标准号：SN/T 5122-2019
标准名称：进出口食用动物、饲料喹诺酮类筛选检测 胶体金免疫层析法
英文名称：Determination of quinolones in live animal and feeds for import and export-
Colloidal gold immun eassay
标准格式：PDF
发布时间：2019-09-03
实施时间：2020-03-01
标准大小：4266K
标准介绍：本标准规定了进出口食用动物、饲料中恩诺沙星、环丙沙星、诺氟沙星、达氟沙星、伊诺沙星、培氟沙星、氧氟沙星、氟甲喹、恶喹酸残留量的胶体金免疫层析检測方
本标准适用于食用动物[猪(猪肉、猪肝、猪血、猪尿)、鸡(鸡肉、鸡肝、鸡血)鱼、虾]、饲料(饲料料、配合饲料、浓缩饲料、添加剂预混料)中恩诺沙星、环丙沙星、诺氟沙星、达氟沙星、伊诺沙星、培氟沙星、氧氟沙星、氟甲喹、恶喹酸喹诺酮类药物残留量的的筛选检测，
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法
3原理
利用免疫测定中的竞争抑制法检测原理，以微孔滤膜为载体，氯金酸胶体金颗粒为固相标记抗体硝酸纤维素膜(NC)含有已固定于测试区的包被抗原、控制区的二抗和固定于结合释放垫上的金标抗体。样品中的喹诺酮类药物在毛细渗移的过程中与胶体金标记的特异性多克隆抗体结合·抑制了抗体和测试区包被抗原的结合，使測试区不显色，结果为阳性；反之，测试区出现一条肉眼可见的红色条带结果为阴性

ICS67.050
B 00/09
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 5122—2019
进出口食用动物、饲料喹诺酮类筛选检测胶体金免疫层析法
Determination of quinolones in live animal and feeds for import and export-Colloidalgold immunoassay
2019-09-03发布
中华人民共和国海关总署发布
2020-03-01实施
本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草SN/T5122—2019
请注意本文件的某些内容可能涉及专利，本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任本标准由中华人民共和国海关总署提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国拱北海关本标准主要起草人：李忠、刘陆、薛良辰、陈朝方、曾川、钱振杰、潘亮、彭碧宁、蔡德玲、彭玉芬、陈敬明荔莉、范稚莉、蔡杰、陈晏
1范围
进出口食用动物，饲料喹诺酮类筛选检测胶体金免疫层析法
SN/T5122—2019
本标准规定广进出口食用动物、饲料中恩诺沙星、环内沙星、诺氟沙星、达氟沙星、伊诺沙星、培氟沙星、氧氟沙星、氟甲喹、恶喹酸残留量的胶体金免疫层析检测方法。本标准适用于食用动物猪（猪肉、猪肝、猪血、猪尿）、鸡（鸡肉、鸡肝、鸡血）、鱼、虾、饲料（饲料原料、配合饲料、浓缩饲料、添加剂预混料)中恩诺沙星、环丙沙星、诺氟沙星、达氟沙星、伊诺沙星、培氟沙星、氧氟沙星、氟甲喹、恶喹酸喹诺酮类药物残留量的的筛选检测。2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3原理
利用免疫测定中的竞争抑制法检测原理，以微孔滤膜为载体，氯金酸胶体金颗粒为固相标记抗体。硝酸纤维素膜（NC)含有已固定于测试区的包被抗原、控制区的二抗和固定于结合释放垫上的金标抗体。样品中的喹诺酮类药物在毛细渗移的过程中与胶体金标记的特异性多克隆抗体结合，抑制了抗体和测试区包被抗原的结合，使测试区不显色，结果为阳性；反之，测试区出现一条肉眼可见的红色条带，结果为阴性。
4试剂和材料
除特殊注明外，所有试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水。4.1乙腈。
4.2甲醇。
4.3氨水。
4.4冰乙酸。
5无水硫酸钠。
磷酸二氢钾。
磷酸氢二钠。
氯化钠。
氯化钾。
磷酸二氢钾。
磷酸。
氢氧化钠。
SN/T5122—2019
