SN/T 4877.13-2019
基本信息
标准号： SN/T 4877.13-2019
中文名称：基因条形码筛查方法 第13部分：检疫性马铃薯Y病毒属病毒
标准类别：商检行业标准(SN)
标准状态：现行
出版语种：简体中文
下载格式：.zip .pdf
标准分类号
关联标准
出版信息
相关单位信息
标准简介
标准号：SN/T 4877.13-2019
标准名称：基因条形码筛查方法 第13部分：检疫性马铃薯Y病毒属病毒
英文名称：DNA barcoding screening method--Part 13: Qurantine Potyviruse
标准格式：PDF
发布时间：2019-09-03
实施时间：2020-03-01
标准大小：6414K
标准介绍：SN/T487{基因条形码筛查方法》分为15个部分：
第1部分：检疫性棒形杆菌
第2部分：检疫性黄单胞菌
第3部分：检疫性植原体
第4部分：检疫性茎点霉
第5部分：检疫性拟茎点霉；
第6部分：检疫性嗜酸菌
第7部分：检疫性轮枝菌；
第8部分：检疫性炭疽菌；
第9部分：检疫性腥黑粉菌
第10部分：检疫性疫霉
第11部分：检疫性异株苋亚属
第12部分：黄瓜绿斑驳花叶病毒
第13部分：检疫性马铃薯Y病毒属病毒
第14部分：检疫性南方菜豆花叶病毒属病毒
第15部分：检疫性叶点霉
本部分为SN/T4877的第13部分。
本部分按照GB/T1.1-2009给出的规则起草
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任
本部分由中华人民共和国海关总署提出并归口 本部分规定了检疫性马铃薯Y病毒属病毒的基因条形码筛查方法中RNA提取、基因扩增、序列的比对分析及结果判定等。
本部分适用于寄主植物中马铃薯Y病毒属中检疫性病毒的筛查。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件
SN/T2122进出境植物及植物产品检疫抽样。
3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
DNA条形码( DNA barcode)
DNA条形码是指生物体内能够代表该物种的、标准的、有足够变异的、易扩增且相对较短的DNA
标准名称：基因条形码筛查方法 第13部分：检疫性马铃薯Y病毒属病毒
英文名称：DNA barcoding screening method--Part 13: Qurantine Potyviruse
标准格式：PDF
发布时间：2019-09-03
实施时间：2020-03-01
标准大小：6414K
标准介绍：SN/T487{基因条形码筛查方法》分为15个部分：
第1部分：检疫性棒形杆菌
第2部分：检疫性黄单胞菌
第3部分：检疫性植原体
第4部分：检疫性茎点霉
第5部分：检疫性拟茎点霉；
第6部分：检疫性嗜酸菌
第7部分：检疫性轮枝菌；
第8部分：检疫性炭疽菌；
第9部分：检疫性腥黑粉菌
第10部分：检疫性疫霉
第11部分：检疫性异株苋亚属
第12部分：黄瓜绿斑驳花叶病毒
第13部分：检疫性马铃薯Y病毒属病毒
第14部分：检疫性南方菜豆花叶病毒属病毒
第15部分：检疫性叶点霉
本部分为SN/T4877的第13部分。
本部分按照GB/T1.1-2009给出的规则起草
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任
本部分由中华人民共和国海关总署提出并归口 本部分规定了检疫性马铃薯Y病毒属病毒的基因条形码筛查方法中RNA提取、基因扩增、序列的比对分析及结果判定等。
本部分适用于寄主植物中马铃薯Y病毒属中检疫性病毒的筛查。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件
SN/T2122进出境植物及植物产品检疫抽样。
3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
DNA条形码( DNA barcode)
DNA条形码是指生物体内能够代表该物种的、标准的、有足够变异的、易扩增且相对较短的DNA
标准图片预览
标准内容
ICS65.020
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T4877.13—2019
基因条形码筛查方法
第13部分：检疫性马铃薯Y病毒属病毒DNA barcoding screening method-—Part 13: Qurantine Potyviruses行业标准信息服务平台
2019-09-03发布
中华人民共和国海关总署
2020-03-01实施
SN/T4877《基因条形码筛查方法》分为15个部分：一第1部分：检疫性棒形杆菌；
一一第2部分：检疫性黄单胞菌；一一第3部分：检疫性植原体；
一第4部分：检疫性茎点霉；
一第5部分：检疫性拟茎点霉；
二一第6部分：检疫性嗜酸菌；
一第7部分：检疫性轮枝菌；
二第8部分：检疫性炭疽菌；
一第9部分：检疫性腥黑粉菌；
一第10部分：检疫性疫霉；
一第11部分：检疫性异株苋亚属；一第12部分：黄瓜绿斑驳花叶病毒；第13部分：检疫性马铃薯Y病毒属病毒；一第14部分：检疫性南方菜豆花叶病毒属病毒；第15部分：检疫性叶点霉。
本部分为SN/T4877的第13部分。本部分按照GB/T1.1一20G号给出的规则起草。SN/T 4877.13—2019
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本部分由中华人民共和国海关总黑提出并归口。本部分起草单位：中华人民共和国北京海天中华人民共和国青岛海关准信息服务平台
