标准号：SN/T 5129-2019
标准名称：苹果属上冬生疫霉菌、丁香疫霉菌和栗黑水疫霉菌的多重PCR筛查方法
英文名称：Multiplex PCR screening method of Phyto phthora syringae( Berk. )Kleb.
Phytophthora hibernalis Carne Phytophthora cambivora( Petri) Buisman on the malus
标准格式：PDF
发布时间：2019-09-03
实施时间：2020-03-01
标准大小：4629K
标准介绍：本标准规定了苹果属植物上冬生疫霉菌、丁香疫霉菌和栗黑水疫霉菌的分子生物学检疫鉴定方法。本标准适用于苹果属植物上冬生疫霉菌、丁香疫霉菌和栗黑水疫霉菌的检疫鉴定2规范性引用文件
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SN/T2617冬生疫霉病菌检疫鉴定方法
SN/T2756丁香疫霉菌检疫鉴定方法
SN/T2759栗黑水疫霉病菌检疫鉴定方法

ICS100.99
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T5129—2019
苹果属上冬生疫霉菌、丁香疫霉菌和栗黑水疫霉菌的多重PCR筛查方法Multiplex PCR screening method of Phytophthora syringae(Berk.)Kleb.Phytophthora hibernalis Carne& Phytophthora cambivora(Petri)Buisman ontheMalus
2019-09-03发布
中华人民共和国海关总署发布
2020-03-01实施
本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草SN/T5129—2019
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准由中华人民共和国海关总署提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国天津海关、中国合格评定国家认可中心、中国检验检疫科学研究院。
本标准起草人：姜一、张莹、苏志明、刘勇、黄国明、吴品珊、罗加风、魏亚东、廖芳。1范围
苹果属上冬生疫霉菌、丁香疫霉菌和栗黑水疫霉菌的多重PCR筛查方法SN/T5129—2019
本标准规定了苹果属植物上冬生疫霉菌、丁香疫霉菌和栗黑水疫霉菌的分子生物学检疫鉴定方法本标准适用于苹果属植物上冬生疫霉菌、丁香疫霉菌和栗黑水疫霉菌的检疫鉴定。2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单)适用于本文件。SN/T2617冬生疫霉病菌检疫鉴定方法SN/T2756丁香疫霉菌检疫鉴定方法SN/T2759栗黑水疫霉病菌检疫鉴定方法3病菌基本信息
中文名：丁香疫霉菌
学名：Phytophthorasyringae（Berk.)Kleb.1909异名：Phytophthoracactorumsubvar.syringae（Berk.）SarejNozemiasyringae（Berk.)Pethybr英文名：twigblightoflilac，fruitrot中文名：冬生疫霉菌
学名：Phytophthora hibernalisCarne英文名：Citrusfruitbrownrot
中文名：栗黑水疫霉菌
学名：Phytophthora cambivora(Petri)Buisman，1927异名：BlepharosporacambivoraPetri（1917）英文名：Citrusleafblight
分类地位：藻菌界（Chromista），卵菌门（Oomycota），腐霉目（Pythiales），腐霉科（Pythiaceae），疫霉属（Phytophthora）。
三种疫霉可侵染苹果属植物的根、茎、叶和果实，丁香疫霉菌可引起苹果属植物的果腐和颈腐，冬生疫霉菌可引起苹果属植物的果实褐腐、枝枯和叶枯，栗黑水疫霉可引起苹果属植物的根茎腐烂。病菌可随进境种苗及果实远距离传播。4方法原理
依据丁香疫霉菌、冬生疫霉菌和栗黑水疫霉菌的菌落形态学特征及两轮PCR检测结果进行鉴定。1
SN/T5129—2019
