SN/T 4876.7-2019
基本信息
标准号： SN/T 4876.7-2019
中文名称：DNA条形码方法 第7部分：一品红亚属
标准类别：商检行业标准(SN)
标准状态：现行
出版语种：简体中文
下载格式：.zip .pdf
下载大小：17516015
标准分类号
关联标准
出版信息
相关单位信息
标准简介
标准号：SN/T 4876.7-2019
标准名称：DNA条形码方法 第7部分：一品红亚属
英文名称：Method for DNA barcode--Part 7: Subgen, Poinsettia
标准格式：PDF
发布时间：2019-09-03
实施时间：2020-09-03
标准大小：11738K
标准介绍：SN/T4876如NA条形码方法》分为7个部分：
一一第1部分：检疫性乳白蚁
-第2部分：检疫性断眼天牛
第3部分：检疫性卷蛾
第4部分：检疫性高粱属
一第5部分：曼陀罗属
一第6部分：瘤背豆象属；
一第7部分：一品红亚属
本部分为SN/T4876的第7部分
本部分按照GB/T1.1-2009给出的规则起草
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任
本部分由中华人民共和国海关总署提出并归口 本部分规定了大戟属一品红亚属常见种的DNA条形码检测方法本部分适用于大戟属一品红亚属常见种的DNA条形码的测定、结果的比对分析与判定
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本
文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件GB/T32142齿裂大戟检疫鉴定方法
3术语与定义
下列术语与定义适用于本文件
3.
DNA条形码 DNA barcodes
DNA条形码是一段短的、标准化的基因片段，用于区分不同的物种。该片段在种间存在明显的遗传变异和分化并容易进行PCR扩增
标准名称：DNA条形码方法 第7部分：一品红亚属
英文名称：Method for DNA barcode--Part 7: Subgen, Poinsettia
标准格式：PDF
发布时间：2019-09-03
实施时间：2020-09-03
标准大小：11738K
标准介绍：SN/T4876如NA条形码方法》分为7个部分：
一一第1部分：检疫性乳白蚁
-第2部分：检疫性断眼天牛
第3部分：检疫性卷蛾
第4部分：检疫性高粱属
一第5部分：曼陀罗属
一第6部分：瘤背豆象属；
一第7部分：一品红亚属
本部分为SN/T4876的第7部分
本部分按照GB/T1.1-2009给出的规则起草
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任
本部分由中华人民共和国海关总署提出并归口 本部分规定了大戟属一品红亚属常见种的DNA条形码检测方法本部分适用于大戟属一品红亚属常见种的DNA条形码的测定、结果的比对分析与判定
2规范性引用文件
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文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件GB/T32142齿裂大戟检疫鉴定方法
3术语与定义
下列术语与定义适用于本文件
3.
DNA条形码 DNA barcodes
DNA条形码是一段短的、标准化的基因片段，用于区分不同的物种。该片段在种间存在明显的遗传变异和分化并容易进行PCR扩增
标准图片预览
标准内容
ICS65.020.01
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T4876.7—2019
DNA条形码方法
第7部分：一品红亚属
Method for DNA barcode-Part 7.Subgen.Poinsettia行业标准信息服务平台
2019-09-03发布
中华人民共和国海关总署
2020-03-01实施
SN/T4876《DNA条形码方法》分为7个部分：第1部分：检疫性乳白蚁；bZxz.net
一第2部分：检疫性断眼天牛；
一一第3部分：检疫性卷蛾；
一第4部分：检疫性高梁属；
一第5部分：曼陀罗属；
一第6部分：瘤背豆象属；
一第7部分：一品红亚属。
本部分为SN/T4876的第7部分。
本部分按照GB/T1.12009给出的规则起草。SN/T4876.7—2019
