标准号：SN/T 2622-2019
标准名称：柑桔溃疡病菌检疫鉴定方法
英文名称：Detection and identification of Xanthomon as citri subsp.
citri Gabriel et al. (1989)
标准格式：PDF
发布时间：2019-09-03
实施时间：2020-03-01
标准大小：6487K
标准介绍：本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则编写
本标准代替SN/T2622-2010《柑桔溃疡病菌检疫鉴定方法》，与SN/T2622-2010相比主要变化
对原标准柑桔溃疡病菌检疫鉴定判定程序进行了修订；
补充了柑桔溃疡病菌图片资料；
补充了柑桔溃疡病菌荧光实时PCR检测方法等更多可选择的PCR方法
补充了柑桔溃疡病菌致病性测定反应
本标准由中华人民共和国海关总署提出并归口
本标准起草单位：中华人民共和国成都海关、中华人民共和国上海海关。本标准主要起草人：向勇、陈玲玲、付景圆、易建平、邵宝林、何万兴、王成华。本标准代替标准的历次发布版本为
SN/T2622-2010 本标准规定了进出境植物检疫中柑桔溃疡病菌的检疫鉴定方法本标准适用于进出境芸香科( Rutaceae)植物及其果实中柑桔溃疡病菌的检疫鉴定
规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本
文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T6682实验室用水规格和试验方法
SN/T1157进出境植物苗木检疫规程
SN/T2122进出境植物及植物产品检疫抽样
3病菌的基本信息
柑桔溃疡病菌 Xanthomonas citri subsp. citri gabriel et al,(1989)，属细菌域 Bacteria,变形菌门
Proteo bacteria,y-变形细菌纲 Gammaproteobacteria,黄单胞菌目 Xanthomonadales,黄单胞杆菌科
Xanthomonadaceae,黄单胞菌属 Xanthomonas,该病菌的其它信息参见附录A
4方法原理
该病菌的为害症状、菌落形态特性、致病性反应、PCR特异性反应是其检疫鉴定的主要依据

ICS 07.100.99
B15/19
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T2622—2019
代替SN/T2622—2010
柑桔溃疡病菌检疫鉴定方法
Detection and identification of Xanthomonas citri subspcitriGabriel et al.（1989）
行业标准信息服务平台
2019-09-03发布
中华人民共和国海关总署
2020-03-01实施
本标准按照GB/T1.12009给出的规则编写SN/T 2622—2019
本标准代替SN/T2622—2010《柑桔溃疡病菌检疫鉴定方法》，与SN/T2622—2010相比主要变化如下：
一对原标准柑桔溃疡病菌检疫鉴定判定程序进行了修订：补充了柑桔溃疡病菌图片资料；补充了柑桔溃疡病菌荧光实时PCR检测方法等更多可选择的PCR方法；补充了柑桔溃疡病菌致病性测定反应。本标准由中华人民共和国海关总署提出并归口本标准起草单位：中华人民共和国成都海关、中华人民共和国上海海关本标准主要起草人：向勇、陈玲玲、付景圆、易建平、邵宝林、何万兴、王成华。本标准代替标准的历次发布版本为：SN/T2622—2010。
行业标准信息服务平台
1范围
柑桔溃疡病菌检疫鉴定方法
本标准规定了进出境植物检疫中柑精溃物病困的检疫鉴定方法。SN/T2622—2019
