SN/T 5124-2019
基本信息
标准号:
SN/T 5124-2019
中文名称:猪Delta冠状病毒检疫技术规范
标准类别:商检行业标准(SN)
标准状态:现行
出版语种:简体中文
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相关标签:
冠状病毒
检疫
技术规范
标准分类号
关联标准
出版信息
相关单位信息
标准简介
标准号:SN/T 5124-2019
标准名称:猪Delta冠状病毒检疫技术规范
英文名称:Quarantine protocol for porcine deltacoronavirus
标准格式:PDF
发布时间:2019-09-03
实施时间:2020-03-01
标准大小:4537K
标准介绍:本标准规定了猪Dela冠状病毒分离、RT-PCR和荧光 RT-PCR诊断技术。本标准适用于猪 Delta冠状病毒感染的临床诊断和实验室检测。2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅所注日期的版本适用于本
文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法
3缩略语
下列缩略语适用于本文件:
Ct值每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数
dNTPs脱氧核糖核苷酸
LC-PK细胞猪肾小管上皮细胞
PDCoV Porcine deltacoronavirus猪 Delta冠状病毒
RT-PCR逆转录聚合酶链反应
标准内容
ICS11.220
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 5124—2019
猪Delta冠状病毒检疫技术规范
Quarantineprotocol for porcine deltacoronavirus2019-09-03发布
中华人民共和国海关总署
2020-03-01实施
本标准按照GB/T1.12009给出的规则进行编写本标准由中华人民共和国海关总署提出并归口。SN/T5124—2019
本标准起草单位:中华人民共和国杭州海关、中华人民共和国天津海关、中国检验检疫科学研究院浙江大学、中华人民共和国昆明海关、中华人民共和国上海海关、本标准主要起草人:帅江冰、何永强、陈小金、莫虹斐、曾若雪、张晓峰、李肖梁、董志珍、张永宁、张舟、花群义、张强、李健
1范围
猪Delta冠状病毒检疫技术规范
本标准规定了猪Delta冠状病毒分离、RT-PCR和荧光RT-PCR诊断技术。本标准适用于猪Delta冠状病毒感染的临床诊断和实验室检测。规范性引用文件
SN/T 5124—2019
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3
缩略语
下列缩略语适用于本文件:
Ct值每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数dNTPs脱氧核糖核苷酸
LLC-PK细胞猪肾小管上皮细胞
PDCoVPorcinedeltacoronavirus猪Delta冠状病毒RT-PCR逆转录-聚合酶链反应
4仪器设备
4.1二氧化碳培养箱
4.2倒置显微镜
4.3PCR仪
4.4荧光定量PCR仪
台式冷冻离心机免费标准下载网bzxz
生物安全柜
分析天平
微量可调移液器(10μL100μL、1000μL)及配套带滤芯吸头等。5
试剂和材料
5.1水:本标准所用水应符合GB/T6682中三级水的规格5.2DMEM/F12培养基
5.3氯仿
5.4Trizol
5.5逆转录酶
SN/T5124—2019
5.6DNA聚合酶
5.7RNA酶抑制剂
5.8RT-PCR用引物.序列如下:
上游引物:5-ATCCTCCAAGGAGGCTATGC-3”下游引物:5-GCGAATTCTGGATCGTTGTT-35.9荧光RT-PCR用引物和探针,序列如下:上游引物:5-CGACCACATGGCTCCAATTC-3”下游引物:5-CAGCTCTTGCCCATGTAGCTT-3探针:5-FAM-CACACCAGTCGTTAAGCATGGCAAGC-TAMRA-36概述