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本部分由中华人民共和国海关总署提出并归口。本部分起草单位：宁波检验检疫科学技术研究院，中华人民共和国南京海关动植物与食品检测中心，中华人民共和国上海海关动植物与食品检验检疫技术中心，中华人民共和国广州海关，中国检验检疫科学研究院，中华人民共和国福州海关，中华人民共和国青岛海关。本部分起草人：徐瑛，伏建国，印丽萍，张吉红，张慧丽，傅艺宁，昊海荣，范晓红，于文涛，宋涛。行业标准信息服务平台
1范围
DNA条形码方法第7部分：一品红亚属本部分规定了大戟属一品红亚属常见种的DNA条形码检测方法。SN/T4876.7—2019
本部分适用于大戟属一品红亚属常见种的DNA条形码的测定、结果的比对分析与判定。2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T32142齿裂大戟检疫鉴定方法3术语与定义
下列术语与定义适用于本文件。3.1
DNA条形码
DNAbarcodes
DNA条形码是一段短的、标准化的基因片段，用于区分不同的物种。该片段在种间存在明显的遗传变异和分化并容易进行PCR扩增3.2
内部转录间隔区2interaltranscrhedspacer2，简称ITS2在真核生物核糖体RNA中，18SrRA和28SrRNA基因间隔序列称为（ITS），其所在的核糖体基因组序列从5到3依次为：外部转录间隔区（xiernaltranscribedspacer，ETS）、18S基因、内部转录间隔区1（ITS1）、5.8S基因、内部转录间隔区2（S2）、28S基因和基因间隔序列（intergenicspacer，IGS）。核糖体RNA中的18S、5.8S和28S的基因组序到在大多数生物中趋于保守，在生物种间变化小，而内转录间隔区ITSI和ITS2作为非码区，承受的选力较小，相对变化较大，并且能够提供详尽的系统学分析所需要的可遗传性状。本标准选用引物的扩增区包括5.8S部分序列，ITS2全序列和28S部分序列，扩增总长度约449bp.其中齿裂大戟ITS2长度219bp3.3
ndhF基因
又称叶绿体NADH脱氢酶复合体F亚基基因ChloroplastNADHdehydrogenase subu，位于叶绿体基因组的小单拷贝区，定位于类囊体NDH复合体疏水臂末端。为编码假定的叶绿体NADH脱氢酶的一个亚基。本标准扩增区是位于ndhF的538和1318间的一段，扩增去除引物后长度约727bp。
4一品红亚属基本信息
分类地位：大戟科Euphorbiaceae，大载属EuphorbiaL.，一品红亚属Poinsettia。大戟属是被子植物中特大属之一，约2000种，遍布世界各地，其中以非洲和中南美洲较多；我国检1
SN/T4876.7—2019
疫性有害生物名单中大戟属仅一种一齿裂大戟（EuphorbiadentataMichx），归人一品红亚属，根据Mayfield(1997)对大载属一品红亚属的分类处理，该亚属在全球约24种，大部分为局部分布，有的甚至为稀有物种除齿裂大戟外常见种还包括戴维大戟（E.dauidiiSubils），猩猩草（E.cyathophoraMurray），白苞猩猩草（E.heterophyllaL.）、一品红（E.pulcherrimaWilldenowexKlotzsch）。其中齿裂大戟、戴维大戟和白苞猩猩草为有害杂草，一品红和猩猩草为园林植物。近似种信息详见GB/T32142。5方法原理
根据植物ITS2和ndhF的序列特征，应用DNA条形码技术对大戟属一品红亚属常见种进行鉴定。
仪器设备和主要试剂
6.1仪器设备与用具
PCR仪、电子天平（感量0.001g）、冷冻混合研磨仪、电泳仪、凝胶成像系统、高速冷冻离心机、解部镜、涡旋振荡器、冰箱、水浴锅、测序仪、高压灭菌锅、可调式微量移液器（2uL、10uL、20μL、100L、200μL，1000uL)及相应吸头、离心管、PCR管等。6.2主要试剂
除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂，植物基因组提取试剂盒、超纯水、DNAMarker、琼脂糖、核酸凝胶染料、液氮、脱氧核糖核苷三磷酸（dNTPs）、Taq酶、10XPCR缓冲液、10X加样缓冲液，50XTAE缓冲液、引物（见附录B.1）。CTAB法行业标准
提取试剂（参见附录A.1）。
7筛查鉴定方法
7.1样品的处理
样品鉴定见GB/T32142。将需要提取DNA的植物材料，种子为1粒-2粒，硅胶干燥的叶片为慧服务邮
10mg）放入2mL圆底离心管中，每个管内加2粒钢珠，液氨#用冷冻混合研磨仪研磨3min（30次/秒）。
7.2DNA制备
使用商品化的植物基因组提取试剂盒或采用改良的CTAB法提取植物基因组总DNA。改良的百
CTAB法方法参见附录A.2。
7.3DNA条形码基因片段扩增
