SN/T 5096-2019
基本信息
标准号： SN/T 5096-2019
中文名称：国境口岸蜱传孤星病毒实时荧光RT-PCR检测方法
标准类别：商检行业标准(SN)
标准状态：现行
出版语种：简体中文
下载格式：.zip .pdf
下载大小：648750
相关标签： 国境 口岸 病毒 实时 荧光 PCR 检测 方法
标准分类号
关联标准
出版信息
相关单位信息
标准简介
标准号：SN/T 5096-2019
标准名称：国境口岸蜱传孤星病毒实时荧光RT-PCR检测方法
英文名称：Real-time RT-PCR method for detecting Lone Star virus in ticks at frontier ports
标准格式：PDF
发布时间：2019-09-03
实施时间：2020-03-01
标准大小：1144K
标准介绍：本标准规定了国境口岸蜱传孤星病毒实时荧光RT-PCR检测方法的检测对象、生物安全和PCR防污染要求、仪器、试剂和检验程序
本标准适用于对蜱传孤星病毒的检测。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文
件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件
GB19489实验室生物安全通用要求
sN/T1293国境口岸蜱类监测规程
WS/T230临床诊断中聚合酶链反应(PCR)技术的应用
人间传染的病原微生物名录(中华人民共和国卫生部卫科教发〔200615号)
标准名称：国境口岸蜱传孤星病毒实时荧光RT-PCR检测方法
英文名称：Real-time RT-PCR method for detecting Lone Star virus in ticks at frontier ports
标准格式：PDF
发布时间：2019-09-03
实施时间：2020-03-01
标准大小：1144K
标准介绍：本标准规定了国境口岸蜱传孤星病毒实时荧光RT-PCR检测方法的检测对象、生物安全和PCR防污染要求、仪器、试剂和检验程序
本标准适用于对蜱传孤星病毒的检测。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文
件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件
GB19489实验室生物安全通用要求
sN/T1293国境口岸蜱类监测规程
WS/T230临床诊断中聚合酶链反应(PCR)技术的应用
人间传染的病原微生物名录(中华人民共和国卫生部卫科教发〔200615号)
标准图片预览
标准内容
ICS11.020
iii acJouak
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T5096—2019
国境口岸蜱传孤星病毒实时荧光RT-PCR检测方法
Real-time RT-PCR method for detecting Lone Starvirusinticksatfrontierports
2019-09-03发布
中华人民共和国海关总署
2020-03-01实施
本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草本标准由中华人民共和国海关总署提出并归口。SN/T5096—2019
本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院、杭州富集生物科技有限公司、中华人民共和国呼和浩特海关
本标准主要起草人：刘丽娟、曹晓梅、马爱敏、胡孔新、杨宇、徐宝梁、郭天宇、张胜、王静。1
1范围
SN/T5096—-2019
国境口岸蜱传孤星病毒实时荧光RT-PCR检测方法本标准规定了国境口岸蜱传孤星病毒实时荧光RT-PCR检测方法的检测对象、生物安全和PCR防污染要求、仪器、试剂和检验程序本标准适用于对蜱传孤星病毒的检测。2
规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件GB19489实验室生物安全通用要求SN/T1293国境口岸蜱类监测规程WS/T230临床诊断中聚合酶链反应（PCR）技术的应用人间传染的病原微生物名录（中华人民共和国卫生部卫科教发【2006】15号）术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。3.1