PDCoV为单股正链、含囊膜的RNA病毒,基因组约为25kb.包含5’和3°非编码区及7个开放性阅读框,分别编码多聚酶蛋白(polymeraseprotein)la/1b、纤突(spike,S)蛋白、小膜(Envelope,E)蛋白、膜(Membrane,M)蛋白、非结构蛋白6(nonstructuralprotein6,NS6)、核衣壳(Nucleocapsid,N)蛋白及非结构蛋白7(nonstructuralprotein7,NS7)。PDCoV引发的疾病以呕吐、水样腹泻、脱水和食欲下降为基本特征,各年龄段猪群均易感,新生仔猪感染率和发病率较高,感染后死工率为30%~40%。病理学特征主要表现为小肠扩张,肠壁变薄、透明,内充满黄色液体,肠系膜充血,肠系膜淋巴结水肿,小肠绒毛缩短。组织病理学变化可见干二指肠、空肠、回肠绒毛严重萎缩甚至脱落,上皮细胞坏死或空泡化。7实验室诊断
7.1病毒分离
7.1.1样品处理
粪便或肠内容物用含10000IU/mL青霉素、10000ug/mL链霉素和25g/mL两性霉素B的0.01mol/LPBS(参加附录A)1:10稀释(w/v),充分震荡混勺,12000转/分钟离心20min,取上清以0.22um过滤器过滤除菌。
十二指肠、空肠、回肠等组织样品刮取肠绒毛放人含三抗的0.01mol/LPBS(pH7.2)中,冻融三次后,12000转/分钟离心20min,取上清以0.22μm过滤器过滤除菌。7.1.2病毒的细胞分离
7.1.2.1将长势良好的LLC-PK细胞分装,加入含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基,37℃、5%CO,培养。
7.1.2.2细胞生长至80%融合度时,弃去旧培养基,以不含血清的DMEM/F12清洗两遍。7.1.2.3加人1mL过滤除菌后的样品上清液,同时加人含10000IU/mL青霉素、10000μg/mL链霉素和25μg/mL两性霉素B的DMEM/F12培养基以及3μg/ml的胰酶,37C.5%COz培养。7.1.2.4每天观察接种细胞是否出现细胞病变,并记录结果,连续观察3天。7.1.2.5若空白对照细胞正常,阳性对照组细胞产生细胞病变,同时接种样品的细胞也产生细胞病变(细胞圆缩、聚集、脱落),收集病变细胞,用于核酸抽提和PCR鉴定。7.1.2.6若接种样品的细胞未出现细胞病变,则收集细胞,反复冻融,10000rpm/min离心10min,取上清接种新鲜LLC-PK细胞单层,继续培养3天后收集细胞,用于核酸抽提和PCR鉴定。2
7.2逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)7.2.1样品处理
接种细胞经一80℃/37℃反复冻融,12000rpm,离心20min,取上清。SN/T 5124—2019
将灭菌的棉拭子插入肛门或者粪便中轻轻左右搅动,放入盛有1mL灭菌0.01mol/LPBS中,振荡混匀,取上清用于核酸提取或一20℃备用。样品避免反复冻融。7.2.2核酸抽提
7.2.2.1取细胞上清或粪拭子上清250μL至无RNA酶的1.5mL离心管,加入600uLTrizol溶液,剧烈震荡混匀后,室温放置5min。7.2.2.2加200μL氯仿,盖紧盖子,剧烈摇动15s,室温放置3min后,4℃,12000r/min离心15min7.2.2.3
吸取上清至新的无RNA酶离心管,加入500uL预冷的异内醇,上下翻转混匀,室温放置10 min。
7.2.2.44℃、12000r/min离心15min。缓慢弃上清,将离心管倒置于吸水纸上,将液体去除。7.2.2.5加人1000μL预冷的75%乙醇缓慢倒转洗涤沉淀。7.2.2.64℃、12000r/min离心15min,弃上清,将离心管倒置于吸水纸上,室温干燥沉淀5min~10min。
7.2.2.7加入20μLDEPC水,4000r/min离心5s,室温溶解10min。立即使用或一70℃保存备用,实验过程中设置阴性对照和DEPC水空白对照。可采用同等效果的商业化RNA抽提试剂盒代替以上方法。
7.2.3RT-PCR反应体系
将RT-PCR试剂、引物探针等室温融化,2000r/min离心5S。按样品数量配置反应液,每个反应管包含以下成分:
10XPCRbuffer
25mmol/LMgClz
2.5mmol/L dNTPs
10μmol/L上下游引物
5U/μLDNA聚合酶
5U/μL逆转录酶
40U/uLRNA酶抑制剂
DEPC水
25 μL