本标准适用于进出境芸香科（Rutaceae)植物及其果实中柑秸溃疡病菌的检疫鉴定。规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包活所有的修改单）适用于本文件GB/T6682实验室用水规格和试验方法SN/T1157进出境植物苗木检疫规程SN/T2122进出境植物及植物产品检疫抽样3病菌的基本信息
柑桔溃疡病菌Xanthomonascitrisubsp.citriGabrieletal.（1989），属细菌域Bacteria，变形菌门Proteobacteria，-变形细菌纲Gammaproteobacteria，黄单胞菌目Xanthomonadales，黄单胞杆菌科Xanthomonadaceae，黄单胞菌属Xanthomonas，该病菌的其它信息参见附录A。4方法原理
标准信
该病菌的为害症状、菌落形态特性、或病性反应、PCR特异性反应是其检疫鉴定的主要依据5
主要试剂
除另有说明，本标准中试剂均为分析纯或生化试剂，试验局水参GB/T6682。服务平
70%乙醇、蛋白陈、牛肉浸膏、酵母膏、蔗糖、琼脂、溴化乙锭（E）琼脂、DNAMarker、TaqDNA聚合酶、PCR体系、MgCl2、dNTP、TaqMan探针等。仪器设备
体式显微镜、超挣工作台、高压灭菌锅、生物培养箱、电子天平、普通冰箱、超低温冰箱、离心杭、涡旋混勾仪、纯水仪、浊度计、PCR仪、实时荧光PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、微量可调加样器、剪刀、培养血、三角瓶。
7检疫鉴定
7.1检疫鉴定流程
柑桔溃疡病菌鉴定流程如图1所示。1
SN/T2622—2019
尖型菌落
PCR检测
微病性测定
检出 Xcc
显症样品
菌观察
板分离
无典型菌落
无州样品
PCR检测
未检出Xcc
标准信
图柑渍疡病菌鉴定流程
7.2症状检查bzxZ.net
按照SN/T1157和SN/T2122中规定的程序进行现场检疫并市政样品。实验室对样品进行症状检查，观察待检样品是否带有疑似症状（参见附录A），如有症状，切取定状织在显微镜下观察是否有喷菌现象，如有喷菌，直接从喷菌组织分离病菌。如样品无症或有症样品未见喷菌，进行PCR初检，PCR方法见附录B。PCR结果为阳性的样品再进行病菌分离。
7.3PCR检测
取无症样品或未见喷菌的有症样品，灭菌生理盐水室温浸泡处理30min或4℃冰箱过夜，震荡，取浸泡液10O00r/min离心10min，沉淀提取DNA。常规PCR或实时荧光PCR检测（附录B），柑桔溃疡病菌DNA作为阳性对照，非柑桔溃疡病菌DNA作为阴性对照，双蒸水作为空白对照。7.4病菌分离
有症样品症状处切取2mm×2mm小块组织，制片后于显微镜10×～20×倍下观察切口处是否有云雾状细菌从切口处喷出。每个样品切取5～10个小块组织观察喷菌，分离其中有喷菌的3～5个小2
SN/T2622—2019
块组织，如不足3个喷菌组织，可增加镜检的组织数量。如有喷菌，将喷菌组织块取出，无菌水冲洗一次，70%酒精表面消毒处理30s～60s，无菌水冲洗三次，转人100uL无菌水中浸泡15min；处理液于NA平板上划线分离，每个处理划线3个～5个平板28℃培养2d～4d后观察是否有典型菌落。疑似菌落纯化三次后进行下一步鉴定试验。如有症样品未观察到喷菌现象，取症状处组织剪刀剪成2mm见方小块，加入适量灭菌水中室温浸泡30min或4℃冰箱过夜，取一半处理液10000r/min离心10min，沉淀提取DNA，常规PCR或实时荧光PCR初检。阳性样品处理液稀释10X、100X和1000X，分别取100uL涂布NA平板，每个处理涂布5个～10个平板。培养和观察方法同上。如PCR阳性样品未分离出典型菌落，可增加样本重复，或处理液不稀释直接涂布平板，观察培养情况。无症样品的初检和分离参考本方法。7.5鉴定
7.5.1菌落形态特征
NA培养基上菌落平滑，不透明，有光泽，圆形，凸起，边缘完整：初始为白色，后变为浅黄色；NBY培养基上的菌落浅黄色，圆形，凸起，粘液状；PSA培养基上菌落浅黄色，粘液状，有光泽。挑取可疑菌落在NA培养基平板上纯化三次后进行biolog测定或PCR鉴定。病菌生理生化特征见附录A。