孤星病毒LoneStarvirus；LSv
布尼亚病毒科白龄病毒属成员，是单股负链节段性RNA病毒，有S、M和L片段。其中，L片段编码RNA依赖性RNA多聚酶，M片段编码糖蛋白Gn和Gc，S片段编码核衣壳蛋白和非结构蛋白。孤星病毒主要经蜱传播，经蜱叮咬后，人可能出现蜱传斑点热等症状。4缩略语
下列缩略语适用于本文件。
bp：碱基对（basepair）
Ct值：循环阈值（cyclethreshold）DEPC：焦碳酸乙二酯（diethylpyrocarbonate）FAM：6-羧基-荧光素（6-carboxy-fluorescein）RNA：核糖核酸（ribonucleicacid）ROX：6-羧基-x-罗丹明（6-carboxy-x-rhodamine）RT-PCR：逆转录聚合酶链反应（reversetranscriptionpolymerasechainreation）1
SN/T5096—2019
5检测对象
国境口岸现场采集的蜱虫样本。疑似被蜱虫叮咬且不能排除抓星病毒感染的人员生物安全和PCR防污染要求
生物安全要求
按照GB19489和《人间感染的病原微生物名录》的要求，孤星病毒相关材料的生物安全要求如下：未经培养的孤星病毒感染性材料的操作应在生物安全二级（BSL-2）实验室内进行；孤星病毒相关的灭活材料和无感染性材料操作可在生物安全一级（BSL-1）实验室内进行；孤星病毒感染性材料运输和包装分为B类，UN编号为UN3373。2PCR防污染要求
PCR防污染措施按WS/T230的规定执行。7仪器
荧光定量PCR仪。
二级生物安全柜。
3高压灭菌器。
7.4-70℃超低温冰箱
5冷冻离心机。
旋涡振荡器。
8试剂
DEPC水
DEPC处理过的不含RNA酶的水。
RNA提取试剂盒
QIAampViralRNAkit，详见试剂盒说明书，内含AVL、AW1、AW2和AVE等。3一步法荧光RT-PCR试剂盒
Ag-Path-IDTM One step RT-PCR Kit?1）给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。
给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果2
则可使用这些等效产品。
8.4引物和探针
序列见表1。
引物/探针名称
表1引物和探针序列
序列（5°-3'）
CTTCCTTAACCCTCAGATA
CCTCTTTATGGTCCCTTA
FAM-TCATCAACATCTCGTCTCATTCGCT-BHOISN/T5096—2019
监测期
扩增片段为134bp
注：探针的5’端标记的是FAM荧光报告基团，3”端标记的是BHO1荧光淬灭基团。其他等效荧光标记物和率灭基团或等效的引物和探针或其他等效的商品化检测试剂盒也可使用9检验程序
样本采集
9.1.1蜱虫样本的采集
按照SN/T1293执行。
9.1.2人血清样本的采集
无菌采集疑似病例发病3d内静脉血3mL~5mL，室温静置30min使其凝固，1500r/min~3000r/min离心10min，收集血清于2mL无菌螺口塑料管中，用耐低温油性记号笔登记编号，低温送到实验室检测。如24h内不能送到实验室，应将血清置于-70℃冰箱保存。9.2实验室检验
9.2.1样本处理Www.bzxZ.net
9.2.1.1蜱虫样本
在无菌操作台上，将蜱取出放在无菌的平皿内，用75%酒精浸泡20min，用无菌滤纸吸干蜱体表酒精，再用生理盐水漂洗3次，用无菌滤纸吸干蜱体表水分后，倒入研磨器中，加入1mLPBS或生理盐水吹洗，弃去液体后加入1mLPBS或生理盐水，反复研磨至组织碎片基本消失，随后将研磨液吸人1.5mL离心管，预冷4℃的离心机20000r/min离心10min，取上清液即可进行病毒核酸提取。
9.2.1.2血清样本
血清样本直接进行分子生物学核酸的提取，如24h不能及时检测应存放在-70℃冰箱。9.2.2病毒核酸提取
参照商品化试剂盒说明书进行，参见附录A。3
SN/T5096—2019