仪器及用具
5.1仪器
天平（感量0.001g）、生物安全柜或超净台、高速离心机、往复式振荡器、涡旋振荡器、高压灭菌锅PCR仪、电泳仪、凝胶成像仪、可调微量加样器、刻度离心管（10mL或20mL）等。5.2用具
烧杯、三角瓶、镊子、载玻片、盖玻片、量筒、酒精灯、吸管、Parafilm膜或铝箔纸、Eppendorf管(1.5mL）、接种针、PCR管等。
主要试剂及培养基
6.1主要试剂
匹马霉素（Pimaricin）、氨芋青霉素（Ampicillin）、利福平（Rifampicin）、五氯硝基苯（Pentachloronitrobenzene）、制霉菌素（Nystatin）、恶霉灵（Hymexazo）、CaCO，、琼脂糖、MgCl，、CTAB（十六烷基三甲基漠溴化铵）、无水乙醇（Ethanol）、氯仿（Chloroform）异丙醇（Isopropanol）、异戊醇（Isoamylalcohol）、蛋白酶K、TAE、琼脂以及PCR试剂氯化钾（KCI）、氯化镁（MgCl.）、4种脱氧核糖核酸（dNTPs）、rTaqDNA聚合酶、引物、阳性质粒、溴化乙锭等。6.2培养基
PDA培养基、V8培养基，配制方法见附录A。7检疫鉴定方法
7.1症状检查
仔细检查寄主植物的根、茎、叶、果实等部位，对有枯萎、果腐、根腐、茎腐等症状的植物取样送实验室做进一步检验。
7.2寄主组织分离培养
可疑症状的根、茎、叶、果实用流水冲洗表面约15min，取根、茎、叶、果实果皮的病健交界处，剪成5mmX5mm小块，75%酒精消毒30s.无菌水冲洗3次，吸干水分，置于V8或者PDA培养基上分离培养，在黑暗条件下培养4d，对可疑菌落转接到V8或者PDA培养基上，相关温度及过程参见SN/T2756、SN/T2617、SN/T2759。7.3DNA提取
收集分离到的病菌菌丝，采用CTAB法提取核酸，具体方法详见附录B。7.4多重PCR检测
三种检疫性疫霉的多重PCR检测方法详见附录B2
8鉴定特征
8.1菌落特征
SN/T5129—2019
丁香疫霉菌在V8培养基和PDA培养基上生长较为缓慢。在V8培养基上菌落稀疏，呈放射状、星状或菊花花瓣状，菌落的花瓣区域较尖、窄，在PDA上菌落边缘约皇花瓣状，乳白色，菌丝体浓密，菌落中央区域皱孔状，参见SN/T2756。冬生疫霉菌在V8培养基上生长速度较慢（4mm/d～8mm/d），菌落白色，平贴至中度的蓬松，呈玫瑰花瓣状，花瓣状区域较宽且圆，颜色呈淡桔黄色，参见SN/T2617。栗黑水疫霉菌在PDA培养基上形成棉絮状气生菌丝，无厚垣孢子，菌丝体为球状、链状或串状，无膨大，参见SN/T2759。
8.2多重分子检测
第一轮PCR检测，阳性对照应产生约880bp的片段，阴性对照无带。如果样品在约880bp处无条带，不需要继续检测；若样品约880bp处有条带，则进行第二轮检测，丁香疫霉菌的特异条带为约680bp，冬生疫霉菌的特异条带为约310bp，栗黑水疫霉菌的特异条带为约270bp。9结果判定
病菌的培养性状和形态特征与8.1的描述一致，且多重PCR检测结果与8.2相符，可判定为检出了香疫霉菌或者冬生疫霉菌或者栗黑水疫霉菌。10样品和档案保存
10.1样品保存与处理
样品经登记和经手人签字后妥善保存。对检出丁香疫霉菌、冬生疫霉菌及栗黑水疫霉菌的样品应保存于10℃～15℃下，至少保存6个月以备复核。该类样品保存期满后须经高压灭菌后方可处理。10.2菌株保存与处理
从检测样品中分离并鉴定为丁香疫霉菌或冬生疫霉菌或栗黑水疫霉的菌株，应要善保存。将菌株接种于PDA培养基斜面上，15℃～20℃培养5d,10℃15℃黑暗条件下保存，定期（60d)转接防止病菌死亡，至少保存6个月。保存期满后高压灭菌灭活处理。10.3结果记录与资料保存
完整的实验记录包括：样品的来源、种类、时间，实验的时间、地点、方法和结果等，并要有实验人员和审核人员签字。
SN/T5129—2019
A.1V8培养基
附录A
（规范性附录）
培养基免费标准下载网bzxz
V8蔬菜汁100mL，加人碳酸钙2.5g.琼脂15g~20g，蒸馏水900mL，灭菌20min。PDA培养基
称取200g马铃薯，洗净去皮切碎，加水1000mL煮沸30min，纱布过滤，再加葡萄糖20g和琼脂17g～20g·充分溶解后趁热纱布过滤，121℃灭菌20minB.1DNA提取方法
附录B
（规范性附录）
基因组DNA的提取及多重PCR扩增体系SN/T5129—2019