7.5.2PCR扩增
疑似分离物在NA平板上28℃培养48h，收集菌体提取DNA，进行常规PCR或实时荧光PCR检测，检测程序见附录B。
7.5.3致病性测定
疑似分离物在NA上28℃培养48h.无菌水配成10°CFU/mL菌悬液，采用针刺接种法接种柑桔（葡萄柚、墨西哥来檬、枸桔和甜橙）幼嫩叶片.人无菌K作为阴性对照。接种植株28℃培养，7d后开始观察叶片发病情况。对接种出现症状处组织进行病菌再分，并与最初的接种分离物比较，完成致病性测试。准信息
8结果评定
服务平
分离获得疑似分离物，biolog测定符合或PCR检测结果为阳性，致病性测试表现典型症状，判定样品为检出柑桔溃疡病菌；其余情况判定为未检出相秸溃疡病菌。9样品保存与处理
样品经登记和经手人签字后妥善保存。对检出柑桔溃疡病菌的样品4℃保存，以备复核。样品保存期满后高压灭菌火活处理。
10菌株保存与处理
从样品中分离并鉴定为柑桔溃疡病菌的菌株，应要善保存。配置成10°CFU/mL菌悬液，加入15%～30%甘油于一80℃下冻存；也可将菌株冻干，一20℃或一80℃下长期保存。保存期满高压灭菌灭活处理。
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A.1英文名
附录A
（资料性附录）
柑桔溃疡病菌信息
Citrus Canker Disease;Citrus canker;Bacterial canker of citrus;Citrus bacterial canker:A.2学名
中文名：柑桔黄单胞柑桔亚种
学名：Xanthomonascitrisubsp.citriGabriel etal.（1989），简称：Xcc。异名：Pseudomonas citriHasse,l915;Bacterium cirri （Hasse）Doidge,1916;Bacillus citri(Hasse)Holland,1920;Phytomonascitri(Hasse)Bergey etal.,1923;X.citri(Hasse)Dowson,1939;Xcitri f.sp.aurantifoliae Namekata & Oliveira,1972;X.campesrris pv.citri(Hassel915)Dye 1978;Xcampestris pv.aurantifolii Gabriel et al.,l989;X.aronopodis pv.aurantifolii Vauterin et al.,1995X.fuscanssubsp.aurantifoliiSchaadetal.,2oo6;X.aronopodispv.citri(Hasse19l5)Vauterin etal.,1995。
柑桔溃疡病菌的种名随黄单胞杆菌属（Xanthomonas）种类的调整而发生较大变化。最初的种名为X.citri，1980年《伯杰氏细菌鉴定手册》将黄单胞杆菌属中的种合并为5个种，将其它120个种以致病变种的形式并人X.campestris种下，柑桔溃疡病菌的种名为X.campestrispv.citri。根据病菌的地理分布和对拼后类植物的致病性不同·通常将柑桔溃疡病菌分为5个菌系，分别为A、B、C、D和E菌系。1989年，Gbrie等研究了各菌系染色体DNA的限制性酶切片段长度多态性(RFLP），将A菌系提升到种的水，命为X.citri，B、C、D菌系命名为X.campestrispv.aurantifolii，E菌系为X.campestrispv.citneto（Gabrieletal.1989）。该分类命名未被广泛认同（Vauterinetal.1990）。