的相似度实现物种确定的目的，7
仪器及试剂耗材
7.1仪器
常规PCR仪、核酸蛋白分杆仪电泳仪、凝胶成像系统、生物安全柜、高压灭菌锅、显微镜、电子天平（感量1/10000）、眼科手术剪（10cm直大头）、水浴锅、恒温磁力搅拌器、漩涡混合仪、制冰机、纯水仪、准信息
干燥箱、冰箱、离心机（最大离心力大子1400g）微量移液器（0.5μL，2μL，10μL，20μL，100μL，200μL.1000μL)。
7.2试剂、耗材
除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂。CTAB提取液（参见附录A）、超纯水（应符合GB/T6682）、无水艺醇is饱和酚、TE缓冲液、蛋白酶K、氯仿、异戊醇、异丙醇、75%乙醇、DNA聚合酶、dNTP、6xDNA上样爱冲液DNA分子量标准、琼脂糖、溴化乙锭（EB)、TAE电泳液、胶回收试剂盒。PCR管（0.2mL.1.5mL)、无粉一次性手套。7.3引物
目标基因
引物名称
C1-1554_F
C1-2342_R
引物序列（5°-3）
CAGGAATAATAGGAACATCAATAAG
ATCAATGTCTAATCCGATAGTAAATA
扩增片段
750bp左右
8核酸提取与浓度、纯度测定
8.1样品处理
SN/T5133—2019
在显微镜下，取单头未被寄生的虫体（无水乙醇中保存），用无水乙醇洗净，常温晾干。8.2DNA提取
将上述样品置于已灭菌的1.5mL洁净离心管中加入CTAB提取液180L，充分剪碎，加入20μL蛋白酶K.按酚氯法（参见附录B)或试剂盒进行基因组DNA的提取。8.3DNA纯度与浓度的测定Www.bzxZ.net
用微量核酸蛋白分析仪测定DNA的纯度与浓度，选择浓度为50ng/μL～200ng/μL，纯度OD260/OD280比值为1.8～2.0的DNA进行扩增反应。9PCR扩增与序列分析
9.1PCR扩增
PCR扩增反应体系为25μL.体系配制（参见附录C）。PCR反应条件为：95℃3min预变性；5个循环（94℃40s,41℃40s.72℃60s).35个循环（94℃30s,52℃50s.72℃60s)：72℃10min延伸。PCR产物于4℃冰箱保存，如放置时间较长可放一20℃保存备用。9.2琼脂糖凝胶电泳
取3xDNA上样缓冲液4uL，与2LPCR产物混匀，用1%琼脂糖凝胶，在电压140V条件下，电泳35min～40min.EB染色，通过费胶成像系统观察、拍照。9.3PCR产物回收和测序
将电泳检测后以相同模板扩增的两管PCA制余产物合并共计46L，进行电泳，利用胶回收试剂盒纯化回收，将回收产物或PCR扩增原液送测序公司赔序。9.4序列数据的处理
测序获得长度约750bp的序列，通过序列编辑软件（MEGA6.0）对该片进行碱基核对，去除两端峰形杂乱的序列，选择峰形整齐的、方向与PCR扩增正向引物方向一致的-一序列作为确定物种的查询序列（参见附录D）。
10结果判定
将查询序列与NCBI数据库中序列比对，相似度最高的10条序列为相同物种，且最大相似度在98%以上（见附录E），可判定为该物种。11标本及原始数据保存
11.1标本保存
虫样标本置于无水乙醇中，在4℃保存；核酸样品在一20℃条件下保存。样品要标明来源，寄主，3
SN/T5133—2019
采集时间、地点及采集者。
11.2原始数据保存
样品检测结束后，其原始记录单和检验报告或证书须归档，要善保管，以备复验、谈判和仲裁行业标准信息服务平台
附录A
（资料性附录）
CTAB提取液配制方法
SN/T5133—2019
A.1称取6.00g固体CTAB（W/V=3%），16.36g固体NaCI(1.4mol*L-1），2.00g固体PVP（聚乙烯吡略烷酮）（W/V=1%）于300mL烧杯中。A.2加150mL水于前述，在恒温磁力搅拌器上，遂渐加热，同时连续搅拌，待固体充分溶解后，再加入8mLEDTA-Na(0.5mol*L-1PH=8.0).20mLTris-HCl(1mol*L-1PH=8.0).充分混勾。A.3将烧杯中液体转人200mL容量瓶中.加入0.4mLβ-筑基乙醇（V/V=0.2%）.定容至200mL，混匀。
A.4将容量瓶中的液体转人试剂瓶，高压蒸汽灭菌后，室温保存。行业标准信息服务平台
SN/T5133—2019
附录B
（资料性附录）
酚氯法提取轿虫基因组DNA的操作程序B.1取单头虫体（无水乙醇中保存）在显微镜下用无水乙醇洗净虫体；常温下晾干虫体。用70%酒精棉擦拭干净眼科手术剪，晾干手术剪后备用。B.2将晾干的虫体置于1.5mL离心管中，加入180μLCTAB提取液，再用眼科手术剪充分剪碎虫体B.3加人20μL蛋白酶K，于65℃左右水浴过夜或12h，期间可振荡数次，充分裂解。温浴结束，10000r/min离心15min。
B.4取上清液至新的1.5mL离心管中，分别加人上清液的一半体积的氯仿异戊醇（氯仿：异戊醇=24：1)和一半体积的Tris饱和酚，12000r/min离心10min。B.5取上清液于新的1.5mL离心管中，重复B.4一次。B.6取上清液于新的1.5mL离心管中，加人等体积的异丙醇（异丙醇实验前放人一20℃冰箱冷冻），轻微混匀放人一20℃，30min后，12000r/min离心20min；弃液。B.7加人500uL75%乙醇洗涤沉淀，12000r/min离心5min，如有明未洗干净的杂质，再重复洗1一2次，晾干后用30μL～50uLTE缓冲液溶解沉淀，4℃保存，不立即使用的可一20℃保存备用。行业标准信息服务平台