利用ITS2和ndhF基因的通用引物进行ITS2和ndhF基因序列扩增，引物序列、反应体系和反应条件见附录B。
7.4PCR产物的检测
取PCR产物5uL，1.5%琼脂糖凝胶电泳，核酸凝胶染料染色，在凝胶成像系统观察、拍照。ITS2引物对可获得约450bp左右的扩增片段，ndhF引物对可获得约770bp的扩增片段。2
7.5测序与序列处理
SN/T4876.7—2019
取剩余的PCR扩增产物45uL，经1.5%琼脂糖凝胶电泳分离，目的片段使用DNA产物纯化试剂盒纯化并测序。测序引物与PCR扩增引物相同。测序结果利用序列拼接软件进行拼接编辑，对比峰图，判断序列方向，去除测序引物序列，两端测序质量Q值<20的序列去除。
8结果判定
8.1中国检疫性有害生物DNA条形码鉴定系统判定登录中国检疫性有害生物DNA条形码鉴定系统（http：//gbol.org.cn）.点击物种识别”导航条，进入物种识别页面。在鉴定框内输人FASTA格式（或纯文本格式）序列后，点击“提交鉴定”，系统进行BLAST后，自动生成鉴定结果（参见附录C）。当相似度最高的1O条序列为相同物种，最大相似度在99%以上，ITS2和ndhF结果相符，且形态学鉴定与GB/T32142一致，可判定为该物种；否则请辅以其他鉴定方法。
8.2植物有害生物检疫鉴定系统判定登陆植物有害生物检疫鉴定系统（http：//exoticorganism.com），使用基因条码分析软件对查询序列进行分析比对，对符合该类群鉴定特征的且相似度为100%的物种判定为该未知种。ITS2和ndhF结果相符，且形态学鉴定与GB/T32142一致，可判定为该物种。否则请辅以其他鉴定方法。“植物有害生物检疫鉴定系统”操作方法参见附录D。8.3国际通用数据库判定
登录GenBank数据库BLAST鉴定系统（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）对获得的ITS2和ndhF序列进行比对，在BLAST结具+查看序列相似性最高的物种，相似度最高的10条序列为相同物种，最大相似度在99%以上，ITS2和ndhF果相符，且形态学鉴定与GB/T32142一致，可判定为唯信息服
该物种。齿裂大戟及常见近似种基因序列信息见参见录E9标本与原始数据保存
9.1标本保存
将最终鉴定为检疫性目标物种的植物组织或DNA置于一20℃低温保存。明来源，寄主，采集时间、地点及采集者，保存期为1年，以备复验，如涉及到贸易纠纷则须保存到纠纷解决完煤。9.2原始数据保存
样品检测结束后，其原始记录单（应包括DNA序列及测序峰图等内容）和检验报告须归档，妥善保管，以备复验、谈判和仲裁。
SN/T4876.7—2019
A.1试剂
CTAB提取液
附录A
（资料性附录）
DNA提取方法（改良CTAB法）
CTAB20g/L.氯化钠1.4mol/L.Tris0.1mol/L(pH8.0).EDTA0.02mol/L(pH8.0).高压灭菌备用。
A.1.2TE缓冲液（pH8.0）
分别加人1mol/LTris-HCL（pH8.0）10mL和0.5mol/LEDTA（pH8.0）溶液2mL，加水定容至1000mL。在103.5kPa（121C）条件下灭菌20min，A.1.3三氯甲烷：异戊醇溶液
将三氯甲烷和异戊醇按照24：1的体积比混合。A.1.4异丙醇。
A.1.570%乙醇（体积分数）。
A.2提取步骤
在含植物粉未的2ml离心管加入已预热至65℃的600μLCTAB提取液，充分振荡混匀；65℃水浴30min，不时颠倒混匀；10000r/min离心5min，取上清，等体积三氯甲烷：异戊醇（V：V=24：1）抽提一次：取上清，再加人等体程异丙醇，4℃沉淀10min以上，然后12000r/min离心10min，弃上清：70%乙醇洗涤1～2次，晾干片，加人60uLTE缓冲液溶解沉淀，保存于一20℃冰箱冷冻备用。标准信息服务平台
引物序列
引物序列见表B.1。
目标基因
PCR反应体系及参数
附录B
（规范性附录）
ITS2/ndhF序列扩增流程
引物序列
引物序列
GCATCGATGAAGAACGCAGC
GACGCTTCTCCAGACTACAAT
TTGTAACTAATCGTGTAGG
CGAAACATATAAAATGCGTTAA
PCR反应体系及参数见表B.2。
dNTP混合物
PCR反应体系及参数
储备液浓度
5mmol/L
SN/T 4876.7—2019
扩增片段大小（bp）
约450bp
约770bp
50μL反应体系加样体积（μL）4.0
美信#服务
10×PCR缓冲液（含Mg+）
10pmol
正向引物
反向引物
10pmol/L
5U/μL
DNA模板
0.3 ug/μL~6ug/μL
注：该引物为通用引物，每次PCR反应必须做空白对照，以确认是否污染。可用商品化的PCRPremix。ITS2基因PCR反应程序
