标准号：SN/T 5138-2019 标准名称：棉花黄萎病菌检疫鉴定方法d 英文名称：Detetion and ident ification of verticillium dahliae Kleb 标准格式：PDF 发布时间：2019-09-03 实施时间：2020-03-01 标准大小：7394K 标准介绍：中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准由中华人民共和国海关总署提出并归口。 1范围 本标准规定了棉花黄萎病菌的检疫鉴定方法。 本标准适用于植物及其产品中棉花黄萎病菌的检測鉴 2定义和术语 下列术语和定义适用于本文件 轮枝状分生孢子梗 verticillate conidiophore 在直立的分生孢子梗每节基部膨大处轮生若干个小梗，一般1~5轮，是轮枝菌的分生孢子梗类型。 厚垣孢子 chlamydospore 由菌丝个别细胞膨大形成具有厚壁和浓缩的原生质，可抵抗不良环境的一种休眠孢子 微菌核 microsclerotia 由单一菌丝体不断聚集的暗褐色或黑色较为坚硬的休眠体休眠菌丝体 resti 种菌丝休眠体，暗褐色或近黑色，分隔规则，隔膜间膨大，呈念珠状。3基本信息 中文名：棉花黄萎病菌 学名： Verticillium dahliae Kleb 类地位：棉花黄娄病菌隶属于真菌界( Fungi)，子囊菌门( Ascomycota)，盘菌亚门( Pezizomycot na)，粪壳菌纲( Sordariomycetes)中的小不整球壳科( Plectosphaerellac 传播途径：棉花黄萎病菌主要由种子传播，也可经土壤、病残体、风、灌溉水和昆虫传播 近似种：黑白轮枝菌 Verticillium alboratrun Reinke and Berthold、三体轮枝菌V. tricorpus Isaac变黑轮枝菌V. nigrescens Pethy bridge、云状轮枝菌V. nubilum Pethy bridge等

ICS65.020.01
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 5138—2019
棉花黄萎病菌检疫鉴定方法
Detetion and identification of Verticillium dahliae Kleb行业标准信息服务平台
2019-09-03发布
中华人民共和国海关总署
2020-03-01实施
本标准按照GB/T1.12009给出的规则起草，SN/T5138—2019
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准由中华人民共和国海关总署提出并归口。本标准起草单位：宁波检验检疫科学技术研究院、中华人民共和国宁波海关、中华人民共和国天津海关、中国科学院微生物研究所、中华人民共和国乌鲁木齐海关、中华人民共和国青岛海关本标准起草人：段维军、郭立新、廖芳、蔡磊、李雪莲、张祥林、王英超、张慧丽、陈先锋。行业标准信息服务平台
1范围
棉花黄萎病菌检疫鉴定方法
本标准规定了棉花黄萎病菌的检疫鉴定方法。本标准适用于植物及其产品中棉花黄萎病菌的检测鉴定。2定义和术语
下列术语和定义适用于本文件
轮枝状分生孢子梗verticillateconidiophoreSN/T 5138—2019
在直立的分生孢子梗每节基部膨大处轮生若干个小梗，一般1～5轮，是轮枝菌的分生孢子梗类型2.2
厚垣孢子chlamydospore
由菌丝个别细胞膨大形成，具有厚壁和浓缩的原生质，可抵抗不良环境的一种休眠孢子。2.3
microsclerotium
微菌核
由单一菌丝体不断聚集的暗褐色或黑色较为坚硬的休眠体。2.4
休眠菌丝体restingmycelium
一种菌丝休眠体，暗褐色或近黑色，分隔规则，隔膜间膨大，呈念珠状。业标准信
3基本信息
中文名：棉花黄萎病菌