附录C
（资料性附录）
枣大球及近似种DNA条形码扩增体系配制枣大球及近似种扩增试剂采用的是TaKaRaLATaq酶，体系体积为25uL。C.1
C.225μL体系各组分配比见表C.1表C.1体系各组成成份及配比
组分名称
10xLA PCR Buffer II (Mg+ free)Mgcla
正向引物（10pmol/μL）
反向引物（10pmol/μL）
TaDNA聚合酶（5U/μL）
模板（50~200ng/μL）
SN/T5133—2019
行业标准信息服务平台
SN/T5133—2019
附录D
（资料性附录）
序列有效性
D.1如图D.1所示，有效序列段峰高、基部杂峰少且低的序列，且长度750bp左右。aaC
图D.1原始峰图
D.2通过对原始序列进行处理，举取有效序列后，打开MEGA软件选择Align进人Edit/BuildAlignment选择creatanewalignmen点击进人DNA：调人有效序列后选择TranslatedProteinSequences进人InvertebrateMitochon点击OK.完全翻译成氨基酸见图D.2。OZS
慧服务平台
有效序列完全翻译成氨基酸图
中文名
枣大球
皱大球
沙里院褐球
朝鲜毛球蜥
水木坚
附录E
（规范性附录）
枣大球及近似种COI参考序列
国际通用数据库中枣大球及近似种DNA条形码序列学名
Eulecaniumgigantea
Eulecaniumkuwanai
Rhodococcus sariuoni
Didesmococcus korean
Parthenolecanium corni
GenBank登陆号
KJ98521.1,KJ98531.1,
KJ908511.1.KJ908489.1
KR001893.1、MG674175、
MG674176,MG674177,
MG674178,MG674179
KJ908609、KJ908635.1
KJ908645.1.KJ905603.1
KJ908597.1.KJ908585.1、
KP189954.1、KP189964.1.
KP189962.1.KP189953.1
KP189909.1.KP189921.1、
KP189916.1,KP189911.1
MG817435.MG817436
MG817437、MG817438
MG817439.MG817440
KP189907.1.KP189895.1
KP189906.1、KP189900.1
MG317428,MG817429
MG87150.MG817431
MG817432,M17433
SN/T5133—2019
变异范围
99.8%~100%
98.9%100%
99.4%~100%
99.9%~100%
服务平
KY085291.1.KY0S5.1.
KY085133.1.KY0852.1
KY085284.1.KY085283.1
.4%~100%
JQ795616.1.KP189848.1
MG817447、MG817446
SN/T5133—2019
参考文献
[1]Ratnasingham S,HebertP.Bold:TheBarcodeof LifeData System.Molecular EcologyNotes.2007,7(3):355-364.
[2IRatnasinghamS&HebertPDN.BOLD:Thebarcodeoflifedatasystem(http://wwwbarcodinglife.org).MolecularEcologyNotes，2007,7（3):355-364.[3]HebertP,Ratnasingham S,deWardJ.Barcoding animal life:cytochrome c oxidase subunit1divergences amongcloselyrelated species.Proc.R.Soc.Lond.BBiol Sci.2o03,270:S96-S99.[4] Deng J.YuF,Zhang T X, et al.DNA barcoding of six Ceroplastes species (Hemiptera:Coccoidea:Coccidae)fromChina.MolecularEcologyResources,2012,12(5):791-796.L5ParkD S,SuhSJ,OhH W,etal.Recoveryof themitochondrial COI barcoderegionin diverseHexapoda through tRNA-based primers.BMCGenomics ,2010,11(1):1-7.［6］汤枋德，1991.中国科.山西：山西高校联合出版社.145-221.［7谢映平，1998.山西林果虫.北京：中国林业出版社.22-65[8]李惠萍，王静慧，张龙霞，刘海峰，刘晓琳.一种球类虫基因组DNA提取方法[JI.环境昆虫学报，2014，36（2）：182-187.[9]石晶晶，李惠萍，谢映平、林彦伯、刘艳俊、毛本前.基于分子标记COI、28S和18S对新菠萝灰粉与菠萝灰粉的识别鉴定[J.植物检疫，2016，30（3）：48-52行业标准信息服务平台
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