" style="height: auto !important;"> (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({}); 标准号：SN/T 5131-2019 标准名称：人参鉴定方法 英文名称：Identification method of Panax ginseng C A. Meyer 标准格式：PDF 发布时间：2019-09-03 实施时间：2020-03-01 标准大小：5514K 标准介绍：中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 本标准规定了人参的DNA条形码检測鉴定方法 本标准适用于中药材人参、饮片及其基原植物的检验鉴定，不适用于提取不到核酸的深加工产品和粉末混合物。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 3术语和定义 下列术语和定义适用于本文件 DNA条形码 DNA barcode DNA条形码是指生物体内够代表该物种的标准的有足够变异的、易扩增且相对较短的DNA片 内转录间隔区 Internal Transcribed Spacer:S 们在染色体上头尾相连、串联排列，相互之间由间隔区分隔。其中185.88和28SDNA基因组成一个转录单元。三者高度保守，适合于较高等级水平的生物群体间的系统分析，其间的间隔区为内转录间隔区( Internal Transcribed Spacer,ITS)，由ITS1-5.8s-1Ts2组成，由于进化相对迅速而具多态性，ITS2

ICS65.020.99
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T5131—2019
人参鉴定方法
Identification method of Panax ginseng C.A.Meyer行业标准信息服务平台
2019-09-03发布
中华人民共和国海关总署
2020-03-01实施
本标准依据国标GB/T1.1—2009起草编制。本标准由中华人民共和国海关总署提出并归口SN/T5131—2019
本标准起草单位：中华人民共和国重庆海关、中华人民共和国大连海关、中国医学科学院药用植物研究所。
本标准起草人：孙涛、孔德英、滕少娜、蒋丹、邓朝晖、姚辉。行业标准信息服务平台
1范围
人参鉴定方法
本标准规定了人参的DNA条形码检测鉴定方法。SN/T5131—2019
本标准适用于中药材人参、饮片及其基原植物的检验鉴定，不适用于提取不到核酸的深加工产品和粉未混合物。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。3.1
DNA条形码DNAbarcode
DNA条形码是指生物体内能够代表该物种的，标准的、有足够变异的、易扩增且相对较短的DNA片段。
内转录间隔区InternalTranscribedSpcerITs真核生物基因组中编码核糖体的基因包括28SrLA、5SDNA、18SrDNA和5.8SrDNA4种，它们在染色体上头尾相连、串联排列，相互之间由间隔区分隔。真中18S，5.8S和28SrDNA基因组成一个转录单元。三者高度保守，适合于较高等级水平的生物群体间的系析，其间的间隔区为内转录间隔报务平台
区（InternalTranscribedSpacer，ITS），由ITS1-5.8S-ITS2组成，由于进比对迅速而具多态性，ITS2序列被推荐为药用植物DNA条形码序列用于系统学研究。4人参基本信息
中文名：人参
学名：PanaxginsengC.A.Meyer
五加科（Araliaceae）人参属（PanarL）。《中国药典》（2ol0版）描述人参本品为五加科植物人参PanaxginsengC.A.Mey.的干燥根和根茎多于秋季采挖，洗净经晒干或烘干。栽培的俗称“园参”；播种在山林野生状态下自然生长的称“林下山参”，习称“籽海”。
人参的其他资料参见附录A。
SN/T5131—2019
5方法原理
采用DNA条形码标准方法流程，以ITS2序列为条码基因，将样品进行DNA提取一PCR扩增测序一BLAST比对分析，根据人参的ITS2序列特征，对样品进行鉴定，仪器用具和试剂
6.1仪器
PCR扩增仪、紫外分光光度仪、电泳仪、凝胶成像系统、高速冷冻离心机、烘箱、高压灭菌锅、电子天平（感量1/1000）、球磨仪或研钵、水浴锅、纯水仪、涡旋震荡器、冰箱、微量移液器（2μL，10pL，20μL，100μL，200μL,1000μL）、1.5mL离心管0.2mLPCR反应管。6.2主要试剂
除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂。实验用水应符合GB/T6682要求。CTAB提取液、Tris饱和酚、氯仿、异戊醇、异丙醇、75%乙醇、95%乙醇、RNaseA、液氮、10XPCR缓冲液、脱氧核糖核苷三磷酸（dNTPs）、ETaq聚合酶、引物（见表1）、DNAMarker、琼脂糖、溴化乙锭(EB)。
7检测方法
7.1样品的处理
除特殊标明外，样品使用75%酒精擦洗表面后晾干。行业标准会
DNA提取
见附录B。
DNA纯度与浓度的测定
倍息服务平台
用核酸蛋白分析仪测定DNA的纯度与浓度，分别最得 250 mim 和 280 nm 处的吸收值，计算核酸的纯度和浓度，计算公式如下：
DNA纯度=OD260/OD280
DNA浓度=50XOD260μg/mL
PCR级DNA溶液的OD260/OD280比值应为1.7~1.9。7.4PCR检测
人参DNA条形码方法鉴定PCR扩增引物序列见表1。表1
引物序列
目标基因
引物名称
ATGCGATACTTGGTGTGAAT
GACGCTTCTCCAGACTACAAT
条带大小
反应体系
反应体系见表2。
试剂名称
10XPCR缓冲液（不含Mg+）
MgCl.溶液
正向引物和反向引物
Taq酶
DNA模板
双蒸水
反应体系
注：也可用市售PCR预混液进行体系配制，反应体系参照说明书进行。7.4.3
反应条件
反应条件见表3。
预变性
琼脂糖凝胶电泳
反应条件
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PCR反应体系终浓度
1×PCR缓冲液
2mmoL/L
0.2mmoL/L
各0.2umoL/L
20ng~40ng
补足反应总体积到25μL
反应温度（℃）
业标准宿息服
循环数
取5uLPCR产物，用1.5~2%的琼脂糖凝胶进行电泳（5V/cm电压，.EB染，用凝胶成像系统平
观察、拍照。将剩余PCR产物进行双向测序。7.4.5