本部分主要起草人：邓丛良，刘兴亮、张丽蒸、王英侣、赵晓丽、骆卫峰、郑春生。1范围
基因条形码筛查方法
第13部分：检疫性马铃署Y病毒属病毒SN/T4877.13—2019
本部分规定了检疫性马铃薯Y病毒属病毒的基因条形码筛查方法中RNA提取、基因扩增、序列的比对分析及结果判定等。
本部分适用于寄主植物中马铃薯Y病毒属中检疫性病毒的筛查。2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。SN/T2122进出境植物及植物产品检疫抽样。3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。DNA条形码（DNAbarcode）
业标准信息服
DNA条形码是指生物体内能多代表该物种的、标准的、有足够变异的、易扩增且相对较短的DNA片段。
4马铃薯Y病毒属基本信息
中文名称：马铃薯Y病毒属
学名：genusPotyuirus
马铃薯Y病毒属属于马铃薯Y病毒科（Potyviridae），是已知最大的植勿病需之一，占到已知植物病毒的20%以上，其代表种是马铃薯Y病毒（PatatovirusY.PVY）。该属病毒包括香焦苞片花叶病毒（Bananabractmosaicvirus，BBrMV）、李痘病毒（Plumporvirus，PPV）、马铃薯病毒（otatevirusA，PVA)和马铃薯V病毒（PotatovirusA，PVV)4种检疫性植物病毒。有关该病毒属的他信息参见附录A。
5方法原理
以马铃薯Y病毒属病毒的基因组序列中的保守区域设计合成简并引物，建立该病毒属病毒基因条形码筛查方法：并对PCR产物进行序列测定，通过序列分析确定病毒种类。因此，马铃薯Y病毒属的分子生物学特征是制定本检测鉴定方法的主要依据。1
SN/T4877.13—2019
仪器设备与试剂
6.1仪器设备与用具
研磨仪，微量天平（感量：0.001g），PCR仪，电泳仪，水平电泳槽，凝胶成像仪，高速冷冻台式离心机，水浴槽或恒温孵育器，pH计，各种量程的可调移液器（1000μL、200μL、100μL、20μL、10μL、2）等。
6.2试剂
试剂见附录B。
筛查鉴定方法
7.1抽样检查
按照SN/T2122给出的方法进行抽样、取样。7.2RT-PCR方法
按附录B给出的方法，进行通用RT-PCR检测。用已知病毒分离物作阳性对照，健康植物组织作阴性对照，并设置空白对照。
7.3序列测定与分析
将PCR产物回收后，进行克隆、测序，或者PCR产物直接测序（序列测定可由专业的生物公司完成）。把测定的核苷酸序列及翻谨后的氨基酸序列与已知马铃薯Y病毒属的病毒序列（参见附录C)进行比对。采用邻接法（或者利用MGA6的NJ算法）构建系统发育树。注：序列比对可利用NCBI网站上的BA软件进行，网址为http：//ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/标准信
结果判定
8.1RT-PCR方法检测结果为阴性，则判定未检出马铃薯Y病毒属脑毒。8.2RT-PCR方法检测结果为阳性，则进行序列测定与分析：a）如果翻译后氨基酸序列与马铃薯Y病毒属已知病毒氨基酸序列同性最高且大于80%，则判定检出马铃薯Y病毒属病毒（具体病毒种类还需采用其他方法进一步鉴)。b）如果翻译后氨基酸序列与马铃薯Y病毒属已知病毒序列同源性小于80%：如果系统发育分析表明与马铃薯Y病毒属病毒聚为一群，则判定检出马铃薯Y病毒属病毒（具体病毒种类还需采用其他方法进一步鉴定）；注：所检测到的病毒可能属于基因组序列尚未测定的已知病毒或尚未报道的新的病毒种类。如果系统发育分析表明与马铃薯Y病毒属病毒未聚为一群，则判定未检出马铃薯Y病毒属病毒。
c）如果测定的基因组序列与马铃薯Y病毒属中的PPV、PVA、PPV和BBrMV中植物病毒基因组序列同源性最高，则判定筛查出检疫性植物病毒，需要根据具体病毒的检疫鉴定标准方法进行最终鉴定到种。
9结果记录
SN/T4877.13—2019
记录样品信息和检测数据，包括样品来源、植物种类、取样时间与地点，检测时间、方法和结果以及人员签字。RT-PCR凝胶电泳检测应保存电泳照片，测序结果保存测序报告图。10样品保存
检出马铃薯Y病毒属的样品应妥善保存在超低温冰箱中，或冻干后低温保存，并作好登记和标识以备复核。
行业标准信息服务平台
SN/T 4877.13—2019
A.1病毒粒体形态
附录A
（资料性附录）
马铃薯Y病毒属基本信息
马铃薯Y病毒属的病毒粒体为线状粒子，通常长约680～900nm，直径12～15nm.螺旋对称结构，螺距约3.4nm。该属病毒外壳蛋白由一种多肽组成，分子量为28～38kDa，占整个病毒粒体95%的重量（图A.1)。
GenomicRNA
Suwss insmituteofBioiniforrmatic图A.1马铃薯Y病毒属病毒的粒体结构(http://viralzone.expasy.org/all_by_species/50.html)A,2病毒的基因组结构与功能
马铃薯Y病毒属病毒为单分体正单链RNA病毒，全长约10Kb，在RNA基因组的5末端共价连接一个蛋白质，称VPg（Viralprctein，genome-linked），约24kDa，3末端具有二个poly（A）尾，5和3末端各有一段非翻译区（UTR；整个基因组的第一个可读框编码一个大的多聚蛋白（polyprotein），经过翻译加工成具有不同功能的蛋白。力上后的成熟蛋白从N端到C端依次为：P1蛋白、HC-Pro蛋白、P3蛋白、6K1蛋白、CI蛋白、6K2蛋白、VP、生白、NIa蛋白、NIb蛋白和外壳蛋白CP（Hari，1981；DoughertyandCarrington，1988；Murphyetal.，995。其中三个病毒基因组自身编码的蛋白（P1、HC-Pro和NIa蛋白）为具有自我切割和切割其他蛋白能力的白酶，且其切割位点具有一定的特异性（DoughertyandSemler，1993）。最新研究表明，马铃薯Y病手科病还编码一个短的可读框，位于P3服务平台