4.131%乙酸乙腈：量取10mL冰乙酸，加乙990mL，混匀。4.14PBS缓冲溶液：磷酸二氢钾：0.27g，磷酸氢二钠：1.42g，氯化钠：8g·氯化钾0.2g.加去离子水约800mL充分搅拌溶解，然后加入磷酸调pH至7.4，最后定容到1000mL。4.15氢氧化钠溶液（3mol/L）：称取120g氢氧化钠，在烧杯中溶解氢氧化钠，恢复至室温，将烧杯内冷却后的溶液小心转人广口瓶中，加水至1000mL。4.16浓盐酸。
4.17盐酸溶液（3mol/L）：取270mL浓盐酸，加水730mL，混匀。4.18盐酸溶液（10mmol/L）：取3.3mL3mol/L盐酸溶液（4.17），加水定容至1000mL。4.1910%盐酸-乙睛溶液：取100mL乙睛，加盐酸溶液（4.18）定容至1000mL。4.205%甲醇水溶液：取5mL甲醇.加水定容至100mL。4.2110%氨水甲醇溶液：取10mL氨水用甲醇定容100mL4.22标准品：恩诺沙星（Enrofloxacin）CAS号：93106-60-6，纯度98.5%、环丙沙星（Ciprofloxacin）CAS号：85721-33-1，纯度94.0%、诺氟沙星（Norfloxacin）)CAS号：70458-96-7.纯度99.0%、洛美沙星（Lomefloxacin)CAS号：98079-51-7，纯度98%、达氟沙星（Danofloxacin）CAS号：112398-08-0，纯度93.5%、伊诺沙星（Enoxacin）CAS号：74011-58-8，纯度99.0%、培氟沙星（Pefloxacin）CAS号：70458-92-3.纯度99.0%、氧氟沙星（Ofloxacin）CAS号：82419-36-1，纯度99.0%、氟甲喹（Flumequine）CAS号：42835-256.纯度99.0%、恶酸（Oxolinicacid），CAS号：26893-27-6，纯度98%。4.23喹诺酮类标准储备液：准确称取适量的标准物质，用甲醇溶液配置成浓度为100μg/mL的标准储备液。4℃以下避光保存。
4.24喹诺酮类标准储标准工作液：准确移取喹诺酮类标准储备液1.0mL于100mL容量瓶中，用乙睛稀释至刻度。配置成浓度为1.0μg/mL的标准工作溶液。4℃以下避光保存。4.250.22um微孔滤膜。
4.26聚苯乙烯吡咯烷酮填料固相萃取柱或相当者：3mL，60mg或性能相当者。使用前依次用3mL甲醇、3mL水和3mL盐酸溶液（4.18）对柱子进行活化4.27胶体金免疫层析快速检测试剂盒：包含胶体金免疫层析快速检测卡.样品稀释液等，见附录A。5仪器和设备
分析天平：感量为0.01g和0.1mg。5.1
旋涡混合器。
5.3高速离心机：转速大于或等于15000r/min。5.4
离心机：转速大于或等于4000r/min。5.5固相萃取装置。
氮吹浓缩仪。
旋转蒸发仪。
超声波清洗器。
pH计:0.01pH。
试样的制备与保存
6.1试样制备
6.1.1食用动物样品
取有代表性组织样品约10g，混合均匀，用匀浆机均质，装入洁净容器内密封并做好标识；取有血浆2
SN/T5122—2019
样品约5mL，混合均勾，装人洁净容器内密封并做好标识；取有代表性尿液样品约50mL，混合均匀，装洁净容器内密封并做好标识。
6.1.2饲料样品
取有代表性样品药500g，混合均匀，研碎成粉未，装入洁净容器内密封并做好标识。6.2试样保存
试样于4℃冰箱内保存。制样和样品保存过程中，应防止样品受到污染和待测物损失。7样品处理
7.1提取与净化
7.1.1食用动物样品
7.1.1.1组织样品
称取5g（精确到0.01g）样品于50mL聚丙烯离心管中，加入4g无水硫酸钠.再加入15mL的乙酸乙睛溶液（4.13），涡旋振荡1min，超声提取10min后，10000r/min离心5min，上清液转移至50mL的梨形瓶中。于50℃减压蒸发至近干。用1mLPBS缓冲溶液（4.14）溶解残渣，过微孔滤膜，滤液调节pH值至8.0土0.5，此溶液为待测试溶液，供胶体金免疫层析快速检测卡测定。7.1.1.2血浆样品
吸取1mL（精确到0.01mL）混匀的血浆样品于15mL聚丙烯离心管中，加人5mL乙睛，涡旋振荡1min，超声提取10min后，10000r/min离心5min，上清液转移至玻璃试管中，于50℃氮吹浓缩近干。用1mLPBS缓冲溶液（4.14)溶解残渣，过微孔滤膜，滤液调节PH值至8.0士0.5，此溶液为待测试溶液，供胶体金免疫层析快速检测卡测定。7.1.1.3尿液样品
