标准号：SN/T 5124-2019
标准名称：猪Delta冠状病毒检疫技术规范
英文名称：Quarantine protocol for porcine deltacoronavirus
标准格式：PDF
发布时间：2019-09-03
实施时间：2020-03-01
标准大小：4537K
标准介绍：本标准规定了猪Dela冠状病毒分离、RT-PCR和荧光 RT-PCR诊断技术。本标准适用于猪 Delta冠状病毒感染的临床诊断和实验室检测。2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本
文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法
3缩略语
下列缩略语适用于本文件：
Ct值每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数
dNTPs脱氧核糖核苷酸
LC-PK细胞猪肾小管上皮细胞
PDCoV Porcine deltacoronavirus猪 Delta冠状病毒
RT-PCR逆转录聚合酶链反应

ICS11.220
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 5124—2019
猪Delta冠状病毒检疫技术规范
Quarantineprotocol for porcine deltacoronavirus2019-09-03发布
中华人民共和国海关总署
2020-03-01实施
本标准按照GB/T1.12009给出的规则进行编写本标准由中华人民共和国海关总署提出并归口。SN/T5124—2019
本标准起草单位：中华人民共和国杭州海关、中华人民共和国天津海关、中国检验检疫科学研究院浙江大学、中华人民共和国昆明海关、中华人民共和国上海海关、本标准主要起草人：帅江冰、何永强、陈小金、莫虹斐、曾若雪、张晓峰、李肖梁、董志珍、张永宁、张舟、花群义、张强、李健
1范围
猪Delta冠状病毒检疫技术规范
本标准规定了猪Delta冠状病毒分离、RT-PCR和荧光RT-PCR诊断技术。本标准适用于猪Delta冠状病毒感染的临床诊断和实验室检测。规范性引用文件
SN/T 5124—2019
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3
缩略语
下列缩略语适用于本文件：
Ct值每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数dNTPs脱氧核糖核苷酸
LLC-PK细胞猪肾小管上皮细胞
PDCoVPorcinedeltacoronavirus猪Delta冠状病毒RT-PCR逆转录-聚合酶链反应
4仪器设备
4.1二氧化碳培养箱
4.2倒置显微镜
4.3PCR仪
4.4荧光定量PCR仪
台式冷冻离心机
生物安全柜
分析天平
微量可调移液器（10μL100μL、1000μL）及配套带滤芯吸头等。5
试剂和材料
5.1水：本标准所用水应符合GB/T6682中三级水的规格5.2DMEM/F12培养基
5.3氯仿
5.4Trizol
5.5逆转录酶
SN/T5124—2019
5.6DNA聚合酶
5.7RNA酶抑制剂
5.8RT-PCR用引物.序列如下：
上游引物：5-ATCCTCCAAGGAGGCTATGC-3”下游引物：5-GCGAATTCTGGATCGTTGTT-35.9荧光RT-PCR用引物和探针，序列如下：上游引物：5-CGACCACATGGCTCCAATTC-3”下游引物：5-CAGCTCTTGCCCATGTAGCTT-3探针：5-FAM-CACACCAGTCGTTAAGCATGGCAAGC-TAMRA-36概述