9.2.3实时荧光RT-PCR检测
9.2.3.1引物和探针
引物和探针应用液浓度配制成10μmol/L，扩增片段大小134bp。探针的5°端和3°端分别用FAM和BHQ1标记。
阳性对照和空白对照设置
在检测过程中，分别设阳性对照和空白对照。阳性对照为克隆孤星病毒的部分核苷酸序列（应包含扩增区域）在体外转录合成的cDNA；空白对照用无菌双蒸水。3反应体系组成
见表2。
表2孤星病毒实时荧光RT-PCR的反应体系单位为微升（μL）
DEPC水
2×RT-PCR缓冲液
10μmol/L上游引物
10μmol/L下游引物
10μmol/L探针
酶混合物
模板RNA/阴性对照/阳性对照
注：孤星病毒实时荧光RT-PCR的反应总体系为25μL。9.2.3.4反应条件
步法实时荧光RT-PCR检测扩增条件为：45℃10min1次；95℃10min1次；95℃15s，60℃45s，共40个循环。每个循环结束时采集荧光信号。选择FAM通道于60℃退火时收集荧光信号；设置ROX通道为参比通道。不同实验室可根据所使用的试剂和仪器参考上述反应条件作适当调整9.2.4检验结果判断及报告
阈值确定
阈值确定的方法对所有的样本都是统一的，一般是以实时荧光PCR反应的前3～15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，以本底信号标准差的10倍作为荧光阈值，以样本扩增产生的荧光信号达到荧光阈值时所对应的循环数为循环阈值（Ct值）。9.2.4.2质量控制
反应结果应同时符合以下2个条件：阴性对照物未出现扩增曲线；
阳性对照物Ct值≤35并有明显扩增曲线。4
9.2.4.3结果判断及报告
SN/T5096—2019
当同时进行的阳性对照和空白对照试验结果正常，本方法检验结果判定及报告如下：检测样本有明显的荧光扩增曲线，且Ct值≤35时，判为阳性，报告“检出孤星病毒特异性基因（实时荧光RT-PCR法）\。-检测样本荧光扩增曲线的Ct值介于35和40之间时，建议重新进行实时荧光RT-PCR检测。若重新检测的Ct值仍介于35和40之间，且曲线有明显的对数增长期，判为阳性，报告“检出孤星病毒特异性基因（实时荧光RT-PCR法），此类样本建议用其他方法进一步验证；否则判为阴性，报告“未检出孤星病毒特异性基因（实时荧光RT-PCR法）”。一检测样本无荧光扩增现象，判为阴性，报告“未检出孤星病毒特异性基因（实时荧光RT-PCR法）。
SN/T5096—2019
附录A
（资料性附录）
RNA病毒核酸提取
A.1取蜱样本研磨液或细胞培养液上清140μL加人560μL裂解液（AVL），在旋涡混匀器上振荡15s混匀，室温静止10min。
A.2加入560μ无水乙醇终止反应，在旋涡混匀器上振荡15s混匀。A.3裂解后的液体分两次移人管柱，每次8000r/min离心1min，此时病毒RNA会吸附在管柱底部的膜上。
A.4加人500μL洗液（AW1）至管柱上，每次8000r/min离心1min，弃去AWl。A.5加入500μL洗液（AW2）至管柱上，每次14000r/min离心3min，弃去AW2，进一步离心14000r/min1min，以彻底去除残留在膜上的乙醇。A.6加人60uL洗脱液（AVE），室温静置1min。A.7将管柱置于1.5mL离心管上，4℃离心8000r/min1min，得到的RNA即可进行实时荧光RT-PCR检测
小提示：此标准内容仅展示完整标准里的部分截取内容，若需要完整标准请到上方自行免费下载完整标准文档。
iii acJouak
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T5096—2019
国境口岸蜱传孤星病毒实时荧光RT-PCR检测方法
Real-time RT-PCR method for detecting Lone Starvirusinticksatfrontierports
2019-09-03发布
中华人民共和国海关总署
2020-03-01实施
本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草本标准由中华人民共和国海关总署提出并归口。SN/T5096—2019