顺反子中，它由十2读框翻译，其编码产物被称为PIPO（PrettyTnterestPotyuiridaeORF）蛋白(Chungetal.，2008）。马铃薯Y病毒属基因组结构特征见图A.2。5Pg
P1-proHC-proP3
Polyprotein
DViralZon
SlBSwissInstituteofBioinformatC
Ribosomal
frameshift
P1-proHC-proMIVP
Nla-pro
NIbRdRpwww.bzxz.net
CleavagebyNla-pro
图A.2马铃薯Y病毒属基因组结构特征（来源同图A.1）A.3
马铃薯Y病毒属的部分病毒种类
马铃薯Y病毒属的部分病毒种类见表A.1。表A.1
中文名
山姜花叶病毒
六出花花叶病毒
苋叶斑驳病毒
萝藤花叶病毒
菊芋潜隐病毒
天门冬病毒1号
香蕉苞片花叶病毒
菜豆普通花叶坏死病毒
菜豆普通花叶病毒
菜豆黄花叶病毒
甜菜花叶病毒
鬼针草斑驳病毒
虾脊兰轻型花叶病毒
豆蔻花叶病毒
麝香石竹脉斑驳病毒
胡萝卜细叶病毒
芹菜花叶病毒
Ceratobium花叶病毒
南美红辣椒脉斑驳病毒
三叶草黄脉病毒
鸭茅线条病毒
哥伦比亚曼陀罗病毒
鸭跖草花叶病毒
紅豆蚜传花叶病毒
虹豆绿色脉带病毒
芋花叶病毒
曼陀罗带化病毒
苣英菜坏死花叶病毒
香雪兰花叶病毒
嘉兰条斑花叶病毒
花生眼斑病毒
羊草花叶病毒
堆心菊Y病毒
马铃薯Y病毒属的部分病毒种类
Alpinia mosaicvirus(AIpMV)
Alstroemeria mosaic virus(AIMV)Amaranthus leaf mottle virus(AmLMV)Araujia mosaic virus(ArjMV)
Artichoke latent virus(ArLV)Asparagus uirus (AV-1)
Banana bract mosaic virus(BBrMV)Beancommonmosaicnecrosisvirus(BCMNV)Beancommon mosaic virus(BCMV)Bean yellow mosaic virus (BYMV)Beet mosaic virus(BtMV)
Bidens mottle virus (BiMoV)
Calanthemild mosaicvirus(CaIMMV)Cardamom mosaic virus(CdMV)
Carnation vein mottle virus(CVMoV)Carrotthin leaf virus(CTLV)
Cely mosaig virus(CeMV)
Ceralcbiur frsaic virus(CerMV)Chilli veinatmottle(ChiVMV)
SN/T 4877.13—2019
Clover yellow vein Us(CT y)
息服务平
Cocksfoot streak virus(CSV)
Colombian datura virus(CDV)
Commelina mosaic virus(ComMV)Cowpea aphid-borne mosaic virus(CABMV)Cowpea green vein bandingvirus(CGVBV)Dasheen mosaic virus(DsMV)
Datura shoestring virus(DSSV)Endive necrotic mosaie virus(ENMV)Freesia mosaic virus(FreMV)
Gloriosa stripe mosaic virus(GSMV)Groundnut eyespot virus(GEV)Guinea grass mosaic virus(GGMV)Helenium virus Y(HVY)
SN/T4877.13—2019
中文名
天仙子花叶病毒
朱顶红花叶病毒
风信子花叶病毒
暗黄鸢尾花叶病毒
鸢尾轻型花叶病毒
鸢尾重型花叶病毒
石茅高粱花叶病毒
伽蓝菜花叶病毒
魔芋花叶病毒
韭葱黄条病毒
李痘病毒
马铃薯A病毒
马铃薯V病毒
马铃薯Y病毒
Henbane mosaicvirus(HMV)
Hippeastrummosaic virus(HiMV)Hyacinthmosaicvirus(HyaMV)
Iris fulva mosaic virus(IFMV)Irismildmosaicvirus(IMMV)
Iris severe mosaic virus(ISMV)Johnsongrass mosaic virus (JGMV)Kalanchoemosaicvirus(KMV)
Konjac mosaic virus(KoMV)
Leek yellow stripe virus(LYSV)Plum por virus (PPV)
Potato virus.A (PVA)
Potato virusV(PVV)
Potato virus Y(PVY)
行业标准信息服务平台
B.1主要试剂
B.1.1RNA提取试剂
附录B
（规范性附录）
通用RT-PCR检测方法
SN/T4877.13—2019
TRIzolreagent、氯仿、异丙醇、70%乙醇、焦碳酸二乙酯（DEPC)处理的双蒸水。RT-PCR试剂
5XRT缓冲液、dNTP混合液（各10mmol/L）、M-MuLV反转录酶（200U/uL）、RNA酶抑制剂（40U/μL）、10XPCR缓冲液（含20mmol/L的Mg2+）、TaqDNA聚合酶（2.5U/μL）。310×TBE缓冲液（Tris-Borate-EDTA）B.1.3