2000年，Vauterin等（Vaterintal.2000）利用Biolog微孔板测试Xanthomonas属种类对95种碳源的反应，并结合DNADMA杂交、AFLP以及rep-PCR技术，将黄单胞杆菌进行重新分类。柑桔溃疡病菌的5个菌系均划入地医章黄脂杆菌X.axonopodis种下，根据致病性、寄主专化性以及DNA杂交同源性的不同分为柑橘、积壳和柚文病变种：X.aronopodispv.citri（A菌系）、X.aronopodis pv.aurantifolii（B/C/D菌系）和X.dgotopoupv.citrume。2006年，Schaad等根据血清学、DNA-DNA杂交、ITS序列、rep-PCR和培养形状的不同，将入ronopodispv.citriA菌系）命名为X.citrisubsp.cirri；X.aronopodispv.aurantifoli（B/C/D菌系）命名为X.fuscanssubsp.aurantifoli；将X.aronopodis pv.citrume命名为X.alfalfae subsp.Citrumamr（E菌系）。
A菌系（亚洲菌系）起源于亚洲，侵袭力最强，大多柑桔品种都可受其侵害，但葡萄柚、积和甜橙最易受侵害.世界性分布。B/C/D菌系，又称来檬菌系。其中B菌系于1928年在阿根廷报道，能在柠檬和墨西哥来檬上造成病斑，在葡萄柚与甜橙上儿乎不发病，主要在南美洲流行。1972年，C菌系被发现于巴西，在墨西哥来檬与酸橙上发病，在葡萄柚与甜橙上不发病。1981年，D菌系在墨西哥Colima地区发现，致病力非常弱，其症状与A型溃疡类似，但还没有危害果实的报道。主要危害墨西哥来檬，也可危害波斯来檬及生长在墨西哥来檬病树周围的柚子树（Robereetal.1991）。C菌系和D菌系似乎与B菌系有联，其划分只是暂时性（Roberetal.1991）。1984年，美国佛州发现苗圃菌系（E菌系），与前44
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个菌系不同，引起的病害也称细菌性斑点病（CitrusBacterialSpot)或苗圃型溃疡（Roberetal.1991）。其症状与A、B、C、D型溃疡明显不同，叶片病斑水渍状，褪绿并坏死，但组织不木栓化隆起，也不破裂，枝梢上的病斑与A菌系极为相似。Gabriel将其命名为X.citripv.citrumelo。该菌系只危害苗木，自然条件下不危害果实，对葡萄袖的侵袭力更强。A.3：地理分布
亚洲：阿富汗、孟加拉国（局部分布）、束埔寨、中国、圣诞岛、科科斯群岛、格鲁吉亚（可能）、印度、印度尼西亚、伊朗（局部分布）、伊拉克（可能）、以色列、日本、韩国、朝鲜、老挝、马来西亚、马尔代夫、缅甸、尼泊尔、阿曼、巴基斯坦、菲律宾、沙特阿拉伯（局部分布）、新加坡、斯里兰卡、中国台湾、泰国、土耳其、阿拉伯联合首长国、越南、也门（局部分布）。非洲：阿尔及利亚、贝宁、布基纳法索、科摩罗、刚果、科特迪瓦、埃及、埃塞俄比亚、加蓬、冈比亚、加纳、儿内亚、肯尼亚、利比亚、马达加斯加岛、马里（限制性分布）、毛里求斯、马药特岛、莫桑比克、留尼旺岛、罗德里格斯岛、塞内加尔、塞舌尔、索马里、南非（可能，报道已根除）、苏丹、斯威士兰、坦桑尼亚（局部分布）、窦尼斯、津巴布韦。
美洲：墨西哥、美国（局部分布）、巴哈马群岛、伯利兹、英属维尔京群岛、美属维尔京群岛、哥斯达黎加、古巴、多米尼加、多米尼克（可能）、萨尔瓦多、瓜德罗普岛（法国）、海地、洪都拉斯、牙买加、马提尼克、荷属安德烈斯群岛（可能）、尼加拉瓜、波多黎各、圣卢西亚岛（可能）、特立尼达拉和多巴哥（可能）、阿根廷、玻利维亚、巴西、智利、哥伦比亚、厄瓜多尔、巴拉圭、秘鲁、苏里南、乌拉圭（局部分布）、委内瑞拉。欧洲：阿尔巴尼亚、克罗地亚、塞浦路斯、马耳他、荷兰。大洋洲：美属萨摩亚、澳大利亚（可能，报道已根除）、斐济、关岛（可能）、马绍尔群岛、密克罗尼西亚群岛、新西兰（可能，报道已根除）、北马里亚纳群岛（可能）、帕劳、新几内亚岛、所罗门群岛。