吸取2mL（精确到0.01mL）混匀的尿液样品于10mL容量瓶中，加人PBS缓冲溶液定容到刻度涡旋振荡1min·超声提取10min后.调节pH值至8.0士0.5，过微孔滤膜，此溶液为待测试溶液，供胶体金免疫层析快速检测卡测定。7.1.2饲料样品
称取1g（精确到0.01g）样品于50mL聚内烯离心管中，加入15mL乙酸乙睛溶液（4.13），涡旋振荡1min超声提取10min后，4000r/min离心5min，上清液转移至50mL的梨形瓶中，于50℃减压蒸发至近干。用6mL盐酸-乙睛溶液（4.19）溶解液溶解残渣，待净化。取已活化的固相萃取小柱（4.25），转移上述待净化溶液至固相萃取柱顶部，接着依次以6mL水、6mL甲醇水溶液（4.20）淋洗，负压抽干，最后用6mL氨水甲醇溶液（4.21）洗脱。50℃下氮气吹干。所得残渣用1mLPBS缓冲溶液（4.14）溶解，过微孔滤膜，收集滤液于干净容器中，此溶液为待测试溶液，供胶体金免疫层析快速检测卡测定。8测定
8.1上样测定
撕开铝箔袋，取出胶体金层析快速检测卡，开封后平放于桌面，用滴管小心吸取7.1.1或7.1.2中的3
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待测试溶液，加3滴于样品孔中，见附录图A1。加样后5min，观察检测线和对照线的色带条和颜色深浅。
8.2空白对照
在样品检测同时，做空白对照试验。以胶体金免疫层析快速检测试剂盒自带的样品提取液替代样品测定液，按8.1步骤上样测定，以协助结果判断。8.3阳性对照
在样品检测同时，做阳性对照试验。用1.0ug/mL的恩诺沙星、环丙沙星、诺氟沙星、达氟沙星、伊诺沙星、培氟沙星、氧氟沙星、氟甲喹、恶喹酸等9种标准溶液中的任意1种，以PBS缓冲溶液（4.14)为稀释液，配置0.3g/mL的标准溶液作为阳性对照样品替代样品提取测定液，按8.1步骤上样测定，以协助结果判断。
8.4阴性对照
你取经质谱方法确证过的空自样品，按8.1步骤上样测定，做阴性对照试验，以协助结果判断9结果的评定与表述
对照阴性对照、阳性对照、空自对照的结果，观察检测线和对照线的色带条和颜色深浅。按如下原则进行结果判定。
a）阴性：C线显色，T线肉眼可见。b）阳性：C线显色，T线不显色，判为阳性。c）无效：C线不显色，无论T线是否显色，该检测卡均判为无效。需要重新进行检测。检测结果判断图参见附录图A.3。凡是结果呈现阳性的样品需要复检两次以上。本方法筛查出的阳性样品可采用其他确证方法进行确证。
备注：不同品牌厂商的产品，结果的评定与表述可能会有所不同，按照实际采用的试剂盒为准。10检测限
本方法的检测限：
动物组织：恩诺沙星、环丙沙星、诺氟沙星、达氟沙星、伊诺沙星、培氟沙星、氧氟沙星、氟甲喹、恶喹酸均为10μg/kg
动物血浆：恩诺沙星、环丙沙星、诺氟沙星、达氟沙星、伊诺沙星、培氟沙星、氧氟沙星、氟甲喹、恶喹酸均为50ug/kg。
动物尿液：诺氟沙星和氧氟沙星为150ug/kg，恩诺沙星、环丙沙星、达氟沙星、伊诺沙星、培氟沙星、氟甲喹、恶喹酸均为100uμg/kg。饲料的检测限：恩诺沙星、环丙沙星、诺氟沙星、达氟沙星、伊诺沙星、培氟沙星、氧氟沙星、氟甲喹、恶喹酸均为300μg/kg。
检测卡试剂盒组成
快速检测卡
附录A
（资料性附录）
喹诺酮类（组织）胶体金快速检测卡样品管（内装有样品稀释液）
滴管。
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检测卡保存于15～25℃阴凉干燥处，不可冷冻.避免阳光直晒。有效期12个月。上样示意图
对照线
检测线
点样孔
A.3结果判定示意图
阳性反应示意图
标记区
加样示意图
质控区（C）显示肉眼可见的红色条带，检测区（T）未见红色条带（参见图A.2）。阳性反应示意图
阴性反应示意图
质控区（C）显示肉眼可见的红色条带，检测区（T）显示肉眼可见的红色条带（参见图A.3）。5
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无效检测示意图
质控区（C)未见红色条带（参见图A.4）。n此内容来自标准下载网
阴性反应示意图
无效检测示意图
备注：不同品牌厂商的产品，检测卡试剂盒组成及结果判定示意图可能会有所不同，按照实际采用的试剂盒为准。
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