Tris 碱
NaEDTA
加双蒸水溶解，定容到1L。
B.1.4电泳试剂
琼脂糖、0.5μg/μL的溴化乙绽溶液、10XTBE缓冲液。B.2引物序列与合成
设计的上游引物PotyCP-F和下游引物PotyCP-R位于CP段，上游引物PotyCP-F：5-ATGGTHTGGTGYATHGARAAYGG-3.下游引I物PotyTR：E-TGCTGCKGCYTTCATYTG-3,H言息服务
=A/T/C，Y=C/T，R=A/G.K=T/G,片段约330brB.3总RNA的提取
采用TRIzolReagent方法提取病叶总RNA，具体操作如下：-取0.1g的病叶放人研钵中，加人1mL的TRIzolReagent充分研磨，15℃30℃下静置5min。
在2℃～8℃下12000×g离心10min；把上清液转移到一新管中，并加人0.2mL氯仿盖好管盖，剧烈振荡15sec，15℃～30℃放置3min。-4℃12000×g离心15min，取上层无色水相（约600μL）转移到新管中。在得到的水相溶液中加人等体积异丙醇，混匀，15℃～30℃静置10min。2℃~8℃下12000×g离心10min。弃上清，加人1mL75%乙醇洗涤沉淀。2℃～8℃下7500Xg离心3min，弃尽上清液。室温放置晾干，待乙醇挥发完毕，加入100uL无RNase双蒸水，充分溶解RNA，置于一20℃保存备用。
注：在能够保证总RNA质量的情况下，也可以采用其他植物总RNA提取方法。7
SN/T4877.13—2019
B.4反转录（cDNA合成）
反转录方法：在3μL的总RNA中加人1μL的3端引物（10μmol/L）.于95℃的水浴中处理7min，然后迅速冰浴5min。继续加人5×反转录缓冲液2.5μL、10mmol/L的dNTP混合物0.5μL、M-MuLV反转录酶0.5μL、核糖核酸酶抑制剂RNasin0.5μL、无RNase的双蒸水4.5μL。然后37℃水浴处理1h.95℃水浴10min，自然冷却至室温，作为后续PCR的模板。B.5PCR扩增
在25μL的反应体系中：2.5μL的10XPCR缓冲液（含20mmol/L的Mg2+）.dNTP0.5μL（每利各10mmol/L），TagDNA聚合酶0.5μL（5U/μL），上下游引物各2.5μL（10μmol/L），DNA模板2，双蒸水补足体积。
PCR扩增条件：94℃5min；94℃30s.50℃30s.72℃1s.35个循环；72℃延伸10minB.6琼脂糖凝胶电泳
RT-PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳分析。每个样品取5μL的RT-PCR产物与1μL的6X上样缓冲液混合均匀，并加到置于0.5×TBE缓冲液的1.5%琼脂糖凝胶孔中，然后在一定电压下（如120V）电泳。电泳结束后，放人装有0.5μg/μuL的溴化乙锭（EB)溶液的容器中染色，然后在清水中清洗后，在凝胶成像系统中观察.拍照，并保存照片。B.7结果判定
在阴性对照和空白对照没有产生预期大小条带、阳性对照产生预期大小条带情况下：如果检测样品出现与阳性对照六小一致的条带，PCR检测结果为阳性；如果检测样品没有出现与阳性对照大小一致的条带，PCR检测结果为阴性。准信息服务平台
附录C
（资料性附录）
检疫性马铃薯Y病毒属病毒基因参考序列>Plumpoxvirus（NC_001445.1)
SN/T 4877.13—2019
ATGGTTTGGTGCATAGAGAATGGAACATCCCCGAATATCAATGGAATGTGGGTGATGATGGATGGGGAAACACAAGTGGAGTATCCAATAAAGCCATTGTTGGATCATGCGAAACCCACTTTTAGACAAATTATGGCACATTTCAGTAACGTGGCTGAAGCGTATATTGAAAAACGAAATTATGAAAAAGCATACATGCCAAGGTATGGAATTCAGCGCAACCTGACAGACTACAGCCTCGCCAGATATGCCTTTGATTTTTACGAAATGACTTCAACGACACCCGTACGGGCACGTGAAGCTCATATCCAAATGAAGGCAGCAGCA
>Bananabractmosaicvirus（NC_oo9745.1)ATGGTGTGGTGCATAGAGAATGGGACATCACCAAATTTAAATGGTACATGGAGTATGATGGACAAGGGTGAGCAACTAGTCTACCAGTTAAAGCCCATTATTGAGAACGCTCAGCCTACTTTTCGGCAAATTATGGCACATTTTTCTGATGCCGCTGAGGCATACATAACAATGCGTAATGTCACGGAGAGATATATGCCTAGGTGGGGAGCACTTAGAGGATTGAATGACATAAGCTTAGCCCGATATGCATTTGATTTTTACGTAGTCACATCAAAAACTACGAACAGGGCTAGAGAAGCACACACGCAGATGAAAGCTGCAGCT
>PotatovirusA（NC_004039.1）ATGGTATGGTGCATTGAGAATGGAACCTCTCCAGACATTAATGGAGTTTGGACCATGATGGATAATGAGGAACAAGTCTCATATCCATTAAAACCCATGCTTGACCATGCAAAGCCTTCTTTAAGGCAAATTATGAGACATTTCAGCGCACTCGCAGAGGCGTACATTGAGATGAGAAGTCGTGAGAAACCATACATGCCCAOTATCTCTTCAACGCAACCTGAGAGATCAAAGTTTGGCAAGGTATGCTTTTGATTTCTATGAGATCACTGCAACCACTCCGATCAGAGCCAAAGAG准信息