序列分析
7.4.5.1完整ITS2序列的获得
利用序列分析软件对测序结果进行拼接，去除两端5.8S和28S区段获得完整的ITS2序列，具体操作方法见附录C。人参的完整ITS2序列长度为230bp。7.4.5.2序列比对分析
登陆NCBI（美国国立生物技术信息中心）BLAST鉴定系统（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blastcgi)，通过比对查询相似度最高的物种，具体操作见附录D3
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结果判定
样品序列比对结果与人参的序列具有最高的相似性，为100%，则判定该试样为人参或检出人参成分；
样品序列比对结果与人参的序列不是100%，则判定该试样不是人参或未检出人参成分。标本与原始数据保存
9.1标本保存
样本应注明来源、时间、地点及鉴定者等信息，保存期为1年，以备复验，如涉及到贸易纠纷则须保存到纠纷解决完毕。保存期满后，按后期用途长久保存或处理，9.2原始数据保存
样品检测结束后，其原始记录单和检验报告或证书须归档，妥善保管，以备复验、谈判和仲裁。行业标准信息服务平台
A.1人参常见近似种及其伪混品
附录A
（资料性附录）
人参其他信息
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近似种：西洋参（Panarquinquefolius）、三七（P.notoginseng）、疙瘩七（P.bipinnatifidus）、竹节参（P.japonicus）假人参（P.pseudoginseng）等。伪混品：轮叶沙参（Adenophoratetraphylla）、桔梗（Platycodongrandiflorus）、商路（Phytolaccaacinosa）、紫茉莉（Mirabilisjalapa）等。A.2人参（Panaxginseng）ITS2基因序列（GenBankaccessionNo.KM036295.1）CGCATCGCGTCGCCCCCCAACCCATCACTCCCTTGCGGGAGTTGAGGCGGAGGGGCGGATAATGGCCTCCCGTGTCTCACCGCGCGGTTGGCCCAAATGCGAGTCCTTGGCGATGGACGTCACGACAAGTGGTGGTTGTAAAAAGCCCTCTTCTCATGTCGTGCGGTGACCCGTCGCCAGCAAAAGCTCTCATGACCCTGTTGCGCCGTCCTCGACGTGCGCTCCGACCGA.3西洋参（Panaxquinquefolius）ITS2基因序列（GenBankaccessionNo.GU213487.1）CGCATCGCGTCGCCCCCSAACCCATCACTCCTTTGCGGGAGTCGAGGCGGAGGGGCGGATAATGGCCTCCCGTGTCTCACCGCCCGGTTGGCCCAAATGCGAGTCCTTGGCGATGGACGTCACGACAAGTGGTGGTTGTAAAAAGCCCCTTCTCATGTCGTGCGGTGACCCGTCGCCAGCAAAAGCTCTCATGACCCTGTTGCGCCGTCOTCGACGTGCGCTCCGACCG准信息服务平台
SN/T5131—2019
附录B
（规范性附录）
DNA提取流程
B.1将样品用球磨仪或研钵液氮冷冻后磨碎，称取50-100mg于1.5mL的灭菌离心管中，加人700μLCTAB缓冲液，振荡混匀，置于65℃温浴60-90min，期间不断混匀；B.2冷却后加人5μLRNA酶溶液，置37℃温浴30min；B.3加人等体积的酚：氯仿：异戊醇（25：24：1），振荡均匀，12000r/min.离心15min；B.4取上清液放人另一1.5mL新管中，加人等体积的异丙醇，轻轻颠倒3-5次，置一20℃冰箱中放置40min;
B.512000r/min离心10min，弃去上清液；B.6加人400L70%乙醇溶液洗涤，12000r/min离心1min，弃上清液，将离心管室温下干燥15min
B.7加人50100uLTE或无菌去离子水，置65℃水浴40min充分溶解DNA，测量DNA的浓度和纯度后置于一20℃冰箱保存备用。注：也可使用试剂盒进行DNA提取，具体方法按照试剂盒说明书操作行业标准信息服务平台
附录C
（规范性附录）
ITS2序列获得方法
SN/T5131—2019
C.1登录ITS2数据库（TheITS2Database）网站：http：//its2.bioapps.biozentrum.uni-wuerzburg.de/C.2点击Tools任务栏的Annotae选项C.3在ITS2Annotation对话框内输人需处理的序列。C.4点击Annotation选项.获得ITS2序列。行业标准信息服务平台
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附录D
（规范性附录）
序列BLAST比对方法
D.1登录网站：http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgiD.2点击NucleotideBLAST选项
D.3在EnterQuerySequence对话框内输人待比对序列，Database数据库选择Others选项。D.4点击BLAST按钮进行比对。
D.5根据比对结果，按照8判定标准进行结果判定。行业标准信息服务平台
参考文献
SN/T5131—2019
[1Keller A,Schleicher T,SchultzJ,et al.5.8S-28S rRNA interaction and HMM-basedITS2annotation.Gene.2009,430：50~57.[2ILiDZ,LiuJQ,ChenZD,etal.PlantDNAbarcodinginChinaJJ.Journal of SystematicsandEvolution.2011,49:165-168.
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[8]徐晓兰，石林春，宋经元，等.基于ITS2条形码序列的山豆根基原植物及其混伪品的DNA分子鉴定[J7.世界科学技术一中医药现代化，1147-1152【9]任保青，陈之端.植物DNA条形码技术[J.植物学报，2010.45（1)：1-12行业标准信息服务平台
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