标准号：SN/T 5139-2019 标准名称：马铃薯斑纹片病菌检疫鉴定方法 英文名称：Detection and ident ific ation of Candidatus Liberibacter solanacearum 标准格式：PDF 发布时间：2019-09-03 实施时间：2020-03-01 标准大小：18767K 标准介绍：中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 1范围 本标准规定了马铃薯斑纹片病菌的检测方法。 本标准适用于进境马铃薯、番茄、辣椒等茄科植物，以及胡萝卜、芫荽、芹菜等伞形科植物的种子、种 苗、块茎、块根等植物材料以及传播介体木虱中马铃薯斑纹片病菌的检疫鉴定。 马铃薯斑纹片病菌基本信息 中文名称：马铃薯斑纹片病 拉丁学名： Candidatus liberibacter solanacearum Liefting et al.,2009 英文名称： zebra chip, zebra complex 中文异名：斑马片病、马铃薯斑纹菌 同物异名： Candidatus Liberibacter psyllaurous Hansen et al.,2008分类地位：属原核生物界( Kingdom monera)，变形菌门 Proteobacteria)，a变形菌纲( Alphapro teobacteria)，根瘤菌目( Rhizobiales)，叶杆菌科( Phyllobacteriaceae)，韧皮部杆菌属( Candidatus Liberibacter)。 传播途径：马铃薯木虱、胡萝卜木虱、 Bactericera trigonia和B. macule!enis等木虱是马铃薯斑纹片病的传播介体，其通过取食染病植物携带病菌并进行传播。此外，还可随种子、种苗、块茎和块根等繁殖材料远距离传播，也可通过嫁接传播。 马铃薯斑纹片病菌其他信息参见附录A,病害症状及传播介体图片参见附录B。
本标准规定了马铃薯斑纹片病菌的检测方法。 本标准适用于进境马铃薯、番茄、辣椒等茄科植物，以及胡萝卜、芫荽、芹菜等伞形科植物的种子、种苗、块茎、块根等植物材料以及传播介体木虱中马铃薯斑纹片病菌的检疫鉴定。

ICS65.020.01
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 5139—2019
马铃薯斑纹片病菌检疫鉴定方法Detection and identification of Candidatus Liberibacter solanacearum行业标准信息服务平台
2019-09-03发布
中华人民共和国海关总署
2020-03-01实施
本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由中华人民共和国海关总署提出并归口。SN/T5139—2019
本标准起草单位：中华人民共和国满洲里海关，中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国呼和浩特海关。
本标准主要起草人：刘玮琦、赵文军、田茜、潘绪斌、杨永生、杭小溪、刘文敏、张贵、孟斌行业标准信息服务平台
1范围
马铃薯斑纹片病菌检疫鉴定方法本标准规定了马铃薯斑纹片病菌的检测方法。SN/T5139—2019
本标准适用于进境马铃薯、番茄、辣椒等茄科植物，以及胡萝卜、芜要、芹菜等伞形科植物的种子、种苗、块茎、块根等植物材料以及传播介体木虱中马铃薯斑纹片病菌的检疫鉴定。2马铃薯斑纹片病菌基本信息
中文名称：马铃薯斑纹片病菌
拉丁学名：CandidatusLiberibactersolanacearumLieftingetal.，2oo9英文名称：zebrachip，zebracomplex中文异名：斑马片病、马铃薯斑纹菌同物异名：CandidatusLiberibacterpsyllaurousHansenetal.，2oog分类地位：属原核生物界（KingdomMonera），变形菌门（Proteobacteria），α-变形菌纲（Alphaproteobacteria），根瘤菌目（Rhizobiales），叶杆菌科（Phyllobacteriaceae），韧皮部杆菌属（CandidatusLiberibacter)。