PDCoV为单股正链、含囊膜的RNA病毒，基因组约为25kb.包含5’和3°非编码区及7个开放性阅读框，分别编码多聚酶蛋白（polymeraseprotein）la/1b、纤突（spike，S）蛋白、小膜（Envelope，E）蛋白、膜（Membrane，M）蛋白、非结构蛋白6（nonstructuralprotein6，NS6）、核衣壳（Nucleocapsid，N）蛋白及非结构蛋白7（nonstructuralprotein7，NS7）。PDCoV引发的疾病以呕吐、水样腹泻、脱水和食欲下降为基本特征，各年龄段猪群均易感，新生仔猪感染率和发病率较高，感染后死工率为30%～40%。病理学特征主要表现为小肠扩张，肠壁变薄、透明，内充满黄色液体，肠系膜充血，肠系膜淋巴结水肿，小肠绒毛缩短。组织病理学变化可见干二指肠、空肠、回肠绒毛严重萎缩甚至脱落，上皮细胞坏死或空泡化。7实验室诊断
7.1病毒分离
7.1.1样品处理
粪便或肠内容物用含10000IU/mL青霉素、10000ug/mL链霉素和25g/mL两性霉素B的0.01mol/LPBS（参加附录A)1：10稀释（w/v），充分震荡混勺，12000转/分钟离心20min，取上清以0.22um过滤器过滤除菌。
十二指肠、空肠、回肠等组织样品刮取肠绒毛放人含三抗的0.01mol/LPBS(pH7.2)中，冻融三次后，12000转/分钟离心20min，取上清以0.22μm过滤器过滤除菌。7.1.2病毒的细胞分离
7.1.2.1将长势良好的LLC-PK细胞分装，加入含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基，37℃、5%CO,培养。
7.1.2.2细胞生长至80%融合度时，弃去旧培养基，以不含血清的DMEM/F12清洗两遍。7.1.2.3加人1mL过滤除菌后的样品上清液，同时加人含10000IU/mL青霉素、10000μg/mL链霉素和25μg/mL两性霉素B的DMEM/F12培养基以及3μg/ml的胰酶，37C.5%COz培养。7.1.2.4每天观察接种细胞是否出现细胞病变，并记录结果，连续观察3天。7.1.2.5若空白对照细胞正常，阳性对照组细胞产生细胞病变，同时接种样品的细胞也产生细胞病变（细胞圆缩、聚集、脱落），收集病变细胞，用于核酸抽提和PCR鉴定。7.1.2.6若接种样品的细胞未出现细胞病变，则收集细胞，反复冻融，10000rpm/min离心10min，取上清接种新鲜LLC-PK细胞单层，继续培养3天后收集细胞，用于核酸抽提和PCR鉴定。2
7.2逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）7.2.1样品处理
接种细胞经一80℃/37℃反复冻融，12000rpm，离心20min，取上清。SN/T 5124—2019
将灭菌的棉拭子插入肛门或者粪便中轻轻左右搅动，放入盛有1mL灭菌0.01mol/LPBS中，振荡混匀，取上清用于核酸提取或一20℃备用。样品避免反复冻融。7.2.2核酸抽提
7.2.2.1取细胞上清或粪拭子上清250μL至无RNA酶的1.5mL离心管，加入600uLTrizol溶液，剧烈震荡混匀后，室温放置5min。7.2.2.2加200μL氯仿，盖紧盖子，剧烈摇动15s，室温放置3min后，4℃，12000r/min离心15min7.2.2.3
吸取上清至新的无RNA酶离心管，加入500uL预冷的异内醇，上下翻转混匀，室温放置10 min。
7.2.2.44℃、12000r/min离心15min。缓慢弃上清，将离心管倒置于吸水纸上，将液体去除。7.2.2.5加人1000μL预冷的75%乙醇缓慢倒转洗涤沉淀。7.2.2.64℃、12000r/min离心15min，弃上清，将离心管倒置于吸水纸上，室温干燥沉淀5min~10min。
7.2.2.7加入20μLDEPC水，4000r/min离心5s，室温溶解10min。立即使用或一70℃保存备用，实验过程中设置阴性对照和DEPC水空白对照。可采用同等效果的商业化RNA抽提试剂盒代替以上方法。
7.2.3RT-PCR反应体系
将RT-PCR试剂、引物探针等室温融化，2000r/min离心5S。按样品数量配置反应液，每个反应管包含以下成分：
10XPCRbuffer
25mmol/LMgClz
2.5mmol/L dNTPs
10μmol/L上下游引物
5U/μLDNA聚合酶
5U/μL逆转录酶
40U/uLRNA酶抑制剂
DEPC水
25 μL