学名：VerticilliumdahliaeKleb分类地位：棉花黄萎病菌隶属于真菌界（Fungi），子囊菌门（Ascmycota），盘菌亚门（Pezizomycoti-na)，粪壳菌纲（Sordariomycetes)中的小不整球壳科（Plectosphaerellaceae)传播途径：棉花黄萎病菌主要由种子传播，也可经土壤、病残体、风、灌洗求和昆京传播近似种：黑白轮枝菌Verticilliumalbo-atrumReinkeandBerthold、三体轮枝/.tricorpusIsaac、变黑轮枝菌V.nigrescensPethybridge、云状轮枝菌V.nubilumPethybridge等。4鉴定原理
棉花黄萎病菌的危害症状、形态学特征及分子生物学特征是鉴定该病菌的依据。5
仪器和试剂
5.1仪器
高压灭菌锅、显微镜、解剖镜、天平、研钵、摇床、水浴锅、制冰机、纯水仪、旋涡振荡器、台式离心机、1
SN/T5138—2019
核酸蛋白分析仪、高速冷冻离心机、真空干燥仪、冰箱、超净工作台、生化培养箱、通风橱、实时荧光PCR仪、凝胶成像仪、微量移液器（0.1μ~2.5μ，1μ~10μ，10μ～50μ，20μ~200μ，100μ~1000μL）、锥形瓶、试管、培养皿、载玻片、盖玻片。5.2试剂
CTAB提取液（2%CTAB，1.4mol/LNaCl，20mmol/KEDTA，10ommol/LTris：HCpH8.0）、Tris饱和酚、氯仿、异戊醇、异丙醇、无水乙醇、次氯酸钠、RNase、PCR反应试剂：2XTaqManUniversal PCR Master Mix
除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂。5.3培养基
PDA培养基。
6检疫鉴定
6.1分离培养
挑取感病材料（如植株维管束、种子等），用1.5%次氯酸钠或75%酒精浸泡1min进行消毒处理无菌水冲洗3次后置于灭菌滤纸，吸干水分后放置于倒有PDA的培养Ⅲ中。培养皿倒置在25℃光照培养箱中培养。分离出可疑菌落后转接纯化培养。6.2形态学观察
显微镜检孢子的形态特征、产孢方式。在25℃、黑暗条件下，观察记录菌落的生长速度、颜色变化分生孢子梗和微菌核的形成情况。6.3DNA制备
标准信息服务平
采用基因组提取试剂盒制备DNA.采用改良的CTAB提取法，参见附录A。6.4实时荧光PCR检测
实时荧光PCR检测方法参见附录B。7
鉴定特征
7.1症状
植株受棉花黄萎病菌侵染后，维管束变褐色，该特征是维管束病害的典型特征。受棉化黄萎病菌侵染，植物叶片急剧失水，叶片呈花西瓜皮状，特别是顶部叶片常半边水烫状，不久整株迅速菱焉7.2形态学鉴定特征
菌落呈绒毛状，初生菌丝体无色或白色，有隔膜。培养10天以上菌落可产生大量微菌核，菌落变为黑褐色。分生孢子梗轮状分枝，1～5轮，分枝基部膨大，始终透明，顶端着生分生孢子，无色，单胞，椭圆形或近圆筒形。形态特征参见附录C和D。7.3实时荧光PCR结果判定
在阴性对照、空白对照正常的情况，则有如下判定：2
一样品无Ct值并且无扩增曲线，判定为阴性。一样品Ct值≤35.0，且出现典型的扩增曲线，判定为阳性。SN/T5138—2019
一样品Ct值在35.040.0之间时，须重新提取样品DNA进行扩增检测。重做结果无Ct值，判为阴性；否则判为阳性。
一样品Ct值为40时，判定为阴性。结果判定
以分离物的培养特征和实时荧光PCR检测结果作为鉴定依据，参考症状特点，进行综合判定。若分离物的培养特征与形态学鉴定特征符合，判定为棉花黄萎病菌，若分离物未检出微菌核等典型形态特征，实时荧光PCR检测为阳性，可判定为棉花黄萎病菌。9样品保存与复核
9.1样品保存
保存样品应置于2℃～8℃冰箱妥善保存，对检出棉花黄萎病菌的样品应至少保存6个月，以备复检、谈判和仲裁
分离到的棉花黄萎病菌应接种于PDA培养基中妥善保存。新治息展务平
9.2结果纪录与资料保存
包括：样品的来源、种类、采样时间、检测时间、地点、方法、结果等，并有实验人员的签字。实时荧光PCR要有检测阳性结果照片。
9.3复核
由海关总署指定的单位或人员负重，主要考察实验原始数据纪录及实时荧光PCR检测结果等资料3