充分混匀,向每个反应管中各分装17μL,最后加入总RNA8μL。每个反应体系设置两个平行。可采用同等效果的商业化一步法预混液代替。7.2.4RT-PCR反应条件
第一阶段,反转录55℃/30min;第二阶段.预变性95℃/10min;
第三阶段,95℃变性15s,55℃退火30s72℃延伸60s,共35个循环;3
SN/T5124—2019
第四阶段,72℃再延伸7min.4℃保存7.2.5
结果判定
质控标准
阳性对照扩增出大小为494bp的特异性条带,阴性对照和空白对照无494bp条带。若阳性对照、阴性对照或空百对照不成立,则需要重新试验。7.2.5.2结果描述及判定
若被检样品扩增出大小为494bp的特异性条带,则判定为PDCoV核酸阳性。若被检样品未扩增出494bp条带,则判定为PDCoV核酸阴性。经RT-PCR检测扩增出的目的大小DNA片段,应通过核酸序列测定,并与标准参考序列(参见附录B)比对进行确证。
7.3荧光逆转录聚合酶链式反应(荧光RT-PCR)7.3.1
核酸抽提
同7.2.2。
荧光RT-PCR反应体系
将荧光RT-PCR试剂、引物探针等室温融化,2000r/min离心5s。按样品数量配置反应液,每个反应管包含以下成分:
10XPCRbuffer
25mmol/LMgClz
2.5 mmol/L dNTPs
10μmol/L上下游引物
10μmol/L探针
5U/μLDNA聚合酶
5U/μL逆转录酶
40U/μLRNA酶抑制剂
DEPC水
充分混合均匀,向每个反应管中各分装12μL,最后加人总RNA8μL。体积
每个反应体系设置两个平行。可采用同等效果的商业化一步法荧光RT-PCR预混液代替。荧光RT-PCR反应条件
第一阶段,反转录55℃/30min;第二阶段,95℃/10min;
第三阶段,95℃/15s60℃/45s,40个循环,在第三阶段每个循环的退火延伸时收集荧光。试验检测结束后,根据收集的荧光曲线和Ct值判定结果。4
7.3.4结果判定
7.3.4.1结果分析条件设定
SN/T5124—2019
直接读取检测结果。阈值设定原则根据仪器噪声情况进行调整,以阅值线刚好超过正常阴性样品扩增曲线的最高点为准。
质控标准
阴性对照无Ct值并且无扩增曲线,阳性对照的Ct值应<30.0,并出现典型的扩增曲线。否则,此次实验视为无效。
7.3.4.3结果描述及判定
阴性:无Ct值并且无扩增曲线,表示样品为PDCoV核酸阴性阳性:Ct值≤30.且出现典型的扩增曲线,表示样品为PDCoV核酸阳性可疑:Ct值>30的样本建议重做。重做结果无Ct值者为阴性,否则为阳性。5
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0.o1mol/LPBS
NazHPO·12H,O
附录A
(规范性附录)
试剂配置
将上述成分依次溶解,去离子水定容至终体积为1000mL,调pH至7.2,121℃高压灭菌20min,室温保存。
附录B
(资料性附录)
RT-PCR扩增的基因序列
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ATCCTCCAAGGAGGCTATGCCACGCGTAATCGTGTGATCTATGTTATAAAACTTATTCTGCTTTGGCTGCTCCAACCCTTCACCCTAGTGGTGACCATTTGGACTGCAGTTGACAGATCATCTAAGAAGGACGCAGTTTTCATTGTGTCCATAATTTTTGCCGTACTGACCTTCATATCCTGGGCCAAGTACTGGTATGACTCAATTCGTTTATTAATGAAAACCAGATCTGCATGGGCACTCTCACCTGAGAGTAGACTCCTTGCAGGGATTATGGATCCAATGGGTACATGGAGGTGCATTCCCATCGACCACATGGCTCCAATTCTCACACCAGTCGTTAAGCATGGCAAGCTCAAGCTACATGGGCAAGAGCTGGCCAATGGCATATCAGTTAGAAATCCGCCACAGGATATGGTAATAGTGTCACCAAGTGACACCTTTCACTACACTTTTAAGAAACCTGTGGAATCAAACAACGATCCAGAATTCGC
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