ITS2基因PCR反应程序见表B.3
SN/T4876.7—2019
预变性
ndhF基因PCR反应程序
ITS2基因PCR反应程序
反应温度（℃）
ndhF基因PCR反应程序见表B.4。表B.4
预变性
ndhF基因PCR反应程序
反应温度（℃）
循环数
循环数
行业标准信息服务平台
附录C
（资料性附录）
中国检疫性有害生物DNA条形码鉴定系统操作方法中国检疫性有害生物DNA条形码鉴定系统操作方法见图C.1C.2中国检疫性有害生物DNA条形码鉴定系统DNABARCODEAPPRAISALSYSTEMON CHINESEQUARANTINEPESTS首页
植物有言生物
声前将定
翰入fasta格式的序列
动物瘦病
el#书&ns
医学媒介
TAGCCATTGGACTTEAGTTGTTGEATGHGCACACCATATATLACTEMGGTMGATGTGATACACTTTCEG
GGGTMTTMCCT
提文鉴定
收蒙|进入管理系统
物种识只别
凭证标本
SN/T 4876.7—2019
关于我们
GAGCTTATTTCACCTCTGCAACTATAATTATTGCTGTTCCTACAGGATTAAAGLCTTTMGATGATTAGCTET
ATTTETTA
TTHTAE
CATTTAAE
物种识别页面
中国检疫性有害生物DNA条形码鉴定系统DNA BARCODEAPPRAISAYSTEM ONCHINESEQUARANTINEPESTS营页
原列操码
扭物有来
动物瘦病
手学联
相供样本整定结单
ClQ12844-15:Angiospermae Dicotyledons Euphorbiales FpiroraC
CIO12843-15Ar
Dicotyledons
iales Euphorbi
uohebia
CIQ12842-15 Angiospermae Dicotyledons Euphorbiales EuphorbiaceaeEuphorbiaCID1za4i-is Angiospermae Dicotyledons Euphorbiales EuphorbiaceaeFuphorbia
CIQ12840-15AngiosperimaeDicotyledonsEuphorbialesEuphorbiaceaeEuphorbia
CIQ12839-15 Angiospermae Dicotyledons Euphorbiales EuphorbiaceaeEuphorbia
CIO12838-15Ar
Dicotyledon
alesEuph
Euphorbia
物件识别
Euphorbia
cyathophora
Euerhorbia
cyathophora
Euphorbia
cyathophora
Euphorbia
cyathophora
Euphorbia
鉴定结果页面
ATATTGATATATT
您|进入它理系送
年证标本
谨传标记
关于我们
E-value
SN/T4876.7—2019
附录D
（资料性附录）
基因条形码分析软件操作方法
登陆植物有害生物检疫鉴定系统（http：//exoticorganism.com），首页选择“基因条码”模块在“输入比对的序列”窗口中粘贴查询序列。点击“比对”，软件会在数据库范围内比对，输出物种鉴定结果。结果中相似性最高的条码序列对应分类阶元为查询序列所属分类阶元。在“更多比对结果”里，点击“开始对比”，将符合该类群鉴定特征的且相似度为100%的物种判定为该未知种以齿裂大载Euphorbiadentata为例，在“输入比对的序列”窗口中粘贴ITS2基因片段，点击“比对”，结果见图D.1，相似性最高的条码序列对应分类阶元为大戟属，相似性为100%。在这一栏点击“开始对比”，结果见图D.2，相似度为10o%的序列对应物种为齿裂大戟Euphorbiadentata，即可判定查询序列为该物种。
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数字标本丨辅助鉴定平台丨基因条码丨基因库丨标本库丨有害生物查询丨在线留言「系统管理服新公告：
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输入比白序列：TGCAGGATCCCGCGAACCATCGAGTCTTTGAACGCAAGTTGCGCCCAAAGCCTTTTGGCGGAGGGCACGTCTGCCTGGGTGTCACTCAATCGTTGCCCCCAAACTCTT