柑桔溃疡病菌有不同的致病型、血清型和遗传型菌株，通常分成以下儿个菌系：A菌系（CBCD-A亚洲型溃疡病或真正溃疡病型），分布于除地中海盆地和美国之外的大部分柑桔种植区：B菌系（CBCDB，假溃疡病型）.分布于阿根延和乌拉圭C菌系（CBCD-C，墨西哥来檬型），分布于巴西和巴拉圭；D菌系（CBCD-D)分布于墨西哥；E菌系(CUDB-E村桔细菌性叶斑病)分布于美国佛罗里达州。亚洲型的A菌系毒力最强，分布最广，侵渠多芸香科的寄主。B菌系虽然也侵染柑桔属的寄主但在阿根廷、乌拉丰和巴拉圭主要侵染柠檬，可能与降敏病力的A菌系有关。在巴西，C菌系主要侵信息服务
染来檬（C.aurantifolia）。
A.4寄主范围
可侵染芸香科野生和栽培种，主要为害芸香科的柑桔属（CitrusL.）、积属（PomusK，）和金桔属（FortunellaSwingle）。经济上造成损失最大的是柑桔、甜橙、酸橙、来檬和柚，自然侵染文发生在柑桔属植物上（包括杂交品种和载培品种），也发生在枸桔（Ponirustrifoliat）、金桔（Fortunellamargart）、Severiniaburifolia和菲律宾木桔（Swingleaglutinosa）上，芸香科其他的寄主还包括Aurantioideae、Rutoideae和Toddalioideae亚科的一些植物，还报道了一种非芸香科寄主榔色木（Lansiumdomesticum，楝科）。B菌系与A菌系有相同的寄主范围.但是感染某些寄主并不严重，C和D菌系仅侵染来檬（Citrusaurantifolia）。巴西有报道说酸草（Trichachneinsularis）也是柑桔溃疡病的寄主。A.5传播与扩散
柑桔溃疡病菌主要通过植物的气孔和伤口侵入植株。带病苗木、接穗和果实等柑桔材料的调运是5
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其进行远距离传播的主要途径，田间主要通过风雨、虫害传播，有时带菌土壤也可以传病。A.6典型症状
A.6.1叶片
发病初期在叶片背面出现黄色或暗黄色针尖大小的油渍状斑点，逐渐扩大，同时叶片正背两面均逐渐隆起，呈近圆形、米黄色病斑。以后病部表皮开裂，皇海绵状，隆起更显著，木栓化，表面粗糙、灰白色或灰褐色。病斑中心凹陷，周围有黄色或黄绿色晕环，有些品种在紧靠晕环处常有褐色的釉光边缘。到后期，病斑中央成火山口状开裂。病斑大小随品种而异，甜橙、脐橙和柚上的病斑较大，枸桔、桔和柠檬上的病斑较小，见图A.1和A.2。A.6.2枝条
病斑近圆形，灰褐色，表面粗糙、突起、无黄色晕环，多个病斑常连成片，不规则。干燥条件下，溃疡病斑海绵状、木栓化、隆起、表面破裂；潮湿时溃疡迅速扩大，表面完整·边缘油状。病斑发生在枝稍部位不会产生黄色晕圈。嫩枝上产生坏死扁平病斑，有时具有油渍状的边缘，无黄色晕圈。A.6.3果实
病斑与叶片上症状相似，但火山口状开裂更显著，木栓化程度更高，坚硬粗糙，一般无黄色晕圈，病部只限于果皮，不发展到果肉，见图A.3和A，4。果实生育前期发生的病斑多隆起，中、后期发生的则较扁平。幼病果有树脂状分泌物、发病严重时引起早期落果。行业标准信息服务平台
（a）柑橘背面
叶片上症状
图A.2致病性测试（左：无菌水；右：柑桔溃疡病菌）6
A.7形态特征
(a)柚子
果实上症状
图A.4果实上症状（酸橙）
(b）柠檬
SN/T2622—2019
革兰氏阴性，短杆状，两端钝圆，大小为1.5um~2.0um×0.5um~0.75um，极生单鞭毛，有英膜无芽孢。NA培养基上菌落呈圆形，全缘蜜美色.有光泽，表面光滑、微隆起，粘稠状，见图A.5。信息服务平台
图A.5菌落形态特征（NA上28℃培养48h）A.8生理生化特征
能使明胶液化，水解酪蛋白，在3%的NaCI溶液中生长，不使石蕊牛乳陈化，不产生硫化氢，分解淀粉，水解七叶树素，甲基红试验为阴性，过氧化氢反应为阳性，氧化酶反应为阴性，尿素分解试验为阴性，不能降解硝酸盐、吲哚产物，可以分解阿拉伯糖、葡萄糖、甘露糖、半乳糖、海藻糖产酸。病菌最适温度为7