传播途径：马铃薯木虱、胡萝卜木虱、Bactericeratrigonica和B.maculipennis等木虱是马铃薯斑纹片病的传播介体，其通过取食染病植物携带病菌并进行传播。此外，还可随种子、种苗、块茎和块根等繁殖材料远距离传播，也可通过嫁接传播。标准信息服务平
马铃薯斑纹片病菌其他信息参见附录A，病害症状及传播介体图片参见附录B。3方法原理
主要以分子生物学特征为本标准鉴定方法的主要鉴定4仪器设备和主要试剂
4.1仪器设备
超净工作台、高速冷冻离心机、研磨机、小型研磨仪、拍打式均质仪、台式小型离心机、常规冰箱、旋涡震荡器、微量进样器、电子天平、PH计、水浴锅、纯水仪、高压灭菌器、超低温冰箱、荧光定量PCR仪、PCR仪、电泳仪、凝胶成像分析仪、制冰机等。4.2主要试剂
除另有规定外，所有试剂均为分析纯。TritonX-1OO、PBS缓冲液、PCR缓冲液、dNTPs（dATP、dTTP、dCTP、dGTP)、TaqDNA聚合酶、引物和探针、异丙醇、无水乙醇、DNA提取试剂见附录C。SN/T5139—2019
5病菌的鉴定
5.1症状检查
取样品量1%～5%（若样品少可适当增大比例）的叶片、茎秆和块茎等部位进行检查。在不同寄主甚至同一寄主不同品种上的为害症状及为害程度均有差异。症状参见附录A和附录B。5.2样品制备
5.2.1植株材料样品制备
植物材料用研磨仪或液氮进行匀浆处理，从有症状的植物上取3片-5片植物叶片或茎。在无症状的植物上不同部位取5片-10片叶子（包括新生的叶片）或茎杆。选取症状明显的植物地下部分进行检测，如马铃薯块茎，胡萝卜根等。在进行提取之前，要对材料进行二次取样，以保证材料包含较多的维管束组织，例如：叶柄，叶中脉，形成层，或马铃薯块茎维管束环等。5.2.2种子样品制备
种子样品可用研钵研磨，也可用研磨机处理，或置塑料袋内用锤子粉碎。或采用拍打式均质仪处理代替研磨。种衣剂处理过的种子应先去除种衣，将种子在1：10（w/v)0.5%TritonX-100中振荡洗涤30min，洗3次后在水中过夜软化。1g-2g胡萝卜种子（约450粒-900粒）样品加入50mL-100mLPBSNaCl,8g/L;NaH,PO2H,O,0.4g/L;NazHPO4·12HzO2.7g/L;pH7.2)缓冲液4℃冰箱浸泡过夜；弃缓冲液，种子用研磨仪研磨处理，研磨后加20mL-40mLPBS缓冲液，震荡混匀，纱布或滤纸过滤，滤液用于提取DNA。也可用PBS缓冲液（NaCl,8g/L：KH,PO4，0.24g/L；NazHPO，1.44g/L；KCl,0.2g/L:pH 7.2)。
5.2.3木虱样品制备
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取10只-30只木虱放人离心管中加适量衰液用小型研磨仪研磨，或放在研钵中加人液氮研磨备用。
5.3PCR初筛
5.3.1样品DNA提取
取植物组织或种子处理液过滤后的滤液1mL-2mL，10000r/min离心min.淀提取DNA。可用常规的CTAB提取方法，也可用商用DNA提取试剂盒。木虱样品制备后可用商业化试剂盒提取 DNA。
5.3.2分子生物学检测
本标准采用常规PCR、巢式PCR和实时荧光PCR检测方法，分别见附录C、D和E，重复3次。用马铃薯斑纹片病菌DNA作阳性对照，用健康马铃薯DNA作阴性对照，用灭菌蒸馏水作空白对照。6结果判定
若常规PCR、巢式PCR和实时荧光PCR三种检测方法，任一方法检测为阳性，可判定检出马铃薯斑纹片病菌。
7样品保存
SN/T5139—2019
样品经登记和经手人签字后妥善保存。对检出马铃薯斑纹片病菌的样品应保存于4℃冰箱中，以备复核。该类样品保存期满后应经高压灭菌后方可处理。对于检测结果显示为阳性的样品，应对样品进行保存。病样在一20℃或者一80℃冰箱中保存，做好标记和登记工作。
结果记录与资料保存