TCTGTTGAAAGGGGGATTGTTGGGGCGGATGATGGCCTCCCGTGGGCTTATTGCCTGCGGTTGACCTAAATGTCCGGTCCGCGGCAAAGACGCCACGCCAATCGGTGGTTGTATGACCCTCGCATAACGTCGTGTGTGTTCGGATGCTGTC序比对结
号果(%)
分类阶元
100大韩属Euphorbia
更多详比
在羊比树指果
年准杂妈负种
标准条码名称
大戟属Euphorbia
上游引物
GCATCGATGAAGAACGCAGC
下游引物
GACGCTTCTCCAGACTACAAT
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齿裂大戟Ephorb.cdentata在条形码数据库分类阶元中的比对结果Ree
宝热卷大带
HATAACAAG
XCEL格式下标注系码能式
系科学出刷
自各真惠生物验定停证比对结果如+()P13
黑定特证学出别EXCEL服式下驱定证路式批焱
TTCTCCAGACTAC
14FIEP
GPI7PInPES72nr2
179272379
2齿裂大戟Euphorbiadentata在一品红亚属条形码数据库中的比对结果图D.2
E.1一品红亚属常见种序列信息
附录E
（资料性附录）
一品红亚属常见种序列
一品红亚属常见种序列信息见表E.1。E.1
E.dentata
E.davidii
E.cyathophora
E.pulcherrima
E.heterophylla
一品红亚属常见种序列信息
GenBank登陆号
KU128389、KU128390
KU128394、KU128395、KU128396KU128387、KU128388
KU128397
KU128391、KU128392、KU128393SN/T4876.7—2019
KT991143
KT991144
KT991147
KT991146
KT991145
行业标准信息服务平台
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中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T4876.7—2019
DNA条形码方法
第7部分：一品红亚属
Method for DNA barcode-Part 7.Subgen.Poinsettia行业标准信息服务平台
2019-09-03发布
中华人民共和国海关总署
2020-03-01实施
SN/T4876《DNA条形码方法》分为7个部分：第1部分：检疫性乳白蚁；bZxz.net
一第2部分：检疫性断眼天牛；
一一第3部分：检疫性卷蛾；
一第4部分：检疫性高梁属；
一第5部分：曼陀罗属；
一第6部分：瘤背豆象属；
一第7部分：一品红亚属。
本部分为SN/T4876的第7部分。
本部分按照GB/T1.12009给出的规则起草。SN/T4876.7—2019
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本部分由中华人民共和国海关总署提出并归口。本部分起草单位：宁波检验检疫科学技术研究院，中华人民共和国南京海关动植物与食品检测中心，中华人民共和国上海海关动植物与食品检验检疫技术中心，中华人民共和国广州海关，中国检验检疫科学研究院，中华人民共和国福州海关，中华人民共和国青岛海关。本部分起草人：徐瑛，伏建国，印丽萍，张吉红，张慧丽，傅艺宁，昊海荣，范晓红，于文涛，宋涛。行业标准信息服务平台
1范围
DNA条形码方法第7部分：一品红亚属本部分规定了大戟属一品红亚属常见种的DNA条形码检测方法。SN/T4876.7—2019
本部分适用于大戟属一品红亚属常见种的DNA条形码的测定、结果的比对分析与判定。2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T32142齿裂大戟检疫鉴定方法3术语与定义
下列术语与定义适用于本文件。3.1
DNA条形码
DNAbarcodes
DNA条形码是一段短的、标准化的基因片段，用于区分不同的物种。该片段在种间存在明显的遗传变异和分化并容易进行PCR扩增3.2
内部转录间隔区2interaltranscrhedspacer2，简称ITS2在真核生物核糖体RNA中，18SrRA和28SrRNA基因间隔序列称为（ITS），其所在的核糖体基因组序列从5到3依次为：外部转录间隔区（xiernaltranscribedspacer，ETS）、18S基因、内部转录间隔区1（ITS1）、5.8S基因、内部转录间隔区2（S2）、28S基因和基因间隔序列（intergenicspacer，IGS）。核糖体RNA中的18S、5.8S和28S的基因组序到在大多数生物中趋于保守，在生物种间变化小，而内转录间隔区ITSI和ITS2作为非码区，承受的选力较小，相对变化较大，并且能够提供详尽的系统学分析所需要的可遗传性状。本标准选用引物的扩增区包括5.8S部分序列，ITS2全序列和28S部分序列，扩增总长度约449bp.其中齿裂大戟ITS2长度219bp3.3