本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院、杭州富集生物科技有限公司、中华人民共和国呼和浩特海关
本标准主要起草人：刘丽娟、曹晓梅、马爱敏、胡孔新、杨宇、徐宝梁、郭天宇、张胜、王静。1
1范围
SN/T5096—-2019
国境口岸蜱传孤星病毒实时荧光RT-PCR检测方法本标准规定了国境口岸蜱传孤星病毒实时荧光RT-PCR检测方法的检测对象、生物安全和PCR防污染要求、仪器、试剂和检验程序本标准适用于对蜱传孤星病毒的检测。2
规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件GB19489实验室生物安全通用要求SN/T1293国境口岸蜱类监测规程WS/T230临床诊断中聚合酶链反应（PCR）技术的应用人间传染的病原微生物名录（中华人民共和国卫生部卫科教发【2006】15号）术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。3.1
孤星病毒LoneStarvirus；LSv
布尼亚病毒科白龄病毒属成员，是单股负链节段性RNA病毒，有S、M和L片段。其中，L片段编码RNA依赖性RNA多聚酶，M片段编码糖蛋白Gn和Gc，S片段编码核衣壳蛋白和非结构蛋白。孤星病毒主要经蜱传播，经蜱叮咬后，人可能出现蜱传斑点热等症状。4缩略语
下列缩略语适用于本文件。
bp：碱基对（basepair）
Ct值：循环阈值（cyclethreshold）DEPC：焦碳酸乙二酯（diethylpyrocarbonate）FAM：6-羧基-荧光素（6-carboxy-fluorescein）RNA：核糖核酸（ribonucleicacid）ROX：6-羧基-x-罗丹明（6-carboxy-x-rhodamine）RT-PCR：逆转录聚合酶链反应（reversetranscriptionpolymerasechainreation）1
SN/T5096—2019
5检测对象
国境口岸现场采集的蜱虫样本。疑似被蜱虫叮咬且不能排除抓星病毒感染的人员生物安全和PCR防污染要求
生物安全要求
按照GB19489和《人间感染的病原微生物名录》的要求，孤星病毒相关材料的生物安全要求如下：未经培养的孤星病毒感染性材料的操作应在生物安全二级（BSL-2）实验室内进行；孤星病毒相关的灭活材料和无感染性材料操作可在生物安全一级（BSL-1）实验室内进行；孤星病毒感染性材料运输和包装分为B类，UN编号为UN3373。2PCR防污染要求
PCR防污染措施按WS/T230的规定执行。7仪器
荧光定量PCR仪。
二级生物安全柜。
3高压灭菌器。
7.4-70℃超低温冰箱
5冷冻离心机。
旋涡振荡器。
8试剂
DEPC水
DEPC处理过的不含RNA酶的水。
RNA提取试剂盒
QIAampViralRNAkit，详见试剂盒说明书，内含AVL、AW1、AW2和AVE等。3一步法荧光RT-PCR试剂盒
Ag-Path-IDTM One step RT-PCR Kit?1）给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。
给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果2
则可使用这些等效产品。
8.4引物和探针
序列见表1。
引物/探针名称
表1引物和探针序列
序列（5°-3'）
CTTCCTTAACCCTCAGATA
CCTCTTTATGGTCCCTTA
FAM-TCATCAACATCTCGTCTCATTCGCT-BHOISN/T5096—2019
监测期
扩增片段为134bp
注：探针的5’端标记的是FAM荧光报告基团，3”端标记的是BHO1荧光淬灭基团。其他等效荧光标记物和率灭基团或等效的引物和探针或其他等效的商品化检测试剂盒也可使用9检验程序
样本采集
9.1.1蜱虫样本的采集
按照SN/T1293执行。
9.1.2人血清样本的采集
无菌采集疑似病例发病3d内静脉血3mL~5mL，室温静置30min使其凝固，1500r/min~3000r/min离心10min，收集血清于2mL无菌螺口塑料管中，用耐低温油性记号笔登记编号，低温送到实验室检测。如24h内不能送到实验室，应将血清置于-70℃冰箱保存。9.2实验室检验