完整的实验记录包括：样品的来源、种类、接受时间、实验的时间、地点、方法和结果等，并要有经手人和实验人员的签字。PCR检测需有电泳结果照片及测序结果。行业标准信息服务平台
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A.1症状特征
附录A
（资料性附录）
马铃薯斑纹片病菌其他相关信息斑纹片病主要危害寄主植物的叶片、枝干、果实等部位，在不同寄主甚至同一寄主不同品种上的危害症状及危害程度均有差异。马铃薯，番茄和其他茄科植物地上部分症状与植原体症状类似，包括：矮化，新叶直立，叶片褪绿发紫，全株叶片向上卷曲，节间缩短，变粗，形成簇叶，节间膨大，腋胶生小枝或气生块茎，叶焦枯，果实畸形，量多而细小，发育停滞，品质差。马铃薯的地下症状包括匍甸茎倒伏，维管束组织变褐，伴随着内部组织的坏死斑和髓部组织的条纹。薯片油炸后，这些症状更加明显，薯条或薯片出现黑斑或斑纹，从而失去商用价值。该病害因马铃奠块茎上的斑纹症状而命名为“斑纹片病”胡萝卜上的症状与植原体和螺旋体病害症状相似，包括：卷叶，黄化，叶子发紫或红棕色，幼苗和根矮缩以及次生根增生。
A.2寄主范围
目前报道的寄主有茄科和伞形科植物，茄科包括：马铃薯Solanumtuberosum，番茄S.lycopersicum，辣椒Capsicumannuum，树番茄S.betaceum，烟草Nicotianatabacum，茄子S.melongena，灯笼果Physalisperuviana，银叶茄S.elaeagnifolium，东方龙葵S.ptycanthum和枸杞Lyciumbarbarum等。伞形花科包括：胡萝卜Dacuscarota，芹菜Apiumgraueolens，茴香Foeniculumuulgare、芜要Petroselinumcrispum，欧防风 Fastiratesativa、香芹Libanotisseseloides和欧洲萝卜Pastinacsativa 等。其潜在寄主范围比已知寄主范围更一泛标准信
A.3分布
惠服务平台
目前全世界17个国家和地区已有报道，其分布范围还在不断扩大，具体分布的国家和地区如下：北美洲：墨西哥、美国
中美洲：萨尔瓦多、危地马拉、洪都拉斯、尼加拉瓜。大洋洲：新西兰。
欧洲：芬兰、法国、挪威、西班牙、瑞典、德国、奥地利、英国。非洲：摩洛哥。
亚洲：以色列。
A.4侵染途径
病菌可通过带菌薯块和种子等紧殖材料进行远距离传播：由间通过昆虫介体传播。此外，病菌还口通过嫁接、染病植株、带菌种子和马铃薯种薯等进行传播和扩散目前报道的传播介体包括：马铃薯木虱Bactericeracockerelli、胡萝卜木虱Triozaapicalis、木虱B.trigonica和木虱B.maculipennis。4
附录B
（资料性附录）
病害症状及传播介体图片
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准信息服
务平台
a-btc-I快
马铃薯叶片和块茎症状（引自MunyanezaJE.）SN/T5139—2019
番茄上的卷叶褪绿和黄化症状bZxz.net
番茄上的褪绿和黄化症状
图B.4胡萝卜上的症状（a.卷叶和紫化；b.仅有卷叶；c.无症状）行业标准信
图3.6马喜木虱成虫
图B.5马铃薯木虱卵若虫和成虫
（图B.2和图B.3由新西兰初级产业部植物健康与环境实验室唐子颖博士据：图B.4、图B.5和图B.6引自EPPO)
C.1常规PCR扩增
附录C
（规范性附录）
常规PCR方法
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引物LsoTX16/23F(5-aattttagcaagttctaaggg-3)/LsoTX16/23R(5-ggtacctcccatatcgc-3);反应程序为：94℃3min；94℃30s,55℃30s.72℃40s.40个循环；72℃5min。预期扩增产物为383bp。
PCR反应体系
试剂名称
PCR缓冲液
氯化镁
上游引物
下游引物
TaqDNA聚合醇
模板DNA
50mmol/L
10mmol/L
10μmol/L
10μmol/L
5U/μL
≥10ng/μL