GCGCATCTGCAGATGAAAGCAGCAGCG
>PotatovirusV（NC_004010.1）ATGGTTTGGTGCATCGAGAATGGAACATCACCGAATGTGATG-G-TTTGGACAATGATGGATGGTGAGGAACAAGTGGAGTTTCCCCTAAAACCGGTGATCGAAATCCGAAGCCTACTTTTAGGCAGATAATGGCACATTTTTCTGATGTGGCTGAGGCGTACATACAGATCCGTAACAAGAGTGAACCATACATGCCACGGTATGGTTTGGTGAGAAATTTGCGGGATAIGAGTTTGGCTCGATATGCATTTGATTTCTATGAGATCACATCCCGCACATCCGTCCGAGCACGAGAGGCTCACATCCAGATGAAGGCAGCAGCA
SN/T4877.13—2019
参考文献
BergerPH,Adams MJ,Barnett OW,Brunt AA.Hammond J,Hill JH,Jordan RL,KashiwazakiS,Rybicki E.Spence N,Stenger DC,Ohki ST,Uyeda I,van Zaayen A,Valkonen J,Vetten HJ(2oo5)Potyviridae.In:Fauquet CM,Mayo MA,Maniloff J,Desselberger U,Ball LA.Virus taxonomy.8thReportoftheICTV.ElsevierAcademicPress,SanDiego.pp819-841行业标准信息服务平台
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中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T4877.13—2019
基因条形码筛查方法
第13部分：检疫性马铃薯Y病毒属病毒DNA barcoding screening method-—Part 13: Qurantine Potyviruses行业标准信息服务平台
2019-09-03发布
中华人民共和国海关总署
2020-03-01实施
SN/T4877《基因条形码筛查方法》分为15个部分：一第1部分：检疫性棒形杆菌；
一一第2部分：检疫性黄单胞菌；一一第3部分：检疫性植原体；
一第4部分：检疫性茎点霉；
一第5部分：检疫性拟茎点霉；
二一第6部分：检疫性嗜酸菌；
一第7部分：检疫性轮枝菌；
二第8部分：检疫性炭疽菌；
一第9部分：检疫性腥黑粉菌；
一第10部分：检疫性疫霉；
一第11部分：检疫性异株苋亚属；一第12部分：黄瓜绿斑驳花叶病毒；第13部分：检疫性马铃薯Y病毒属病毒；一第14部分：检疫性南方菜豆花叶病毒属病毒；第15部分：检疫性叶点霉。
本部分为SN/T4877的第13部分。本部分按照GB/T1.1一20G号给出的规则起草。SN/T 4877.13—2019
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本部分由中华人民共和国海关总黑提出并归口。本部分起草单位：中华人民共和国北京海天中华人民共和国青岛海关准信息服务平台
本部分主要起草人：邓丛良，刘兴亮、张丽蒸、王英侣、赵晓丽、骆卫峰、郑春生。1范围
基因条形码筛查方法
第13部分：检疫性马铃署Y病毒属病毒SN/T4877.13—2019
本部分规定了检疫性马铃薯Y病毒属病毒的基因条形码筛查方法中RNA提取、基因扩增、序列的比对分析及结果判定等。
本部分适用于寄主植物中马铃薯Y病毒属中检疫性病毒的筛查。2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。SN/T2122进出境植物及植物产品检疫抽样。3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。DNA条形码（DNAbarcode）
业标准信息服
DNA条形码是指生物体内能多代表该物种的、标准的、有足够变异的、易扩增且相对较短的DNA片段。
4马铃薯Y病毒属基本信息
中文名称：马铃薯Y病毒属
学名：genusPotyuirus
马铃薯Y病毒属属于马铃薯Y病毒科（Potyviridae），是已知最大的植勿病需之一，占到已知植物病毒的20%以上，其代表种是马铃薯Y病毒（PatatovirusY.PVY）。该属病毒包括香焦苞片花叶病毒（Bananabractmosaicvirus，BBrMV）、李痘病毒（Plumporvirus，PPV）、马铃薯病毒（otatevirusA，PVA)和马铃薯V病毒（PotatovirusA，PVV)4种检疫性植物病毒。有关该病毒属的他信息参见附录A。
5方法原理
以马铃薯Y病毒属病毒的基因组序列中的保守区域设计合成简并引物，建立该病毒属病毒基因条形码筛查方法：并对PCR产物进行序列测定，通过序列分析确定病毒种类。因此，马铃薯Y病毒属的分子生物学特征是制定本检测鉴定方法的主要依据。1
SN/T4877.13—2019
仪器设备与试剂
6.1仪器设备与用具
研磨仪，微量天平（感量：0.001g），PCR仪，电泳仪，水平电泳槽，凝胶成像仪，高速冷冻台式离心机，水浴槽或恒温孵育器，pH计，各种量程的可调移液器（1000μL、200μL、100μL、20μL、10μL、2）等。
6.2试剂