ndhF基因
又称叶绿体NADH脱氢酶复合体F亚基基因ChloroplastNADHdehydrogenase subu，位于叶绿体基因组的小单拷贝区，定位于类囊体NDH复合体疏水臂末端。为编码假定的叶绿体NADH脱氢酶的一个亚基。本标准扩增区是位于ndhF的538和1318间的一段，扩增去除引物后长度约727bp。
4一品红亚属基本信息
分类地位：大戟科Euphorbiaceae，大载属EuphorbiaL.，一品红亚属Poinsettia。大戟属是被子植物中特大属之一，约2000种，遍布世界各地，其中以非洲和中南美洲较多；我国检1
SN/T4876.7—2019
疫性有害生物名单中大戟属仅一种一齿裂大戟（EuphorbiadentataMichx），归人一品红亚属，根据Mayfield(1997)对大载属一品红亚属的分类处理，该亚属在全球约24种，大部分为局部分布，有的甚至为稀有物种除齿裂大戟外常见种还包括戴维大戟（E.dauidiiSubils），猩猩草（E.cyathophoraMurray），白苞猩猩草（E.heterophyllaL.）、一品红（E.pulcherrimaWilldenowexKlotzsch）。其中齿裂大戟、戴维大戟和白苞猩猩草为有害杂草，一品红和猩猩草为园林植物。近似种信息详见GB/T32142。5方法原理
根据植物ITS2和ndhF的序列特征，应用DNA条形码技术对大戟属一品红亚属常见种进行鉴定。
仪器设备和主要试剂
6.1仪器设备与用具
PCR仪、电子天平（感量0.001g）、冷冻混合研磨仪、电泳仪、凝胶成像系统、高速冷冻离心机、解部镜、涡旋振荡器、冰箱、水浴锅、测序仪、高压灭菌锅、可调式微量移液器（2uL、10uL、20μL、100L、200μL，1000uL)及相应吸头、离心管、PCR管等。6.2主要试剂
除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂，植物基因组提取试剂盒、超纯水、DNAMarker、琼脂糖、核酸凝胶染料、液氮、脱氧核糖核苷三磷酸（dNTPs）、Taq酶、10XPCR缓冲液、10X加样缓冲液，50XTAE缓冲液、引物（见附录B.1）。CTAB法行业标准
提取试剂（参见附录A.1）。
7筛查鉴定方法
7.1样品的处理
样品鉴定见GB/T32142。将需要提取DNA的植物材料，种子为1粒-2粒，硅胶干燥的叶片为慧服务邮
10mg）放入2mL圆底离心管中，每个管内加2粒钢珠，液氨#用冷冻混合研磨仪研磨3min（30次/秒）。
7.2DNA制备
使用商品化的植物基因组提取试剂盒或采用改良的CTAB法提取植物基因组总DNA。改良的百
CTAB法方法参见附录A.2。
7.3DNA条形码基因片段扩增
利用ITS2和ndhF基因的通用引物进行ITS2和ndhF基因序列扩增，引物序列、反应体系和反应条件见附录B。
7.4PCR产物的检测
取PCR产物5uL，1.5%琼脂糖凝胶电泳，核酸凝胶染料染色，在凝胶成像系统观察、拍照。ITS2引物对可获得约450bp左右的扩增片段，ndhF引物对可获得约770bp的扩增片段。2
7.5测序与序列处理
SN/T4876.7—2019
取剩余的PCR扩增产物45uL，经1.5%琼脂糖凝胶电泳分离，目的片段使用DNA产物纯化试剂盒纯化并测序。测序引物与PCR扩增引物相同。测序结果利用序列拼接软件进行拼接编辑，对比峰图，判断序列方向，去除测序引物序列，两端测序质量Q值<20的序列去除。
8结果判定
8.1中国检疫性有害生物DNA条形码鉴定系统判定登录中国检疫性有害生物DNA条形码鉴定系统（http：//gbol.org.cn）.点击物种识别”导航条，进入物种识别页面。在鉴定框内输人FASTA格式（或纯文本格式）序列后，点击“提交鉴定”，系统进行BLAST后，自动生成鉴定结果（参见附录C）。当相似度最高的1O条序列为相同物种，最大相似度在99%以上，ITS2和ndhF结果相符，且形态学鉴定与GB/T32142一致，可判定为该物种；否则请辅以其他鉴定方法。
8.2植物有害生物检疫鉴定系统判定登陆植物有害生物检疫鉴定系统（http：//exoticorganism.com），使用基因条码分析软件对查询序列进行分析比对，对符合该类群鉴定特征的且相似度为100%的物种判定为该未知种。ITS2和ndhF结果相符，且形态学鉴定与GB/T32142一致，可判定为该物种。否则请辅以其他鉴定方法。“植物有害生物检疫鉴定系统”操作方法参见附录D。8.3国际通用数据库判定