加样量/μL
补至25μL
上述反应中均需同时作阳性时照（马铃薯斑纹片病菌）、阴性对照（健康马铃薯叶片）和空白对照（以标准信：扇
蒸馏水代替模板DNA）。
C.2琼脂糖凝胶电泳
制备1.5%的琼脂糖凝胶，按比例混匀电泳上样缓冲液和PCK增产物，用DNAMarker作为分子量标记，进行电泳分析，电泳结束后在凝胶成像仪的紫外投射光下观象否扩增出预期的特异性DNA条带.并拍摄记录。
C.3结果判定
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PCR扩增产物电泳检测：阳性对照出现预期扩增片段，阴性对照没有目标条带，待检样品如出现预期扩增片段为阳性，如未出现预期扩增片段为阴性。SN/T5139—2019
D.1巢式PCR扩增
附录D
（规范性附录）
巢式PCR方法
引物采用马铃薯斑纹片病菌16SrDNA通用引物OA2/OI2c和Lib16S01F/Lib16S01R。引物序列见表D.1。
引物名称
Lib16So1F
Lib16So1R
巢式PCR检测的引物
引物序列5'-3
gcgcttatttttaataggagcggca
gcctcgcgacttcgcaacccat
ttctacgggataacgcacgg
cgtcagtatcaggccagtgag
产物/bp
用引物OA2/OI2c进行第1轮PCR反应。反应条件为：94℃/5min；94℃/30s，58℃/30S，72℃/1min.30个循环；72℃/10min。PCR反应体系见表D.22PCR反应体系
试剂名称
PCR缓冲液
氯化镁
上游引物
下游引物
TagDNA聚合酶
模板DNA
50mol/L
10mmol/L
10μmol/L
10μmol/L
5U/μl
≥10ng/μL
加样量/μL
准信照
补至25μ
取第一轮PCR产物1μL为模板利用通用引物Lib16SO1F/Lib16S01R进行第2轮PCR反应，反应体系见表D.2。反应条件为：94℃/5min；94℃/30s，58℃/30s，72℃/1min，35个循环；72℃/10min。
上述反应中均需同时作阳性对照（马铃薯斑纹片病菌）、阴性对照（健康马铃薯叶片）和空白对照（以蒸馏水代替模板DNA）。
琼脂糖凝胶电泳
制备1.5%的琼脂糖凝胶，按比例混勾电泳上样缓冲液和PCR扩增产物·用DNAMarker作为分8
SN/T5139—2019
子量标记，进行电泳分析，电泳结束后在凝胶成像仪的紫外投射光下观察是否扩增出预期的特异性DNA条带，并拍摄记录。
D.3结果判定
PCR扩增产物检测，阳性对照出现一条580bp的DNA片段，阴性对照和空白对照没有该核酸条带，待检样品如出现580bp的DNA片段为检测结果阳性，如未出现580bp的DNA片段为检测结果阴性。
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SN/T5139—2019
E.1荧光PCR检测
附录E
（规范性附录）
实时荧光PCR方法
LsoF（5'-gtcgagcgcttattttaatagga-3)/HLBr（5'-gcgttatcccgtagaaaaaggtag-3'）和探针HLBP（5FAM-agacgggtgagtaacgcg-BHQ-3）。PCR反应程序：95℃10min95℃15s，58℃1min，循环40次。反应体系见表E.1。
试剂名称
PCRbuffer(含25mmol/LMgSO,）
正义引物
反义引物
TaqDNA聚合酶
DNA模板
结果判定
实时荧光PCR反应体系
各2.5mmol/L
10μmol/L
10μmol/L
5U/μL
10 μmol/L
≥50ng/μL
行业标准
加样量/μL
补至25
实时荧光检测，阳性对照Ct值≤30，阴性对照和空白对照没有扩增或Ct值>40：样品Ct值≤35官息服务平台
为阳性：若在35与40之间，需重复试验，重复结果Ct值仍在35与样品无扩增或Ct值>40，为阴性。10
之间，判为阳性，否则判为阴性：
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