充分混匀，向每个反应管中各分装17μL，最后加入总RNA8μL。每个反应体系设置两个平行。可采用同等效果的商业化一步法预混液代替。7.2.4RT-PCR反应条件
第一阶段，反转录55℃/30min；第二阶段.预变性95℃/10min；
第三阶段，95℃变性15s，55℃退火30s72℃延伸60s，共35个循环；3
SN/T5124—2019
第四阶段，72℃再延伸7min.4℃保存7.2.5
结果判定
质控标准
阳性对照扩增出大小为494bp的特异性条带，阴性对照和空白对照无494bp条带。若阳性对照、阴性对照或空百对照不成立，则需要重新试验。7.2.5.2结果描述及判定免费标准bzxz.net
若被检样品扩增出大小为494bp的特异性条带，则判定为PDCoV核酸阳性。若被检样品未扩增出494bp条带，则判定为PDCoV核酸阴性。经RT-PCR检测扩增出的目的大小DNA片段，应通过核酸序列测定，并与标准参考序列（参见附录B)比对进行确证。
7.3荧光逆转录聚合酶链式反应（荧光RT-PCR）7.3.1
核酸抽提
同7.2.2。
荧光RT-PCR反应体系
将荧光RT-PCR试剂、引物探针等室温融化，2000r/min离心5s。按样品数量配置反应液，每个反应管包含以下成分：
10XPCRbuffer
25mmol/LMgClz
2.5 mmol/L dNTPs
10μmol/L上下游引物
10μmol/L探针
5U/μLDNA聚合酶
5U/μL逆转录酶
40U/μLRNA酶抑制剂
DEPC水
充分混合均匀，向每个反应管中各分装12μL，最后加人总RNA8μL。体积
每个反应体系设置两个平行。可采用同等效果的商业化一步法荧光RT-PCR预混液代替。荧光RT-PCR反应条件
第一阶段，反转录55℃/30min；第二阶段，95℃/10min；
第三阶段，95℃/15s60℃/45s，40个循环，在第三阶段每个循环的退火延伸时收集荧光。试验检测结束后，根据收集的荧光曲线和Ct值判定结果。4
7.3.4结果判定
7.3.4.1结果分析条件设定
SN/T5124—2019
直接读取检测结果。阈值设定原则根据仪器噪声情况进行调整，以阅值线刚好超过正常阴性样品扩增曲线的最高点为准。
质控标准
阴性对照无Ct值并且无扩增曲线，阳性对照的Ct值应<30.0，并出现典型的扩增曲线。否则，此次实验视为无效。
7.3.4.3结果描述及判定
阴性：无Ct值并且无扩增曲线，表示样品为PDCoV核酸阴性阳性：Ct值≤30.且出现典型的扩增曲线，表示样品为PDCoV核酸阳性可疑：Ct值>30的样本建议重做。重做结果无Ct值者为阴性，否则为阳性。5
SN/T5124—2019
0.o1mol/LPBS
NazHPO·12H,O
附录A
（规范性附录）
试剂配置
将上述成分依次溶解，去离子水定容至终体积为1000mL，调pH至7.2,121℃高压灭菌20min，室温保存。
附录B
（资料性附录）
RT-PCR扩增的基因序列
SN/T5124—2019
ATCCTCCAAGGAGGCTATGCCACGCGTAATCGTGTGATCTATGTTATAAAACTTATTCTGCTTTGGCTGCTCCAACCCTTCACCCTAGTGGTGACCATTTGGACTGCAGTTGACAGATCATCTAAGAAGGACGCAGTTTTCATTGTGTCCATAATTTTTGCCGTACTGACCTTCATATCCTGGGCCAAGTACTGGTATGACTCAATTCGTTTATTAATGAAAACCAGATCTGCATGGGCACTCTCACCTGAGAGTAGACTCCTTGCAGGGATTATGGATCCAATGGGTACATGGAGGTGCATTCCCATCGACCACATGGCTCCAATTCTCACACCAGTCGTTAAGCATGGCAAGCTCAAGCTACATGGGCAAGAGCTGGCCAATGGCATATCAGTTAGAAATCCGCCACAGGATATGGTAATAGTGTCACCAAGTGACACCTTTCACTACACTTTTAAGAAACCTGTGGAATCAAACAACGATCCAGAATTCGC
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