登录GenBank数据库BLAST鉴定系统（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）对获得的ITS2和ndhF序列进行比对，在BLAST结具+查看序列相似性最高的物种，相似度最高的10条序列为相同物种，最大相似度在99%以上，ITS2和ndhF果相符，且形态学鉴定与GB/T32142一致，可判定为唯信息服
该物种。齿裂大戟及常见近似种基因序列信息见参见录E9标本与原始数据保存
9.1标本保存
将最终鉴定为检疫性目标物种的植物组织或DNA置于一20℃低温保存。明来源，寄主，采集时间、地点及采集者，保存期为1年，以备复验，如涉及到贸易纠纷则须保存到纠纷解决完煤。9.2原始数据保存
样品检测结束后，其原始记录单（应包括DNA序列及测序峰图等内容）和检验报告须归档，妥善保管，以备复验、谈判和仲裁。
SN/T4876.7—2019
A.1试剂
CTAB提取液
附录A
（资料性附录）
DNA提取方法（改良CTAB法）
CTAB20g/L.氯化钠1.4mol/L.Tris0.1mol/L(pH8.0).EDTA0.02mol/L(pH8.0).高压灭菌备用。
A.1.2TE缓冲液（pH8.0）
分别加人1mol/LTris-HCL（pH8.0）10mL和0.5mol/LEDTA（pH8.0）溶液2mL，加水定容至1000mL。在103.5kPa（121C）条件下灭菌20min，A.1.3三氯甲烷：异戊醇溶液
将三氯甲烷和异戊醇按照24：1的体积比混合。A.1.4异丙醇。
A.1.570%乙醇（体积分数）。
A.2提取步骤
在含植物粉未的2ml离心管加入已预热至65℃的600μLCTAB提取液，充分振荡混匀；65℃水浴30min，不时颠倒混匀；10000r/min离心5min，取上清，等体积三氯甲烷：异戊醇（V：V=24：1）抽提一次：取上清，再加人等体程异丙醇，4℃沉淀10min以上，然后12000r/min离心10min，弃上清：70%乙醇洗涤1～2次，晾干片，加人60uLTE缓冲液溶解沉淀，保存于一20℃冰箱冷冻备用。标准信息服务平台
引物序列
引物序列见表B.1。
目标基因
PCR反应体系及参数
附录B
（规范性附录）
ITS2/ndhF序列扩增流程
引物序列
引物序列
GCATCGATGAAGAACGCAGC
GACGCTTCTCCAGACTACAAT
TTGTAACTAATCGTGTAGG
CGAAACATATAAAATGCGTTAA
PCR反应体系及参数见表B.2。
dNTP混合物
PCR反应体系及参数
储备液浓度
5mmol/L
SN/T 4876.7—2019
扩增片段大小（bp）
约450bp
约770bp
50μL反应体系加样体积（μL）4.0
美信#服务
10×PCR缓冲液（含Mg+）
10pmol
正向引物
反向引物
10pmol/L
5U/μL
DNA模板
0.3 ug/μL~6ug/μL
注：该引物为通用引物，每次PCR反应必须做空白对照，以确认是否污染。可用商品化的PCRPremix。ITS2基因PCR反应程序
ITS2基因PCR反应程序见表B.3
SN/T4876.7—2019
预变性
ndhF基因PCR反应程序
ITS2基因PCR反应程序
反应温度（℃）
ndhF基因PCR反应程序见表B.4。表B.4
预变性
ndhF基因PCR反应程序
反应温度（℃）
循环数
循环数
行业标准信息服务平台
附录C
（资料性附录）
中国检疫性有害生物DNA条形码鉴定系统操作方法中国检疫性有害生物DNA条形码鉴定系统操作方法见图C.1C.2中国检疫性有害生物DNA条形码鉴定系统DNABARCODEAPPRAISALSYSTEMON CHINESEQUARANTINEPESTS首页
植物有言生物
声前将定
翰入fasta格式的序列
动物瘦病
el#书&ns
医学媒介
TAGCCATTGGACTTEAGTTGTTGEATGHGCACACCATATATLACTEMGGTMGATGTGATACACTTTCEG
GGGTMTTMCCT
提文鉴定
收蒙|进入管理系统
物种识只别
凭证标本
SN/T 4876.7—2019
关于我们
GAGCTTATTTCACCTCTGCAACTATAATTATTGCTGTTCCTACAGGATTAAAGLCTTTMGATGATTAGCTET
ATTTETTA
TTHTAE
CATTTAAE
物种识别页面
中国检疫性有害生物DNA条形码鉴定系统DNA BARCODEAPPRAISAYSTEM ONCHINESEQUARANTINEPESTS营页
原列操码
扭物有来
动物瘦病
手学联
相供样本整定结单
ClQ12844-15:Angiospermae Dicotyledons Euphorbiales FpiroraC