试剂见附录B。
筛查鉴定方法
7.1抽样检查
按照SN/T2122给出的方法进行抽样、取样。7.2RT-PCR方法
按附录B给出的方法，进行通用RT-PCR检测。用已知病毒分离物作阳性对照，健康植物组织作阴性对照，并设置空白对照。
7.3序列测定与分析
将PCR产物回收后，进行克隆、测序，或者PCR产物直接测序（序列测定可由专业的生物公司完成）。把测定的核苷酸序列及翻谨后的氨基酸序列与已知马铃薯Y病毒属的病毒序列（参见附录C)进行比对。采用邻接法（或者利用MGA6的NJ算法）构建系统发育树。注：序列比对可利用NCBI网站上的BA软件进行，网址为http：//ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/标准信
结果判定
8.1RT-PCR方法检测结果为阴性，则判定未检出马铃薯Y病毒属脑毒。8.2RT-PCR方法检测结果为阳性，则进行序列测定与分析：a）如果翻译后氨基酸序列与马铃薯Y病毒属已知病毒氨基酸序列同性最高且大于80%，则判定检出马铃薯Y病毒属病毒（具体病毒种类还需采用其他方法进一步鉴)。b）如果翻译后氨基酸序列与马铃薯Y病毒属已知病毒序列同源性小于80%：如果系统发育分析表明与马铃薯Y病毒属病毒聚为一群，则判定检出马铃薯Y病毒属病毒（具体病毒种类还需采用其他方法进一步鉴定）；注：所检测到的病毒可能属于基因组序列尚未测定的已知病毒或尚未报道的新的病毒种类。如果系统发育分析表明与马铃薯Y病毒属病毒未聚为一群，则判定未检出马铃薯Y病毒属病毒。
c）如果测定的基因组序列与马铃薯Y病毒属中的PPV、PVA、PPV和BBrMV中植物病毒基因组序列同源性最高，则判定筛查出检疫性植物病毒，需要根据具体病毒的检疫鉴定标准方法进行最终鉴定到种。
9结果记录
SN/T4877.13—2019
记录样品信息和检测数据，包括样品来源、植物种类、取样时间与地点，检测时间、方法和结果以及人员签字。RT-PCR凝胶电泳检测应保存电泳照片，测序结果保存测序报告图。10样品保存
检出马铃薯Y病毒属的样品应妥善保存在超低温冰箱中，或冻干后低温保存，并作好登记和标识以备复核。
行业标准信息服务平台
SN/T 4877.13—2019
A.1病毒粒体形态
附录A
（资料性附录）
马铃薯Y病毒属基本信息
马铃薯Y病毒属的病毒粒体为线状粒子，通常长约680～900nm，直径12～15nm.螺旋对称结构，螺距约3.4nm。该属病毒外壳蛋白由一种多肽组成，分子量为28～38kDa，占整个病毒粒体95%的重量（图A.1)。
GenomicRNA
Suwss insmituteofBioiniforrmatic图A.1马铃薯Y病毒属病毒的粒体结构(http://viralzone.expasy.org/all_by_species/50.html)A,2病毒的基因组结构与功能
马铃薯Y病毒属病毒为单分体正单链RNA病毒，全长约10Kb，在RNA基因组的5末端共价连接一个蛋白质，称VPg（Viralprctein，genome-linked），约24kDa，3末端具有二个poly（A）尾，5和3末端各有一段非翻译区（UTR；整个基因组的第一个可读框编码一个大的多聚蛋白（polyprotein），经过翻译加工成具有不同功能的蛋白。力上后的成熟蛋白从N端到C端依次为：P1蛋白、HC-Pro蛋白、P3蛋白、6K1蛋白、CI蛋白、6K2蛋白、VP、生白、NIa蛋白、NIb蛋白和外壳蛋白CP（Hari，1981；DoughertyandCarrington，1988；Murphyetal.，995。其中三个病毒基因组自身编码的蛋白（P1、HC-Pro和NIa蛋白）为具有自我切割和切割其他蛋白能力的白酶，且其切割位点具有一定的特异性（DoughertyandSemler，1993）。最新研究表明，马铃薯Y病手科病还编码一个短的可读框，位于P3服务平台
顺反子中，它由十2读框翻译，其编码产物被称为PIPO（PrettyTnterestPotyuiridaeORF）蛋白(Chungetal.，2008）。马铃薯Y病毒属基因组结构特征见图A.2。5Pg
P1-proHC-proP3
Polyprotein
DViralZon
SlBSwissInstituteofBioinformatC
Ribosomal
frameshift
P1-proHC-proMIVP
Nla-pro
NIbRdRpwww.bzxz.net
CleavagebyNla-pro
图A.2马铃薯Y病毒属基因组结构特征（来源同图A.1）A.3
马铃薯Y病毒属的部分病毒种类
马铃薯Y病毒属的部分病毒种类见表A.1。表A.1
中文名
山姜花叶病毒
六出花花叶病毒
苋叶斑驳病毒
萝藤花叶病毒
菊芋潜隐病毒
天门冬病毒1号
香蕉苞片花叶病毒
菜豆普通花叶坏死病毒
菜豆普通花叶病毒
菜豆黄花叶病毒
甜菜花叶病毒
鬼针草斑驳病毒
虾脊兰轻型花叶病毒
豆蔻花叶病毒
麝香石竹脉斑驳病毒
胡萝卜细叶病毒
芹菜花叶病毒
Ceratobium花叶病毒
南美红辣椒脉斑驳病毒
三叶草黄脉病毒
鸭茅线条病毒
哥伦比亚曼陀罗病毒
鸭跖草花叶病毒
紅豆蚜传花叶病毒
虹豆绿色脉带病毒
芋花叶病毒
曼陀罗带化病毒
苣英菜坏死花叶病毒
香雪兰花叶病毒
嘉兰条斑花叶病毒
花生眼斑病毒
羊草花叶病毒
堆心菊Y病毒
马铃薯Y病毒属的部分病毒种类
Alpinia mosaicvirus(AIpMV)
Alstroemeria mosaic virus(AIMV)Amaranthus leaf mottle virus(AmLMV)Araujia mosaic virus(ArjMV)
Artichoke latent virus(ArLV)Asparagus uirus (AV-1)