9.2.1样本处理Www.bzxZ.net
9.2.1.1蜱虫样本
在无菌操作台上，将蜱取出放在无菌的平皿内，用75%酒精浸泡20min，用无菌滤纸吸干蜱体表酒精，再用生理盐水漂洗3次，用无菌滤纸吸干蜱体表水分后，倒入研磨器中，加入1mLPBS或生理盐水吹洗，弃去液体后加入1mLPBS或生理盐水，反复研磨至组织碎片基本消失，随后将研磨液吸人1.5mL离心管，预冷4℃的离心机20000r/min离心10min，取上清液即可进行病毒核酸提取。
9.2.1.2血清样本
血清样本直接进行分子生物学核酸的提取，如24h不能及时检测应存放在-70℃冰箱。9.2.2病毒核酸提取
参照商品化试剂盒说明书进行，参见附录A。3
SN/T5096—2019
9.2.3实时荧光RT-PCR检测
9.2.3.1引物和探针
引物和探针应用液浓度配制成10μmol/L，扩增片段大小134bp。探针的5°端和3°端分别用FAM和BHQ1标记。
阳性对照和空白对照设置
在检测过程中，分别设阳性对照和空白对照。阳性对照为克隆孤星病毒的部分核苷酸序列（应包含扩增区域）在体外转录合成的cDNA；空白对照用无菌双蒸水。3反应体系组成
见表2。
表2孤星病毒实时荧光RT-PCR的反应体系单位为微升（μL）
DEPC水
2×RT-PCR缓冲液
10μmol/L上游引物
10μmol/L下游引物
10μmol/L探针
酶混合物
模板RNA/阴性对照/阳性对照
注：孤星病毒实时荧光RT-PCR的反应总体系为25μL。9.2.3.4反应条件
步法实时荧光RT-PCR检测扩增条件为：45℃10min1次；95℃10min1次；95℃15s，60℃45s，共40个循环。每个循环结束时采集荧光信号。选择FAM通道于60℃退火时收集荧光信号；设置ROX通道为参比通道。不同实验室可根据所使用的试剂和仪器参考上述反应条件作适当调整9.2.4检验结果判断及报告
阈值确定
阈值确定的方法对所有的样本都是统一的，一般是以实时荧光PCR反应的前3～15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，以本底信号标准差的10倍作为荧光阈值，以样本扩增产生的荧光信号达到荧光阈值时所对应的循环数为循环阈值（Ct值）。9.2.4.2质量控制
反应结果应同时符合以下2个条件：阴性对照物未出现扩增曲线；
阳性对照物Ct值≤35并有明显扩增曲线。4
9.2.4.3结果判断及报告
SN/T5096—2019
当同时进行的阳性对照和空白对照试验结果正常，本方法检验结果判定及报告如下：检测样本有明显的荧光扩增曲线，且Ct值≤35时，判为阳性，报告“检出孤星病毒特异性基因（实时荧光RT-PCR法）\。-检测样本荧光扩增曲线的Ct值介于35和40之间时，建议重新进行实时荧光RT-PCR检测。若重新检测的Ct值仍介于35和40之间，且曲线有明显的对数增长期，判为阳性，报告“检出孤星病毒特异性基因（实时荧光RT-PCR法），此类样本建议用其他方法进一步验证；否则判为阴性，报告“未检出孤星病毒特异性基因（实时荧光RT-PCR法）”。一检测样本无荧光扩增现象，判为阴性，报告“未检出孤星病毒特异性基因（实时荧光RT-PCR法）。
SN/T5096—2019
附录A
（资料性附录）
RNA病毒核酸提取
A.1取蜱样本研磨液或细胞培养液上清140μL加人560μL裂解液（AVL），在旋涡混匀器上振荡15s混匀，室温静止10min。
A.2加入560μ无水乙醇终止反应，在旋涡混匀器上振荡15s混匀。A.3裂解后的液体分两次移人管柱，每次8000r/min离心1min，此时病毒RNA会吸附在管柱底部的膜上。
A.4加人500μL洗液（AW1）至管柱上，每次8000r/min离心1min，弃去AWl。A.5加入500μL洗液（AW2）至管柱上，每次14000r/min离心3min，弃去AW2，进一步离心14000r/min1min，以彻底去除残留在膜上的乙醇。A.6加人60uL洗脱液（AVE），室温静置1min。A.7将管柱置于1.5mL离心管上，4℃离心8000r/min1min，得到的RNA即可进行实时荧光RT-PCR检测
小提示：此标准内容仅展示完整标准里的部分截取内容，若需要完整标准请到上方自行免费下载完整标准文档。