SN/T2622—2019
28℃~30℃，最低为5℃10℃.最高为35℃~39℃，致死温度为55℃~60℃10min，最适pH为6.6。
A.9Xcc及其近似种的区别
Xcc及其近似种的区别见表A.1
表A.1Xcc及其近似种的区别
英文名
中文名
X.campestris pv.citri
拉丁名
地理分布
培养形状（28℃）
生理生化特性
噬菌体反应（CP1和
血清学反应
（柑橘亚种）
CBC(citrus bacterial canker)柑橘溃疡病菌
A菌系
X.aronopodis pv.citri
X.citri subsp.citri
亚洲、非洲和美洲
葡萄柚、甜橙、袖子、柠檬、
初期为突起状小疱疹斑，后
期木栓化，形成粗糙隆起病
斑；有时病斑边缘釉圈明显
外围水渍忧
YDC上40-44F声主单菌
落；不产生水潜性色素。FS
上48~52h产生单菌汽
mSX上56~60h产生单
可利用麦芽糖和阿拉伯糖；
不能利用菊糖；可水解石蕊
牛乳和酪
CBC(citrus bacterial canker)柑橘溃疡病菌
B/C/D菌系（来檬菌系）
X.axonopodispv,auranti
X.fuscans subsp.aurantifo-
中、南美洲（墨西哥、巴西、阿根廷、乌拉圭和巴拉圭）
柠橡、酸橙、墨西哥莱檬
初期为细小疱疹斑，后期木
栓化，形成粗糙隆起病斑；病
斑边缘水渍状
YDC上56～60h产生单菌
落；可产生水溶性色素。FS
上70～76h产生单菌落。
580~84h产生单
CBX(citrus bacterial spot)
柑橘斑点病菌
E荫系
X.aronopodis pv.citrumelo
X.alfalfae subsp.
citrumelonis
美国佛罗里达州
橙、桔、柚
病斑扁平或下陷，边缘明显
水渍状
YDC土30～4h产生单菌
落：不产生水溶性色素。FS
上40～44h产生单菌落。
mSX上48～52h产生单
不能利用麦芽糖，可沉淀有可利用麦芽糖和菊糖；可使蕊牛乳：不能水解酪
不敏感
阳性，但不同于Xcc
纤维二糖和甘露醇产酸
不敏感
附录B
（规范性附录）
柑桔溃疡病菌PCR方法
B.1常规PCR（Coletta-Filhoetal.2006）SN/T2622—2019
引物为Xac01（5-cgccatccccaccaccaccacgac-3）/Xac02（5-aaccgctcaatgccatccacttca-3）；扩增产物为581bp。PCR反应程序为94℃5min；94℃30s，60℃30s，72℃60s.30个循环：72℃10minB.2实时荧光PCR（CuberoandGraham20o5）引物为J-RTpth3（5-accgtcccctacttcaactcaa-3）/J-RTpth4（5-cgcacctcgaacgattgc-3），探针为JTaqpth2（5-FAM-atgcgcccagcccaacgc-TAMRA-3）。实时荧光PCR反应程序：95℃10min；然后95℃15s，60℃60s，40个循环。实时荧光PCR扩增体系25μL：10XPCR缓冲液2.5μL，25mmol/LMgCl3μL，2.5mmol/LdNTP2μL,10μmol/L引物各1.25μL,HotstarTaqDNA聚合酶1.25U,10μmol/LTaqManprobe0.5μL，模板2uL，加灭菌ddH，O至25uL。样品荧光信号Ct值≤35.并有明显的扩增曲线，则判定该样品Xcc检测结果阳性；样品荧光信号Ct值≥40时.则可判定该样品Xcc检测结果阴性；样品荧光信号Ct值在35～40之间.应重测。若重测结果仍然有明显扩增曲线，则判断为检测结果阳性，否则为阴性行业标准信息服务平台
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