Banana bract mosaic virus(BBrMV)Beancommonmosaicnecrosisvirus(BCMNV)Beancommon mosaic virus(BCMV)Bean yellow mosaic virus (BYMV)Beet mosaic virus(BtMV)
Bidens mottle virus (BiMoV)
Calanthemild mosaicvirus(CaIMMV)Cardamom mosaic virus(CdMV)
Carnation vein mottle virus(CVMoV)Carrotthin leaf virus(CTLV)
Cely mosaig virus(CeMV)
Ceralcbiur frsaic virus(CerMV)Chilli veinatmottle(ChiVMV)
SN/T 4877.13—2019
Clover yellow vein Us(CT y)
息服务平
Cocksfoot streak virus(CSV)
Colombian datura virus(CDV)
Commelina mosaic virus(ComMV)Cowpea aphid-borne mosaic virus(CABMV)Cowpea green vein bandingvirus(CGVBV)Dasheen mosaic virus(DsMV)
Datura shoestring virus(DSSV)Endive necrotic mosaie virus(ENMV)Freesia mosaic virus(FreMV)
Gloriosa stripe mosaic virus(GSMV)Groundnut eyespot virus(GEV)Guinea grass mosaic virus(GGMV)Helenium virus Y(HVY)
SN/T4877.13—2019
中文名
天仙子花叶病毒
朱顶红花叶病毒
风信子花叶病毒
暗黄鸢尾花叶病毒
鸢尾轻型花叶病毒
鸢尾重型花叶病毒
石茅高粱花叶病毒
伽蓝菜花叶病毒
魔芋花叶病毒
韭葱黄条病毒
李痘病毒
马铃薯A病毒
马铃薯V病毒
马铃薯Y病毒
Henbane mosaicvirus(HMV)
Hippeastrummosaic virus(HiMV)Hyacinthmosaicvirus(HyaMV)
Iris fulva mosaic virus(IFMV)Irismildmosaicvirus(IMMV)
Iris severe mosaic virus(ISMV)Johnsongrass mosaic virus (JGMV)Kalanchoemosaicvirus(KMV)
Konjac mosaic virus(KoMV)
Leek yellow stripe virus(LYSV)Plum por virus (PPV)
Potato virus.A (PVA)
Potato virusV(PVV)
Potato virus Y(PVY)
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B.1主要试剂
B.1.1RNA提取试剂
附录B
（规范性附录）
通用RT-PCR检测方法
SN/T4877.13—2019
TRIzolreagent、氯仿、异丙醇、70%乙醇、焦碳酸二乙酯（DEPC)处理的双蒸水。RT-PCR试剂
5XRT缓冲液、dNTP混合液（各10mmol/L）、M-MuLV反转录酶（200U/uL）、RNA酶抑制剂（40U/μL）、10XPCR缓冲液（含20mmol/L的Mg2+）、TaqDNA聚合酶（2.5U/μL）。310×TBE缓冲液（Tris-Borate-EDTA）B.1.3
Tris 碱
NaEDTA
加双蒸水溶解，定容到1L。
B.1.4电泳试剂
琼脂糖、0.5μg/μL的溴化乙绽溶液、10XTBE缓冲液。B.2引物序列与合成
设计的上游引物PotyCP-F和下游引物PotyCP-R位于CP段，上游引物PotyCP-F：5-ATGGTHTGGTGYATHGARAAYGG-3.下游引I物PotyTR：E-TGCTGCKGCYTTCATYTG-3,H言息服务
=A/T/C，Y=C/T，R=A/G.K=T/G,片段约330brB.3总RNA的提取
采用TRIzolReagent方法提取病叶总RNA，具体操作如下：-取0.1g的病叶放人研钵中，加人1mL的TRIzolReagent充分研磨，15℃30℃下静置5min。
在2℃～8℃下12000×g离心10min；把上清液转移到一新管中，并加人0.2mL氯仿盖好管盖，剧烈振荡15sec，15℃～30℃放置3min。-4℃12000×g离心15min，取上层无色水相（约600μL）转移到新管中。在得到的水相溶液中加人等体积异丙醇，混匀，15℃～30℃静置10min。2℃~8℃下12000×g离心10min。弃上清，加人1mL75%乙醇洗涤沉淀。2℃～8℃下7500Xg离心3min，弃尽上清液。室温放置晾干，待乙醇挥发完毕，加入100uL无RNase双蒸水，充分溶解RNA，置于一20℃保存备用。
注：在能够保证总RNA质量的情况下，也可以采用其他植物总RNA提取方法。7
SN/T4877.13—2019
B.4反转录（cDNA合成）
反转录方法：在3μL的总RNA中加人1μL的3端引物（10μmol/L）.于95℃的水浴中处理7min，然后迅速冰浴5min。继续加人5×反转录缓冲液2.5μL、10mmol/L的dNTP混合物0.5μL、M-MuLV反转录酶0.5μL、核糖核酸酶抑制剂RNasin0.5μL、无RNase的双蒸水4.5μL。然后37℃水浴处理1h.95℃水浴10min，自然冷却至室温，作为后续PCR的模板。B.5PCR扩增