CIO12843-15Ar
Dicotyledons
iales Euphorbi
uohebia
CIQ12842-15 Angiospermae Dicotyledons Euphorbiales EuphorbiaceaeEuphorbiaCID1za4i-is Angiospermae Dicotyledons Euphorbiales EuphorbiaceaeFuphorbia
CIQ12840-15AngiosperimaeDicotyledonsEuphorbialesEuphorbiaceaeEuphorbia
CIQ12839-15 Angiospermae Dicotyledons Euphorbiales EuphorbiaceaeEuphorbia
CIO12838-15Ar
Dicotyledon
alesEuph
Euphorbia
物件识别
Euphorbia
cyathophora
Euerhorbia
cyathophora
Euphorbia
cyathophora
Euphorbia
cyathophora
Euphorbia
鉴定结果页面
ATATTGATATATT
您|进入它理系送
年证标本
谨传标记
关于我们
E-value
SN/T4876.7—2019
附录D
（资料性附录）
基因条形码分析软件操作方法
登陆植物有害生物检疫鉴定系统（http：//exoticorganism.com），首页选择“基因条码”模块在“输入比对的序列”窗口中粘贴查询序列。点击“比对”，软件会在数据库范围内比对，输出物种鉴定结果。结果中相似性最高的条码序列对应分类阶元为查询序列所属分类阶元。在“更多比对结果”里，点击“开始对比”，将符合该类群鉴定特征的且相似度为100%的物种判定为该未知种以齿裂大载Euphorbiadentata为例，在“输入比对的序列”窗口中粘贴ITS2基因片段，点击“比对”，结果见图D.1，相似性最高的条码序列对应分类阶元为大戟属，相似性为100%。在这一栏点击“开始对比”，结果见图D.2，相似度为10o%的序列对应物种为齿裂大戟Euphorbiadentata，即可判定查询序列为该物种。
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输入比白序列：TGCAGGATCCCGCGAACCATCGAGTCTTTGAACGCAAGTTGCGCCCAAAGCCTTTTGGCGGAGGGCACGTCTGCCTGGGTGTCACTCAATCGTTGCCCCCAAACTCTT
TCTGTTGAAAGGGGGATTGTTGGGGCGGATGATGGCCTCCCGTGGGCTTATTGCCTGCGGTTGACCTAAATGTCCGGTCCGCGGCAAAGACGCCACGCCAATCGGTGGTTGTATGACCCTCGCATAACGTCGTGTGTGTTCGGATGCTGTC序比对结
号果(%)
分类阶元
100大韩属Euphorbia
更多详比
在羊比树指果
年准杂妈负种
标准条码名称
大戟属Euphorbia
上游引物
GCATCGATGAAGAACGCAGC
下游引物
GACGCTTCTCCAGACTACAAT
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齿裂大戟Ephorb.cdentata在条形码数据库分类阶元中的比对结果Ree
宝热卷大带
HATAACAAG
XCEL格式下标注系码能式
系科学出刷
自各真惠生物验定停证比对结果如+()P13
黑定特证学出别EXCEL服式下驱定证路式批焱
TTCTCCAGACTAC
14FIEP
GPI7PInPES72nr2
179272379
2齿裂大戟Euphorbiadentata在一品红亚属条形码数据库中的比对结果图D.2
E.1一品红亚属常见种序列信息
附录E
（资料性附录）
一品红亚属常见种序列
一品红亚属常见种序列信息见表E.1。E.1
E.dentata
E.davidii
E.cyathophora
E.pulcherrima
E.heterophylla
一品红亚属常见种序列信息
GenBank登陆号
KU128389、KU128390
KU128394、KU128395、KU128396KU128387、KU128388
KU128397
KU128391、KU128392、KU128393SN/T4876.7—2019
KT991143
KT991144
KT991147
KT991146
KT991145
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