取疑似植物发病组织1g，于液氮中研磨成粉状，转人预冷的1.5mL离心管中待用。样品为真菌时，收集菌丝放人1.5mL浸在液氮的离心管中，用塑料杆碾碎待用。离心管加人500uL～800uLCTAB提取缓冲液（其中含0.1g蛋白酶K），混匀65℃水浴1h，其间不时摇动；13000r/min离心10min，小心吸取上清液，加入等体积的苯酚/氯仿/异戊醇（25：24：1），轻缓颠倒离心管混匀，室温下，12000r/min离心10min；将上清液转人另一离心管中，加入等体积的氯仿/异戊醇（24：1），颠倒离心管混匀，室温下，12000r/min离心10min；将上清液转人新的离心管中，加入70%体积的异丙醇，混勺，一80℃下放置1h3500r/min~4000r/min离心5min～10min，去上清液，70%乙醇漂洗，沉淀吹干；风干后加人30uL～50uL的TE缓冲液溶解DNA，一20℃保存备用。菌丝DNA提取也可选用相关DNA提取试剂盒，B.2多重PCR分子检测
多重PCR的引物序列及其参数
Primer
序列5'-3°
Sequence5'-3\
CGCGGTAATTCCAGCTCCAATAAGA
ACATCTAAGGGCATCACAGACC
AGGAGGAAGGCGAGAAGGCC
GTAGTAGATGCCGGGCTGCG
CTTTGCTCGAAAAGCATAATGGAA
CCACTCTACTTCACACAACATCCT
CAAGCTCCAGATTGTGCGTG
CGAATCAAAGCGGTCCAACC
长度/nt
Length
预期产物大小/bp
Expected size
利用通用引物18SUF/18SUR先对样品基因组DNA进行是否是疫霉的判定，若判定为是，再用三对特异引物PHSF/PHSR、PSSF/PSSR和PCSF/PCSR扩增菌丝基因组DNA，进行下一步判定。建立的扩增体系分别为：
第一轮PCR扩增体系20μL：10×Buffer2.0μL（含终浓度为1.5mmol/L的MgCl,）；2.5mmol/LdNTPs为1.0μL：5U/μLTagDNA聚合酶0.2μL：10μmol/L引物18SUF/18SUR为0.6μL/0.6μL；DNA模板1.0uL，加双蒸水至20μL.以丁香疫霉通用引物18SUF/18SUR扩增片段克隆质粒为阳性对照，以双蒸水为模板作为阴性对照。反应程序：94℃预变性4min；94℃变性30s，58℃复性20s，72℃延伸35S.35个循环；72℃延伸5
SN/T5129—2019
7min，2%琼脂糖凝胶电泳，EB染色及成像观察目的条带第二轮PCR扩增体系20μL：10×Buffer2.0μL（含终浓度为1.5mmol/L的MgCl）；2.5mmol/LdNTPs为2.0μL；5U/μLTagDNA聚合酶0.4μL；10μmol/L引物PHSF/PHSR、PCSF/PCSR和PSSF/PSSR依次为0.6μL/0.6μL、0.8μL/0.8μL、1.0μL/1.0μL：DNA模板1.0μL.加双蒸水至20uL，以丁香疫霉特异引物PSSF/PSSR扩增片段克隆质粒为阳性对照，以双蒸水为模板作为阴性对照。
反应程序：94℃预变性4min；94℃变性30s，64℃复性20s，72℃延伸35s.35个循环72℃延伸7min，2%琼脂糖凝胶电泳，EB染色及成像观察目的条带。参考文献
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[1]刘跃庭，朱林慧，李培江，等.李属植物检疫性丁香疫霉和栗黑水疫霉的三重PCR分子检测[J.植物保护学报，2015，42（4）：571-577［2I纪容，廖太林，李百胜，栗疫霉黑水病菌[J.植物检疫，2009，23（6）：40-41.[3]朱林慧，郭京泽，廖芳，等检疫性柑橘冬生疫霉和丁香疫霉的三重PCR同步检测[J.西南大学学报：自然科学版，2015，5：1-8.4张海峰，任众，刘翔，等.冬生疫霉（Phytophthorahibernalis）的快速分子检测J.植物病理学报，2008，38（3）：231-237）[5罗加凤，刘跃庭，廖芳，等进境美国加州脐橙中丁香疫霉Phytophthorasyringae的截获LJ.菌物学报，2012，31（1）：24-30.7
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