在25μL的反应体系中：2.5μL的10XPCR缓冲液（含20mmol/L的Mg2+）.dNTP0.5μL（每利各10mmol/L），TagDNA聚合酶0.5μL（5U/μL），上下游引物各2.5μL（10μmol/L），DNA模板2，双蒸水补足体积。
PCR扩增条件：94℃5min；94℃30s.50℃30s.72℃1s.35个循环；72℃延伸10minB.6琼脂糖凝胶电泳
RT-PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳分析。每个样品取5μL的RT-PCR产物与1μL的6X上样缓冲液混合均匀，并加到置于0.5×TBE缓冲液的1.5%琼脂糖凝胶孔中，然后在一定电压下（如120V）电泳。电泳结束后，放人装有0.5μg/μuL的溴化乙锭（EB)溶液的容器中染色，然后在清水中清洗后，在凝胶成像系统中观察.拍照，并保存照片。B.7结果判定
在阴性对照和空白对照没有产生预期大小条带、阳性对照产生预期大小条带情况下：如果检测样品出现与阳性对照六小一致的条带，PCR检测结果为阳性；如果检测样品没有出现与阳性对照大小一致的条带，PCR检测结果为阴性。准信息服务平台
附录C
（资料性附录）
检疫性马铃薯Y病毒属病毒基因参考序列>Plumpoxvirus（NC_001445.1)
SN/T 4877.13—2019
ATGGTTTGGTGCATAGAGAATGGAACATCCCCGAATATCAATGGAATGTGGGTGATGATGGATGGGGAAACACAAGTGGAGTATCCAATAAAGCCATTGTTGGATCATGCGAAACCCACTTTTAGACAAATTATGGCACATTTCAGTAACGTGGCTGAAGCGTATATTGAAAAACGAAATTATGAAAAAGCATACATGCCAAGGTATGGAATTCAGCGCAACCTGACAGACTACAGCCTCGCCAGATATGCCTTTGATTTTTACGAAATGACTTCAACGACACCCGTACGGGCACGTGAAGCTCATATCCAAATGAAGGCAGCAGCA
>Bananabractmosaicvirus（NC_oo9745.1)ATGGTGTGGTGCATAGAGAATGGGACATCACCAAATTTAAATGGTACATGGAGTATGATGGACAAGGGTGAGCAACTAGTCTACCAGTTAAAGCCCATTATTGAGAACGCTCAGCCTACTTTTCGGCAAATTATGGCACATTTTTCTGATGCCGCTGAGGCATACATAACAATGCGTAATGTCACGGAGAGATATATGCCTAGGTGGGGAGCACTTAGAGGATTGAATGACATAAGCTTAGCCCGATATGCATTTGATTTTTACGTAGTCACATCAAAAACTACGAACAGGGCTAGAGAAGCACACACGCAGATGAAAGCTGCAGCT
>PotatovirusA（NC_004039.1）ATGGTATGGTGCATTGAGAATGGAACCTCTCCAGACATTAATGGAGTTTGGACCATGATGGATAATGAGGAACAAGTCTCATATCCATTAAAACCCATGCTTGACCATGCAAAGCCTTCTTTAAGGCAAATTATGAGACATTTCAGCGCACTCGCAGAGGCGTACATTGAGATGAGAAGTCGTGAGAAACCATACATGCCCAOTATCTCTTCAACGCAACCTGAGAGATCAAAGTTTGGCAAGGTATGCTTTTGATTTCTATGAGATCACTGCAACCACTCCGATCAGAGCCAAAGAG准信息
GCGCATCTGCAGATGAAAGCAGCAGCG
>PotatovirusV（NC_004010.1）ATGGTTTGGTGCATCGAGAATGGAACATCACCGAATGTGATG-G-TTTGGACAATGATGGATGGTGAGGAACAAGTGGAGTTTCCCCTAAAACCGGTGATCGAAATCCGAAGCCTACTTTTAGGCAGATAATGGCACATTTTTCTGATGTGGCTGAGGCGTACATACAGATCCGTAACAAGAGTGAACCATACATGCCACGGTATGGTTTGGTGAGAAATTTGCGGGATAIGAGTTTGGCTCGATATGCATTTGATTTCTATGAGATCACATCCCGCACATCCGTCCGAGCACGAGAGGCTCACATCCAGATGAAGGCAGCAGCA
SN/T4877.13—2019
参考文献
BergerPH,Adams MJ,Barnett OW,Brunt AA.Hammond J,Hill JH,Jordan RL,KashiwazakiS,Rybicki E.Spence N,Stenger DC,Ohki ST,Uyeda I,van Zaayen A,Valkonen J,Vetten HJ(2oo5)Potyviridae.In:Fauquet CM,Mayo MA,Maniloff J,Desselberger U,Ball LA.Virus taxonomy.8thReportoftheICTV.ElsevierAcademicPress,SanDiego.pp819-841行业标准信息服务平台
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