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附录A
（资料性附录）
DNA提取方法
A.1收集培养分离得到的菌丝，放入浸在液氮里的1.5mL离心管，用无菌塑料杆迅速碾碎。A.2加人600uL65℃预热的CTAB抽提液，颠倒混勾后于65℃水浴0.5h～1h。A.3冷却至室温后，12000r/min离心10min，取上清液至另一离心管中。A.4加人1/2体积（300μL）的Tris饱和酚及1/2体积（300μL）的氯仿：异戊醇（24：1），颠倒混勾后静置至其开始分层。
A.512000rpm离心10min，取上清液至另一离心管中。A.6可重复A.4～A.52～3次，视两相界面处杂质的多少而定。A.7加人等体积氯仿：异戊醇（24：1),轻轻颠倒混匀。A.812000rpm离心10min，取上清液至另一离心管中。A.9向上清液中加入等体积异丙醇，轻轻颠倒混合均匀后于4℃或一20℃沉淀1hA.1012000rpm离心10min.弃去上清液，加500uL70%乙醇悬浮沉淀。A.1112000rpm离心5min，弃上清，室温干燥。A.12加50μL无菌水或TE缓冲液（10mmol/LTris.HCl，1mol/LEDTApH8.0）溶解沉淀，一20℃贮存备用。
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B.1引物及探针序列
附录B
（规范性附录）
实时荧光PCR方法
正向引物VD3F:5-CGTACGATTGAGAAGTTTGAGATAAGTG-3；反向引物VD3R：5CGTCGGAAACCATGAAAACA-3：SN/T 5138—2019
探针VDMGB35-CTGCTTGAATCTACAC-3°探针5端含有FAM报告荧光染料，3端含有不发荧光的萍灭基团并具有MGB分子。B.2扩增体系
PCR扩增反应体系为：2XTaqManUniversalPCRMasterMix12.5μL、引物VD3F/VD3R各0.4umol/L、探针VDMGB30.2μmol/L。反应总体积为25uL。将反应体系混合均勾后置于荧光PCR仪中进行反应。
以棉花黄萎病菌DNA作阳性对照、不含棉花黄萎病菌的DNA作阴性对照、以无菌蒸馏水作空白对照，每个样品设置3个重复。
B.3扩增反应条件
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扩增反应条件为：50℃30min35℃15min：然后94℃15s.60℃60s，共40个循环5
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附录C
（资料性附录）
棉花黄萎病菌形态特征
菌落形态特征
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微菌核形态特征
Verticillium dahliae
V.albo-atrun
V.nigrescens
V.nubilum
V.tricorpus
附录D
（资料性附录）
棉花黄萎病菌与近似种形态比较表D.1棉花黄萎病菌与近似种形态特征差异分生孢子
3.4~6.9X1.5~3.4
3.7~7.1×1.7~3.4
2.5~5.1X1.3~2.5
4.1~8.3X1.4~2.5
4.3~6.1X2.0~2.8
注：十表示有，一表示无
休眠菌丝
微菌核
15.3178×18.3~85.2
34.374.4×19.447.0
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单位：μm
厚垣孢子
4.1~7.2X3.2~6.2
7.8~12.5X5.0~8.4
6.1~8.7X5.2~7.0
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参考文献
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